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41果胶酶在果汁生产中的作用
课题：
4-1果胶酶在果汁生产中的作用课型：
新授课课时:
2课时备课时间：
2014-3-15
主备人：
王文科审核：
生物组学生班级：
学生姓名：
[课程标准]
尝试利用酶活力测定的一般原理和方法。
[考试大纲]
无要求
[教学目标]
1.了解果胶及果胶酶的作用，观察果胶酶对果汁形成的作用。
2.探究利用苹果匀浆制成果汁的最佳条件，检测果胶酶的活性；
3.收集果胶酶其他方面利用的资料。
第一课时
一、[课堂学习]
（一）基础知识——果胶及果胶酶
1.果胶
（1）成分：
（2）作用：
（3）水溶性：
2.果胶酶
（1）组成：
（2）作用：
①分解果胶成，使浑浊的果汁变
②瓦解植物细胞的，使榨取果汁更容易。
（二）基础知识——酶的活性及影响因素
1.酶的活性
（1）概念：
（2）表示方法：
2.影响因素：
（三）实验设计——探究果胶酶的用量
1.实验目的：
2.实验原理：
3.实验变量：
（1）自变量
（2）因变量
因变量的观测指标及原因
（3）无关变量
4.设计思路：
5.步骤：
第1步：
用搅拌器制取苹果泥。
第2步：
分别称取1mg、2mg……7mg新鲜的果胶酶，配制等体积的果胶酶水溶液。
第3步：
填表
试管编号
1
2
3
4
5
6
7
苹果泥（5ml）
+
+
+
+
+
+
+
果胶酶溶液
在适宜且相同的条件下保温10分钟。
记录
体积
澄清度
6.预测实验结果，并画出酶的用量和果汁体积的关系曲线（在浓度和体积相同的条件下）。
7.此实验能测定处最适用量吗？
为什么？
并说出你的方法。
三、[课内巩固训练]
有一瓶酶试剂，由于标签遗失，不能确定其具体成分。
为确定其成分，做了如下6组。
试管蝙号
加入物质
条件
现象
1
2Ml水--k10mL果汁
室温
无明显变化
2
2ml该试剂+10mL果汁
室温
果汁变的澄清
3
2mL该试剂+lOmL果汁
煮沸后降至室温
无明显变化
4
5mL水+小段滤纸条
室温并振荡
无明显变化
5
5mL该试剂+小段滤纸条
室温并振荡
无明显变化
6
5mL该试剂+小段滤纸条
煮沸后降至室温井振荡
无明显变化
⑴根据商标分析，该试剂的成分含有酶、没有酶。
⑵试管2和试管5的实验说明，若要证明该试剂发挥作用需要适宜的温度，需选择试管进行试验。
⑶果汁生产中，要解决的两个主要问题是：
① ；② 。
第二课时
一、[课堂学习]
（一）实验设计——探究温度对果胶酶活性的影响
阅读课本43-44页“资料一”相关内容，完成下列问题：
1．进行实验前要解决的几个问题：
（1）此实验的自变量是__________；根据单一变量原则，你应确保各实验组相同的变量有____________________________________________。
（2）你准备如何测定果胶酶的活性，即你要观测的因变量是____________。
（3）你如何控制实验要求的温度梯度？
2．设计实验
（1）实验原理：
______________________________________________________。
（2）实验步骤：
①搅拌器搅拌制苹果泥，同时配制适宜浓度的果胶酶溶液。
②将与分装于不同试管，在10℃水浴中恒温处理10分钟（如图A）
③将步骤②处理后的和混合，再次在处理10分钟（如图B）。
④将步骤③处理后的混合物，收集滤液，测量（如图C）。
⑤在条件下重复以上实验步骤，并记录果汁量，记录结果在下表：
假如结果如下：
温度
10℃
20℃
30℃
40℃
50℃
60℃
70℃
80℃
出汁量/ml
8
13
15
25
15
12
11
10
根据上述实验，请分析回答下列问题：
（1）果胶酶能破除细胞壁，是因为果胶酶可以促进细胞壁中________的水解。
（2）实验结果表明，当温度为________时果汁量最多，此时果胶酶的活性________。
当温度再升高时，果汁量降低，说明，________
（3）实验步骤②的目的是：
________。
（4）依据以上数据，本实验结果、结论：
_________________________________。
（二）实验设计——探究pH对果胶酶活性的影响
1.进行实验前要解决的几个问题：
（1）你准备如何设置pH梯度，又将如何控制实验要求的pH？
（2）此实验应选一个适宜的_______进行水浴加热，并且要控制好其他的因素。
2.设计实验：
请用表格法来完成实验步骤。
（三）结果分析与评价——绘制出温度和pH对果胶酶活性的影响曲线图。
二、[课内巩固训练]
工业生产果汁时，常常利用果胶酶破除果肉细胞壁以提高出果汁率，为研究温度对果胶酶
活性的影响，某学生设计了如下实验。
①将果胶酶与苹果泥分装于不同试管，在10℃水浴中恒温处理10min（如图A）。
②将步骤①处理后的果胶酶和苹果泥混合，再次在10℃水浴中恒温处理10min（如图B）。
③将步骤②处理后的混合物过滤，收集滤液，测量果汁量（如图C）。
④在不同温度条件下重复以上实验步骤，并记录果汁量，结果如下表：
温度/℃
10
20
30
40
50
60
70
80
果汁量/mL
8
13
15
25
15
12
11
10
根据上述实验，请分析回答下面的问题。
（1）果胶酶能破除细胞壁，是因为果胶酶可以促进细胞壁中果胶的水解，产物是________。
（2）实验结果表明，当温度为______附近时，果汁量最多，此时果胶酶的活性________。
（3）为什么该实验能够通过测定过滤出的苹果汁的体积大小来判断果胶酶活性的高低？
____________________。
（4）果胶酶作用于一定量的某种物质（底物），保持温度、pH在最适值，生成物量与反应时间的关系如图：
在35min后曲线变成水平是因为________。
若增加果胶酶浓度，其他条件不变，请在图中画出生成物量变化的示意曲线。
参考答案：
第一课时：
（1）果胶酶；纤维素酶。
（2）酶具有专一性；2和3。
（3）果肉的出汁率低，耗时长；榨取的果汁浑浊、黏度高，容易发生沉淀。
第二课时：
（1）半乳糖醛酸
（2）40℃ 最高 （3）果胶酶将果胶分解为小分子物质，小分子物质可以通过滤纸，因此苹果汁的体积大小反映了果胶酶催化分解果胶的能力 （4）底物消耗完毕 如图
省海中高二生物（选修）教学学案
课题6血红蛋白的提取和分离
一、达标
（一）知识目标
知识与技能:
1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理
过程与方法:
体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤
情感态度与价值观:
初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神
（二）重点和难点：
重点:
凝胶色谱法的原理和方法
难点:
样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填
二、基础知识
（一）原理
1．凝胶色谱法
凝胶色谱法也称做，是根据分离蛋白质的有效方法。
凝胶实际上是一些由构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质进入凝胶内部的通道，路程，移动速度；而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度。
相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
具体过程：
A．的蛋白质由于作用进入凝胶颗粒内部而被滞留；
的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。
B．
（1）混合物上柱；
（2）洗脱开始，的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；
（3）的蛋白质被滞留；的蛋白质被向下移动。
（4）不同的蛋白质分子完全分开；
（5）的蛋白质行程较短，已从中洗脱出来，的蛋白质还在行进中。
2．缓冲溶液
缓冲溶液的作用是。
缓冲溶液通常由溶解于水中配制而成的。
生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，例如：
血浆的pH是，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。
思考：
说出人体血液中缓冲对？
思考：
在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？
它的目的是什么？
3．电泳
（1）概念：
电泳是指。
（2）原理：
许多重要的生物大分子，如（）等都具有（）
在（）下，这些基团会带上（）。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（）移动。
电泳利用了待分离样品中各种分子（）以及分子本身（）、（）的不同使带电分子产生不同的（），从而实现样品中各种分子的分离。
两种常用的电泳方法是和，在测定蛋白质分子量时通常使用。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于以及等因素。
4．蛋白质的提取和分离
蛋白质的提取和分离一般分为四步：
、、和。
思考：
是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？
为什么？
5．样品处理
血液由和组成，其中红细胞最多。
红细胞具有
的特点。
红细胞中有一种非常重要的蛋白质，其作用是
，血红蛋白有个肽链组成，包括，其中每条肽链环绕一个，磁基团可携带。
血红蛋白因含有呈现红色。
红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是，采集的血样要及时采用分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的，将下层暗红色的倒入烧杯，再加入，缓慢搅拌，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至，表明红细胞已洗涤干净。
血红蛋白的释放在和作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。
分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。
第一层为无色透明的，第2层为白色薄层固体，是，第3层是红色透明液体，这是，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。
将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
透析取1mL的血红蛋白溶液装入中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的中，透析12h。
透析可以去除样品中的杂质，或用于更换样品的。
6．凝胶色谱操作
第一步要制作，第二步要，因为，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。
在装填凝胶柱时，不得有存在。
因为气泡会，降低分离效果。
第三步是。
用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质
A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快
C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快
实验操作
1．样品处理
（1）红细胞的洗涤
①目的：
去除（）
②方法：
（）离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（），将下层（）的红细胞液体倒入（）再加入用（）的（）质量分数为0．9％的氯化钠溶液洗涤
⑤低速离心（低速短时间）
⑥重复4、5步骤（）次，直至上清液中已没有（），表明洗涤干净。
利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。
（2）血红蛋白的释放
加（）到（）体积，再加40％体积的（），置于（）上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白．
（3）分离血红蛋白溶液：
将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min，试管中的溶液分为4层:
第1层（最上层）：
（）甲苯层
第2层（中上层）：
（）的沉淀层，（）色薄层固体
第3层（中下层）：
（）的水溶液层，（）的液体
第4层（最下层）：
其它杂质（）的沉淀层
（4）透析
2．凝胶色谱制作
1）凝胶色谱柱的制作
①取长40厘米，内径1．6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
②底塞的制作：
打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；
b、在橡皮塞顶部切出锅底状的（），在0．5ml的（）头部切下（）长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。
c、剪尼龙网小圆片覆盖在（）上，用（）的尼龙纱将橡皮塞（）包好，插到玻璃管一端。
d、色谱柱下端用移液头部做（），连接一细的（），并用螺旋夹控制尼龙管的（），另一端放入收集（）的收集器内
③顶塞的制作：
插入安装了玻璃管的橡皮塞
④组装：
将上述三者按相应位置组装成一个整体。
⑤安装其他附属结构。
2）凝胶色谱柱填料的处理
（1）凝胶的选择：
（）。
（2）方法：
配置凝胶悬浮液：
计算并称取一定量的凝胶浸泡于（）中充分溶胀后，配成（）。
（3）凝胶色谱柱的装填方法
1固定：
将色谱柱处置固定在支架上
②装填：
将（）一次性的缓慢倒入（）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。
③洗涤平衡
装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在（）高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7．0）充分（）12小时。
3）样品加入与洗脱
（1）加样前：
打开下端出口，使柱内凝胶面上的（）缓慢下降到与
（）平齐，关闭出口
（2）加透析样品
①调整缓冲液面：
与凝胶面平齐
②滴加透析样品：
用（）将1ml（）的样品加到色谱柱的（）
③样品渗入凝胶床：
（）
④洗脱：
打开下端，用磷酸缓冲液洗脱
⑤收集：
待（）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（）收集一试管连续收集
思考：
与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？
这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？
思考：
你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？
血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：
样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（）。
3．SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
判断（）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度
电泳方法步骤
1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备
3）样品处理：
4）把凝胶固定于电泳装置上
5）加样：
按顺序加样，加样量通常为10—25μL。
样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后（即进行凝胶色谱分离之前）的样品和凝胶色谱分离之后的样品
6）电泳 7）剥胶8）染色9）脱色10）观察结果
SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。
三实验结果分析与评价
观察血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。
此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。
如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。
讨论：
如何测定蛋白质的分子量？
使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。
四、突破训练
一．选择题
1．凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法。
A．分子的大小B．相对分子质量的大小
C．带电荷的多少D．溶解度
2．缓冲液的作用是：
在一定范围内，抵制外界的影响来维持（）基本不变。
A．温度B．pHC．渗透压D．氧气浓度
3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。
A．相同B．相反C．相对D．相向
4．哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（）与氧气的运输有关。
A．血红蛋白B．肌红蛋白C．肌动蛋白D．肌球蛋白
5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（）的含量最多。
A．白细胞B．血小板C．红细胞D．淋巴细胞
6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂
A．NaClB．甲苯C．蒸馏水D．柠檬酸钠
7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是
A．无色透明的甲苯层B．脂溶性物质的沉淀层
C．血红蛋白的水溶液D．其他杂质的暗红色沉淀物
8．凝胶色谱法可以有效的分离蛋白质的根据是
A．分子的大小B．相对分子质量的大小
C．带电荷的多少D．溶解度
9．利用凝胶色谱法分离蛋白质，最先洗脱的蛋白质特点是
A．相对分子质量大的B．溶解度高的
C．相对分子质量小的D．所带电荷多的
10．凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是
A．糖类化合物B．脂质C．蛋白质D．核酸
11．相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个（）
12．用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质
A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快
C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快
13．能进入凝胶内部通道的蛋白质是指
A．相对分子质量大的B．吸附性高的
C．相对分子质量小的D．溶解度低的
14．凝胶色谱法中移动得快的是
A．相对分子质量大的B．溶解度高的C．相对分子质量小的D．溶解度低的
15．缓冲液的作用是在一定范围内，抵制外界的影响来维持下列哪一项状态基本不变的
A．温度B．pHC．渗透压D．氧气浓度
16．初步分离血红蛋白的实验中用到的缓冲溶液为
A．H2CO3一NaHCO3缓冲液B．NH4OH—NH4Cl缓冲液
C．CH3COOH—CH3COONa缓冲液D．H3PO4缓冲液
17．蛋白质提取和分离分为哪几步
A．样品处理、凝胶色谱操作、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳
B．样品处理、凝胶色谱操作、纯化C．样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定
D．样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定
18．血红蛋白因含有什么物质而呈红色
A．O2B．COC．CO2D．血红素
19．将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是
A．甲苯B．血红蛋白水溶液
C．脂溶性物质的沉淀层D．其他杂质的沉淀
20．分离血红蛋白溶液时，离心后试管中的溶液分四层，血红蛋白位于
A．一B．二C．三D．四
21．下列操作正确的是
A．分离红细胞时采用低速长时间离心
B．红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可
C．分离血红蛋白溶液是低速短时间离心
D．透析时要用20mmol/L的磷酸缓冲液，透析12h
22．使用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的迁移速度完全取决于
A．电荷的多少B．分子的大小
C．肽链的多少D．分子形状的差异
23．洗涤红细胞的目的是
A．去除血清B．去除杂蛋白C．除去血小板D．除去水
24．洗涤红细胞时，分离所用的方法为
A．低速长时间离心B．低速短时间离心
C．高速长时间离心D．高速短时间离心
25．SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入SDS的作用是
A．增大蛋白质的相对分子质量B．改变蛋白质的形状
C．掩盖不同种蛋白质问的电荷差别D．减少蛋白质的相对分子质量
26．制作凝胶色谱柱时，橡皮塞顶部凹穴内插入的移液管的部位及长度是
A．移液管头部5cmB．移液管尾部5cm
C．移液管头部3cmD．移液管尾部3cm
27．下列有关凝胶色谱法中样品的加入和洗脱的叙述中，正确的是
A．先加入1mL透析后的样品
B．加样前要使缓冲液缓慢下降，全部流出
C．如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功
D．洗脱时可以用缓冲液也可以用清水
28．在下列哪一种条件下生物大分子具有的可解离的基团会带上正电或负电
A．一定温度B．一定pHC．一定压强D．一定容器
29．电泳时带电粒子在电场的作用下，移动所向的电极的方向与其所带电荷是
A．相同B．相反C．相对D．相向
30．装填凝胶色谱柱时，下端的尼龙管应
A．先打开后关闭B．关闭C．先关闭后打开D．打开
31．D亚铁血红素基团可携带
A．一分子COB．一分子NOC．一分子O2或CO2D．一分子NO2
32．人体正常的血红蛋白中应含有Fe2+，若误食亚硝酸盐，则导致血红蛋白中的Fe2+。
转化为Fe3+，产生高价铁血红蛋白而中毒。
服用维生素C可解除亚硝酸盐中毒。
在维生素C参与的反应中
A．亚硝酸盐是还原剂B．维生素C是氧化剂
C．亚硝酸盐被氧化D．维生素C将Fe3+还原为Fe2+
33．加有少量柠檬酸钠（防止血液凝固）的猪血分装于标号①、②、③的试管中，随后依次加入质量分数为0．3％、0．9％和1．5％的氯化钠溶液稀释，30min后离心。
下列叙述中，正确的是
A．①和②试管的上清液中有血红蛋白，沉淀中都有红细胞
B．②和③试管的上清液呈淡黄色，沉淀中均有皱缩的红细胞
C．①和③试管的沉淀中分别有红细胞的碎片和皱缩的红细胞
D．②和③试管的上清液是血清
34．在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是
A．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
B．血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和
C．防止血红蛋白被02氧化
D．让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能
35．在盛有红褐色的Fe（OH）3，胶体的U形管的两个管口，各插一个电极，通直流电后，发现阴极附近的颜色逐渐加深，这说明
A．Fe（OH）3胶体粒子带
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