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在黑色素瘤中异常表达的MHCII类受体

在恶性黑色素瘤中MHCII类分子的异常表达吸引炎性肿瘤特异性CD4+T-Cells并降低CD8+T细胞的抗肿瘤反应

AberrantExpressionofMHCClassIIinMelanomaAttractsInflammatoryTumor-SpecificCD4+T-Cells,WhichDampenCD8+T-cellAntitumorReactivity

摘要

在不存在局部炎症反应情况下，MHC类型Ⅱ分子表达主要限制在造血细胞和胸腺上皮细胞。

然而，某些肿瘤，如黑色素瘤，可能获得MHCII类的异常组成性表达。

在一组初级黑素瘤细胞群体的和相应地扩大了自体肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中，我们将展示在具有高度MHCII类分子特异性及肿瘤有特异性T细胞应答的黑色素瘤细胞中，MHCII是如何表达的。

值得注意的是，我们发现，肿瘤特异性CD4+T细胞应答是由TNF产生支配。

在IFNγ丰富的环境中，TNF降低CD8+T细胞激活类似肿瘤部位的能力。

相反，直接的CD4+T细胞反应对无论是黑色素瘤细胞的增殖或活力无影响。

总之，我们的结果表明了一种被MHCII类分子的异常表达激活的新免疫逃离机制的存在，这种机制靠吸引肿瘤特异性CD4+T细胞引发肿瘤坏死因子主导的局部炎症反应转而去抑制CD8+T细胞的反应。

CancerRes;75（18）;3747–59.2015AACR.

引言

在没有局部的炎症反应的情况下，MHCII型表达主要限于造血细胞和胸腺上皮。

然而，某些类型的实体瘤，包括黑色素瘤亚单位，能从头组成表达MHCII类分子。

另外，通过暴露于细胞因子例如IFNγ的方法，MHCII类可在几种细胞类型（包括肿瘤细胞）中被诱导表达。

在黑色素瘤的MHCII类表达先前已发现与较短和较长的存活都相关联。

的确，MHCII类表达可以使这些肿瘤被的肿瘤抗原特异性CD4+T细胞直接检测。

我们和其他人曾证明这种CD4+T细胞能够产生Th1应答响应于自体肿瘤抗原。

与此相反，最近的研究提出，分别表达在肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞的MHCII类分子与由淋巴细胞激活基因3（LAG3）的接合，可能会触发促存活信号和肿瘤细胞的抗细胞凋亡。

此外，LAG3已被表征为免疫抑制性受体，并且其在T细胞上的接合可以在启动阶段而不是在效应阶段介导肿瘤微环境中的免疫反应的下调。

为了阐明MHCII型表达与CD4+T细胞应答和CD4+T细胞的功能性模式在黑素瘤中的关联，我们进行了扩大的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的一种多功能分析直接识别了一组的38自体配对的晚期患者产生的黑色素瘤细胞系。

我们的研究结果揭示了一个新机制，MHCII表达的黑色素瘤对炎性CD4+T细胞存在吸引，并且通过IFNg-介导及TNF诱导免疫反应局部扩大来反作用CD8+T细胞应答，起到抑制作用。

材料和方法

病人和样品

科学伦理委员会批准了在丹麦的首都地的所有的程序。

根据赫尔辛基宣言在任何操作之前患者签署书面知情同意书。

所有患者都被诊断为组织学确诊的晚期黑色素瘤，AJCCⅣ期（N¼32）或IIIB（N=1，完全切除），IIIC（N¼5，其中两种是完全切除）。

从ESTDAB得到（http:

//www.ebi.ac.uk/ipd/estdab/）原发黑素瘤的WM-115，FM-55-P，FM-55-M1，和FM-55-M2的肿瘤细胞系。

WM-115，WM-75，WM-793，和WM-266-4已被描述过特征。

用于流式细胞术的抗体

用流式细胞仪抗体小组分别为：

-CD4+和CD8+T细胞应答的多方面特性：

CD4QDOT705（LifeTechnologies公司），CD8QDOT605（LifeTechnologies公司），近红外活/死可固定死细胞染色即（LifeTechnologies公司），MIP-1AFITC（eBioscience公司），MIP-1BPerCP-eFluor710（eBioscience公司），CD107aBrilliantViolet421，IFNGPE-Cy7，TNF-APC，IL2BrilliantViolet650（Biolegend公司），IL17ABrilliantViolet510。

-所有其他肿瘤的T细胞共培养实验：

CD4FITC，CD8PerCP，可固定活力染料eFluor450（eBioscience公司），IFNPECy7，TNF-APC，CD107aPE。

-MHCI类特性：

抗HLA-ABC的APC，7-AAD

-MHCII类特性：

抗HLA-DP，DR，DQFITC，7-AAD

TIL和黑色素瘤细胞系的制备

本研究使用的TIL是按照在其他研究中广泛描述的实验过程得到的。

简要地说，在无菌条件下将手术的切除黑色素瘤肿瘤切成1〜2立方毫米小碎块，将浸润淋巴细胞从这些肿瘤中分离开，并在高剂量的IL2（​​6000IU/mL的IL-2;Proleukin诺华）保持最低限度地扩增。

当获得最少50X106肿瘤浸润淋巴细胞时（该产物在通常手术切除之后约14-28天此阶段被命名为“微创培养的TIL”），扩增是由标准的14天快速扩增实验（REP）进一步实现的，在其中的TIL在用200倍过量的同种异体的来自至少三个不同健康供体照射处理过的外周血单核细胞（PBMC）和30纳克/毫升抗CD3抗体（OKT3，Janssen-CilagorMiltenyiBiotec）非特异性地扩增。

在本篇文章中，该TIL被命名为“扩大的TIL（expandedTILs）”或“REP-TIL。

”从一些病人的肿瘤碎片提取“未培养（或鲜）肿瘤浸润淋巴细胞”。

肿瘤碎片用添加了1毫克/毫升胶原酶IV型（Sigma-Aldrich公司）和0.0125毫克/毫升dornase阿尔法（Pulmozyme，罗氏）的消化液消化过夜并立即冷冻保存。

在REP之前，根据制造商的说明利用阳性磁力选择（positivemagneticalselection）分别使用CD8或CD4的磁珠（美天旎）筛选TIL，得到纯CD8+或CD4+T细胞群。

并得到设计实验中所要使用的分好类的T细胞。

随后，分选亚群们分别进行扩增。

只有CD8+或CD4+T细胞的浓度达到95％以上的培养物被用于接下来的实验。

自体黑素瘤细胞系分别TIL从产生，无论是从肿瘤碎片或从运输培养基中悬浮回收细胞团或从组织碎片中，如先前文献所述（16，18）。

通过流式细胞仪分析T细胞应答

如先前文献所述（10，16），进行T细胞反应的测定。

简要地说，TIL解冻，并在RPMI-1640（LifeTechnologies公司）静置3天（用于REP的TIL的多官能表征），2天（最低限度培养的TIL），或过夜（在所有其它情况下）中补充有10％AB人血清（SigmaAldrich），之后洗涤两次，与自体短期培养的黑素瘤细胞系共培养。

肿瘤反应性通过评估先前门控为CD4或CD8T细胞表达的细胞因子（IFNG和TNF）或CD107a的表达量来评估。

为了筛选CD8+和CD4+T对自体肿瘤抗原的细胞反应，对数期生长的自体肿瘤在100IU/毫升IFNG（Imukin，勃林格殷格翰）孵育72小时，然后充分洗涤，并添加到共培养物中。

这样做是为了能最大限度地检测到低频的与MHC表达下调的自体肿瘤与或没有组成型MHCII类表达抗肿瘤反应。

反应被定义为在相对CD8+或CD4+T细胞亚群中，最少有0.5％的应答细胞的存在（表达出下列T细胞功能中的至少一种：

TNF，IFNG，或CD107a），最少50的阳性事件发生和与背景（即，未刺激的样品）相比至少三倍的T细胞的功能阳性细胞的频率。

肿瘤反应性细胞在刺激的样品中的频​​率中减去由未刺激样品的。

0.5％作为判定显著性的底限。

对于MHCII类阻断实验，肿瘤细胞37℃在20毫克/毫升抗HLADR，DP，DQ抗体（克隆TU39，从Biolegend公司）温育30分钟，或在相关同种型对照中温浴。

然后，肿瘤细胞加入和没有附加洗涤的TIL（最终浓度在T细胞刺中激鸡尾酒约为0.5毫克/毫升）到共培养物中。

进行聚合四聚体（肽-MHC多聚体的PE缀合并在内部产生HLA-A2限制性MART-1/Melan-A衍生肽ELAGIGILTV）和细胞内细胞因子染色（CD107a聚乙烯是在此情况下与CD107aFITC替换）染色，评估MART-1特异性T细胞产生功能的反应的频率，如先前文献所述（10）。

在多官能表征实验（7个T细胞功能表征），在共培养基中与自体肿瘤细胞的孵育时间被延长至12个小时，以便能够检测早期和晚期的细胞因子产生。

那里要指出的是用1000UI/毫升的TNF（CellGenix）或100IU/mL的IFNG或两者都处理72小时的癌症细胞。

由于由CD8+T细胞的多个T细胞功能的同时阳性评估的高灵敏度，要同时表达TNF，IFNG，和CD107a中的至少两个功能（双阳性细胞）被选为总CD8肿瘤反应性的量度，以评价肿瘤坏死因子（TNF）对CD8+T细胞识别的影响。

T细胞反应的多官能表征细胞使用BDFACSCantoII流式细胞仪或用5laserBDLSRII。

流式细胞仪配备了FACSDiva的软件6.3（BD）。

ELISPOT和细胞毒性试验

如先前文献所述（16）进行IFNγELISPOT实验。

共有3×104的TIL（分别是3×104CD8+T细胞，3×104CD4+T细胞，或1.5×104CD8+加1.5×104CD4+T细胞，使得肿瘤浸润淋巴细胞的总量是在每一个孔相同）和3×103癌细胞加入各孔。

一式三份孔进行了分析。

结果为在受刺激的孔中IFNγ斑点减去背景。

对CTL介导的细胞毒作用的常规的51Cr释放测定法进行如别处（19）中所述。

癌细胞的分析

MHC表达分析。

半定量测定癌细胞的MHCI类或II类表达，进行标准染色鉴定，新鲜分离的肿瘤细胞与抗HLA-ABC或HLA-DP，DR，DQ抗体或同种型对照，洗涤，在采样前5分钟加入2mL的7-AAD到每个样品中。

用BDFACSCantoII流式细胞仪收集细胞，并考虑到不同的自体荧光的个体细胞系的电压参数，对每个细胞系进行了调整以获得275±15的APC平均荧光强度（MFI）和65±5的FITCMFI。

鉴于几个肿瘤细胞株中的非均匀MHCII类染色，当所研究的抗体样品染色的MFI超过同种型对照至少四倍染色，黑素瘤被确定为MHCII型阳性。

细胞增殖分析如先前所述（10）使用流式细胞术为基础的计数法对细胞增殖进行了评价。

简要地说，在标准胰蛋白酶消化后，实验开始前一天（-1day），将黑色素瘤细胞接种在5至8×104/孔的24孔板中，生长24小时后，加入标准培养基。

然后，培养基换成新鲜标准介质±从对应的患者取得的活化的CD4+T细胞上清液的稀释液，从而使得0.5mL的终浓度/孔。

基线对照孔在0天用50毫升每孔胰蛋白酶溶液进行胰蛋白酶处理，同时使用含0.05毫克/毫升碘化丙啶（PI;Sigma-Aldrich）250毫升标准培养基加入到每个孔中，以排除死细胞。

所得悬浮液在BD的FACSCantoII流式细胞仪配备有BDFACS装载机转盘，标准的速率下计数一定时间（90秒，高流动速率）。

在药物中暴露72小时后，将其他孔用胰蛋白酶处理和之后的基线对照孔在相同的工作条件的细胞进行计数。

用下列公式计算生长抑制：

（T72-T0）/（K72-T0）×100，其中T72是72小时后的细胞数，T0是在零时间对照的细胞数，K72是对照孔（培养基）72小时后的细胞数。

对照值被任意设定为100。

低于0表示元细胞丢失而0到100之间的值表示生长抑制。

要从激活CD4+T细胞得到上清液：

在24孔板中，5×106分类后的从个体患者处得到的CD4+T细胞和用5×105自体IFNγ处理（72小时）的肿瘤细胞孵育，每孔总体积1毫升。

24小时后，收集上清液，用两个离心步骤（1,500rpm/5分钟）将细胞洗出，随后将上清液冷冻保存在-80℃，供以后使用。

RT-PCR技术。

使用根据制造商的TRIzol试剂（Invitrogen）使用说明从样品中提取总RNA。

逆转录反使用TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit（Roche）。

实时PCR（qPCR;对于IDO-1，PDL-1，MLANA，TYR，PMEL，TAPBP，PSMB9，和GAPDH）分析利用了内部设计的引物和LightCyclerNanoinstrument（Roche）。

数据统计分析

执行了达戈斯蒂诺皮尔森正态性检验检查值的正态分布，还有F测试，以检查方差齐性。

视上面的测试结果再作出是否在相关的数据集执行参数或非参数试验的决定。

结果不同群体之间的比较采用双侧测试（或者配对t检验，非配对t检验，Mann-Whitney检验，或魏氏配对测试）。

对生存分析进行对数秩检验。

定性数据与Fisher精确检验进行了比较。

用对数变换的数据来比较组间的差异，用来分析相对定量的能力来表达单个T细胞的功能。

对于qPCR的数据，靶基因的Ct被减去GAPDHCt获得△Ct。

采用配对符号秩和检验来比较IFNγ处理的细胞和培养基，TNF-γ，和TNF+IFNγ-处理细胞之间的差异。

数据显示为相对于IFNγ处理细胞（任意设置值为1）。

在多官能表征实验（7T细胞功能表征），流式细胞术数据用FlowJo9（TreeStarInc.）进行初加工。

使用顺序选通策略直到识别了使用并行布尔门（门仅围绕应答细胞绘制）分类的CD4+和CD8+T细胞细胞。

根据pestle说明，数据导出到pestle1.7并正确格式化。

使用SPICE5.2版本（从http:

//exon.niaid.nih.gov（20）下载）进行分析和介绍结果。

在REPTIL和最低限度的TIL培养的分析中，根据制造商的说明，用Pestle1.7进行未刺激样品减去背景。

与此相反，在未培养的TIL的分析中，背景样品不能被减去，因为肿瘤消化不可避免也含有未培养的肿瘤细胞，这些细胞可以在12小时的培养中刺激TIL（数据未显示）。

至少1％应答细胞在CD4+或CD8+T细胞亚群的阈被接受，这样背景T细胞功能的表达噪声的影响不会超过约30％至40％（从youngTIL或REPTIL样本背景染色中估计）。

虽然有这些阈值，背景事件对总响应的贡献也许会相对高（尤其是对于CD107a+细胞，观察了未刺激的样品中在最低限度培养的TIL和REPTIL阳性细胞的比例）。

分析可能仅在这些情况下进行，因为在未培养的TIL中肿瘤反应性细胞的频率普遍较低（在5个病例样本中分析，11，15，19，24，和25，CD4+T细胞的阳性细胞的平均频率是2.2％±1.6％，CD8+T细胞的阳性细胞的平均频率是5.3％±5.1％）。

在SPICE，REPTIL的分析阈值设定在0.1，而在所有其他的分析中，阈值设定为0.02。

如先前所描述（20），使用Studentt检验和的局部置换检验进行分布的比较。

其他统计分析均采用的GraphPadPrism5（GraphPad软件）。

结果

筛选与自体肿瘤抗原的细胞反应的CD8+和CD4+T细胞

尽管事实上，体内肿瘤的异质性可能不能完全通过短期培养的自体黑素瘤细胞系体现，但如果能认为T细胞应答直接作用于大多，可能不是全部，可能病人的对应肿瘤抗原，TILs/自体肿瘤细胞系的共培养能表现出一个金标准。

为了获得最大的T细胞反应，自体肿瘤用低剂量IFNγ预处理，我们以前已经展示过这会增加TIL识别和反应性。

此后，肿瘤被暴露在自体肿瘤浸润淋巴细胞（10）。

分别在34（89％）和18（53％）患者（图1A;P=0.001）中筛选38种体外扩大TILs/自体肿瘤，且该肿瘤与特定可检测的直接的CD8+和CD4+T细胞反应成堆出现。

细胞反应的强度作为测量表达肿瘤坏死因子，IFNG，或CD107a的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）频率的标准。

细胞反应的强度，CD8+T细胞中18％±18％（平均值，中位数为10％），CD4+T细胞中4.0％±9％（平均值，中位数为0.66％）（图1B，P<0.0001）。

因此，CD8+T细胞应答二者比CD4+T细胞应答更频繁而且强烈地出现。

在6个被分析的样品中，有6个样品肿瘤细胞上MHCII类的的封锁显著降低CD4+T细胞反应（样品取自6个高CD4+T细胞应答患者），证实II类依赖识别（图1C和D）。

高CD4+T细胞应答的存在（14例，确定在整个CD4+T细胞亚群具有至少2％的细胞响应自体肿瘤）不与TIL中的CD4+T细胞的较高频率有关（图1E）。

这可能表明，在体内CD4+T细胞浸润的量值，这很可能反映在扩增TIL细胞中的CD4/CD8T细胞比率，并不与CD4+T细胞应答存在有关，而是与大多数代表非肿瘤相关的免疫细胞的CD4+TIL有关。

值得注意的是，我们以前已经表明，非肿瘤相关病毒特异性CD8+T细胞在肿瘤微环境（21）的高频存在。

另外，高CD4+T细胞反应的患者的CD8+T细胞应答的特性与无或低CD4+T细胞应答的患者（图1F和补充图S1）并没有显著不同。

高CD4+T细胞反应（利用流式细胞仪）的患者的在扩增的TIL上FoxP3的表达的分析显示，在解冻后立即染色TILCD4+和CD8+都相对较高的组分，呈阳性。

不过，在IL2缺失的培养基7天后FoxP3的表达完全丧失（数据未显示）。

因此，我们将此FoxP3的临时表达解释为体外培养条件所引起的高T细胞活化的作用，而不是与经典的调节性T细胞的功能相关联。

图1：

对黑色素瘤CD4+T细胞反应。

A，具有对自体黑色素瘤细胞系CD4+或CD8+TIL细胞应答患者的频率。

B，对自体黑色素瘤细胞系有CD8+或CD4+肿瘤应答的TIL的频率。

肿瘤细胞在与TIL共培养前用100IU/mLIFNγ预处理，在材料和方法说明过。

肿瘤应答细胞表达以下至少一个T细胞的功能：

TNF，IFNγ，或CD107a。

线条显示中值。

C和D，MHCII类对肿瘤靶细胞阻断后CD4+T细胞产生的TNF。

C，在六个类似的结果中一个代表性的样本，CD4+T细胞门控。

线在D中显示中位值。

E，高或无/低CD4+T细胞反应的患者的CD4+T细胞的在所有TIL细胞中的频率。

线显示平均值。

F，在高或无/低CD4+T细胞反应的患者中，肿瘤应答CD8+T细胞的频率。

线显示平均值。

MHCII类黑色素瘤细胞株中的表达

之前的研究表明，在43%黑色素瘤细胞株MHCII类分子组成型表达，而且绝大多数暴露在IFN-γ-a细胞因子的黑色素瘤（>70%）表达II类，而在肿瘤微环境中的IFN-γ-a细胞因子可能是高水平，与CD8+T细胞抗肿瘤反应密切相关

（1）。

38例黑色素瘤中19例（50%）组成表达MHCII类分子（表1和图2A）。

在IFNγ处理后，的MHCII型阳性和阴性肿瘤的MHCII类表达相对倍（数据未显示）和高或无/低CD4+T细胞反应的MHCII类表达相对倍（补充图S2A）是相似。

在19个组成II类阴性肿瘤只有3个IFNγ处理后在不表达MHCII类分子。

为了弄清MHCII类的异常表达是否转移性黑素瘤的特异事件，两种来自原发黑素瘤（WM-115和FM-55-P）细胞系进行MHC表达特征检测。

两种细胞系MHCI类表达都表现出与转移性起源细胞相比类似的模式（组成性表达，IFNγ处理后表达增强）。

WM-115MHCII类组成性阳性，而FM-55-P为阴性，并且暴露于IFNγ之后两个染色后为阳性（WM-115具有增加的表达）（数据未显示）。

对两个附加的细胞系，来自同一患者FM-55的单独的转移灶（FM-55-P代表原发黑素瘤），即FM-55-M1和FM-55-M2，进行了分析。

都显示没有MHCII类组成型表达（但在IFNγ处理后有），正像他们的对应起源。

为了扩展分析和证实我们的结果，对ESTDAB数据库（http:

//www.ebi.ac.uk/ipd/estdab/）进行了检查。

事实上，我们对WM-115和FM-55-P组成型表达的数据匹配ESTDAB的报告。

此外，据报道在两个自于初级黑素瘤（WM-75和WM-793）其它细胞系中有两个组成型表达至少一种II类MHC同种型，正如WM-266-4一样，是一个起源于我们分析的一个患者的一个转移灶的细胞系，这个患者的转移灶在建立初级细胞系（WM-115）的18个月后诊断出。

这些结果证实了以前布洛克尔和他的同事（22）的原位数据，并表明活化MHCII类的组成型表达可能在黑素瘤是非常早期的事件。

CD4+T细胞应答和MHCII类的组成型表达的关联

为了表征MHCII类的组成型肿瘤表达是否与在TIL中CD4+肿瘤特异性T细胞增加的频率相关联，我们在匹配的样本（扩增的TIL）中检查CD4+T细胞应答。

在肿瘤组成表达MHCII类中的TIL中检测到较高的肿瘤特异性CD4+T细胞应答频率（II类组成型阳性：

平均7.5％±11％vs.II类组成阴性1％±1％；P=0.002；高CD4+T细胞反应在12/19II类组成型阳性肿瘤vs.2/19II类组成型阴性的肿瘤；P=0.002；图2B；表1）。

在所有的情况下，肿瘤识别实验在IFNγ预处理后进行，如果肿瘤特异性CD4+T细胞存在，使得最终能检测T细胞反应，因为绝大部分肿瘤高水平表达MHCII分子无论MHCII分子组成性阳性（如上）。

这些数据表明，II型表达是一个早期事件经常随后出现肿瘤抗原特异性CD4+T细胞的浸润。

然而，这不是一个绝对的要求，因为在某些组成型II类表达的黑素瘤中没有强CD4+T细胞应答出现（7/19;37％）表明，这是不够的，并且在没有组成型II类表达的两种黑素瘤高频中存在CD4+T细胞反应（Pt.24和Pt.25;2/19;10.5％）表明这不是强制性的。

 特别令人感兴趣的，我们的队列中两个样品（Pt.30和Pt.35）由来自同一患者（表1）但不同时间。

第一次转移（命名为Pt.30）切除后进行TIL试验（clinicaltrials.govidentifier：

NCT00937625）。

不久之后，病人被注入扩增的TIL，此治疗导致>80％所有先在肿瘤病灶的的复原，但有新的转移病灶出现在第一评价（数据未显示）。

这种病变继续增长，在输液TIL约6个月后，切除（命名为Pt.35）。

如表1中所示，这两种细胞系均组成表达MHCII类，但只有难以治疗的和渐进转移性病灶被肿瘤特异性CD4+T细胞浸润，并且高频出现（表1）。

这是一个有趣的观察轶事，表明肿瘤特异性CD4+T细胞的浸润，可以进行时空动态调节，并且与肿瘤细胞中无明显MHCII类表达变化的疾病进展有关。

图2：

在黑色素瘤细胞MHCI类和II类表达和与CD4+T细胞应答的相关性。

A，在两个具有代表性的患者（组成型II类阳性或MHC组成阴性的黑素瘤）的MHCII类分子（HLADP，DR，DQ）表达在任何一个第二类阳性黑素瘤一个。

虚线，同型控制；灰色实线，组成型表达；黑色实线，预处理IFNγ100IU/mL的72小时后的表达。

B，MHCII类分子的组成性表达肿瘤响应CD4+T细胞的患者的的频率。

线显示中值。

C和D中，高或无/低CD4+T细胞应答的患者黑色素瘤细胞系的相对组