纳米生物复合材料相关实验中所涉及到的实验技术与概念.docx

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纳米生物复合材料相关实验中所涉及到的实验技术与概念

凝胶电泳：

凝胶电泳的原理比较简单。

当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极，这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率。

它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。

也就是说，电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也就越快，反之则较慢。

由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺胶等，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。

已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异，以及所带的净电荷的多少，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。

在生理条件下，核酸分子中糖-磷酸骨架中的磷酸基因呈现出离子状态，从这种意义上讲，DＮＡ和RNA多核苷酸链可叫做多聚阴离子（Polyanions）。

因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。

由于糖-磷酸骨架结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移。

在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型，分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子迁移要快些。

这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。

光热效应：

光热效应指材料受光照射后，光子能量与晶格相互作用，振动加剧，温度升高，由于温度的变化而造成物质的电学特性变化。

利用光热效应的探测器：

热敏电阻、热电偶、热电堆和热释电探测器等。

其中，红色光的热效应最大。

荧光分析法：

利用某些物质被紫外光照射后处于激发态，激发态分子经历一个碰撞及发射的去激发过程所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析的方法。

荧光分析的最大特点是：

分析灵敏度高、选择性强和使用简便。

荧光共振能量转移（FRET）：

荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体Donor）的发射光谱与另一个基团（受体Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时（一般小于100Å），就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。

金纳米粒子的特性:

与块体金不同，金纳米粒子的价带和导带是分开的。

当金的粒子尺寸足够

小时，会产生量子尺寸效应，导致金纳米粒子向绝缘体转化，并能够形成不同

能级间的驻电子波。

若能级间隔超出一定的范围同时发生单电子跃迁，将表现

出特殊的光学和电子学特性。

（1）表面等离子共振特性

表面等离子共振是金纳米粒子最重要的性质之一，在水溶液和玻璃中，金纳米粒子呈现出深红色，便是其发生表面等离子共振的结果。

它的产生是由于金纳米粒子表面导带中电子共振的结果，这种共振与入射光的电磁场有关。

随着金纳米粒子的尺寸和形状发生变化，其表面等离子共振峰位置和形状也不同，因此可以通过吸收峰的位置以及溶液的颜色变化，判断金纳米粒子的产生、粒径大小和表面自组装情况。

（2）荧光特性

金纳米粒子产生荧光的方式主要有两种，一种是将具有荧光性质的分子组装到金纳米粒子表面，该荧光团在激发下发光；另外一种是表面组装的分子吸收能量后通过分子内的能量传递给金纳米粒子，使金纳米粒子产生辐射发光。

研究发现，在金纳米粒子表面组装上不同的分子后，会在金纳米粒子表面发生荧光共振能量转移。

（两种荧光现象的发光主体不同）

（3）电化学特性

由于金属纳米粒子的禁带和导带之间存在带隙，当纳米粒子的粒径足够小时，会产生量子尺寸效应，使金属从导体向绝缘体转换并产生不连续能级。

对于有机单分子层保护的金纳米粒子，表面会存在双电层电容，这相当于一个纳米尺寸的电极，其双电层电容值随着粒子表面烷基链长度减少而逐渐增加。

（4）超分子与分子识别特性

金纳米粒子表面的可控组装为分子识别提供了重要的方法和路径。

金纳米粒子可以与很多基团通过范德华力、氢键、静电吸附、π－π键、抗原抗体等相互作用结合，此时紫外－可见光谱、红外光谱、荧光光谱等谱图中代表该识别体的特征峰会发生变化，进而实现识别、检测、分析的目的。

另外，金纳米粒子与被识别体的官能团结合后也可以诱导超分子结构的形成，使其作为化学和生物分析的传感器，既能识别小分子和离子，又能识别生物大分子。

量子尺寸效应：

量子尺寸效应--是指当粒子尺寸下降到某一数值时，费米能级附近的电子能级由准连续变为离散能级或者能隙变宽的现象。

表面等离子共振：

表面等离子共振技术，英文简写SPR。

应用SPR原理检测生物传感芯片上配位体与分析物之间的相互作用情况，广泛应用于各个领域。

细胞MTT测试：

商品名：

噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

MTT主要有两个用途：

1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；

2．细胞增殖及细胞活性测定。

检测原理：

MTT可以穿过细胞膜进入细胞内与活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶反应生成难溶于水的甲臜结晶，该结晶溶于二甲基亚砜（DMSO）后在490nm处出现吸收。

由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，加入MTT后不会生成甲臜，因此490nm处的吸收值与活细胞数成正比。

根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。

流式细胞术:

流式细胞术（FlowCytometry,FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。

在肿瘤学中的应用:

这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。

首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料（碘化吡啶PI）染色后对细胞的DNA含量进行分析。

也可以对细胞的存活数目进行统计。

微孔、介孔、大孔：

孔径小于2nm的称为微孔；孔径大于50nm的称为大孔；孔径在2到50nm之间的称为介孔（或中孔）。

孔径（nm）

小于2

大于2，小于50

大于50

名称

微孔

介孔（中孔）

大孔

寡核苷酸:

寡核苷酸，是一类只有20个以下碱基的短链核苷酸的总称（包括DNA或RNA内的核苷酸）。

寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接，所以常用来作为探针确定DNA或RNA的结构。

纳米药物载体的优势:

纳米药物载体主要是利用纳米粒子的小尺寸效应和高比表面效应改善人体对药物的吸收和人工控制药物的释放，同时利用纳米药物载体自身的屏蔽作用实现对药物的保护，与传统药物相比，具有十分明显的优势。

纳米药物载体一般具有多孔、中空、多层等结构特性，通过选择载体材料的

种类和配比，或加以修饰连接刺激响应的释放系统，可以控制药物的释放速度与

释放量，极大延长药物的半衰期，同时减少用药次数和用药量，减轻药物的毒副

作用。

甚至可以制成微小的直接包含药物的分子机器，在体内循环过程中制造出

治疗所需的药物，解决许多需长期用药的疾病如高血压、冠心病、糖尿病等。

多肽类、蛋白质类、酶类及某些抗生素类药物口服后易被胃酸或胃肠道消化

酶破坏而失活，只能通过注射给药，极大的限制了其应用，将药物包覆于纳米药

物载体后，可提高这些药物的稳定性，避免药物与胃蛋白酶的接触，提高药物在

胃肠道中的稳定性，此外对易氧化药物和挥发性药物具有很好的稳定作用。

纳米药物载体进入生物体后被机体作为异物，从而被巨噬细胞吞噬达到网状

内皮系统分布集中的肝、脾、肺、骨髓、淋巴等部位，具有天然的网状内皮系统的被动靶向性。

经过连接配体、抗体、酶作用底物等靶向性物质后的纳米药物载

体可获得更精确的主动靶向性，定向作用于靶组织或靶器官或靶细胞释放药物，

在提高靶部位药物浓度的同时，有效减少了药物对正常组织的毒副作用，对具有

良好药理作用但又难以有效达到靶部位或者毒副作用较强的药物（如阿霉素等）特别适合。

纳米药物载体可消除特殊生物屏障对药物作用的限制。

生物体有许多保护机体不受损害的天然生物屏障，如血脑屏障、血眼屏障、细胞膜屏障等，这些屏障

往往阻碍亲水性药物的吸收和利用，纳米颗粒可以改变其膜转运机制，增加药物

对生物膜的通透性，有利于药物透膜吸收进入细胞内,更好地发挥疗效。

如用氰基丙稀酸醋作载体制备的长春花胺纳米粒，口服给药后比水溶液制剂吸收更快、更安全。

此外，纳米药物载体的比表面积较大、连接的功能基团或活性中心多，利于修饰或偶联功能分子，实现疗效跟踪与治疗的同步化。

表面等离子共振效应（SPR）：

表面等离子共振（SPR）是一种光学现象，可被用来实时跟踪在天然状态下生物分子间的相互作用。

这种方法对生物分子无任何损伤，且不需任何标记物。

共聚焦显微镜（CLSM）的应用：

共聚焦显微镜有较高的分辨率，而且能观察到样本随时间的变化。

因此，共聚焦显微技术在生物学研究领域起着不可或缺的作用。

以下为共焦显微技术的几个主要应用方面：

利用激光共聚焦显微镜不仅可以清晰地观察被固定的细胞和组织切片，而且可以对活细胞的内部结构进行实时动态地监测

（1）组织和细胞中荧光标记的分子和结构的检测：

利用激光点扫描成像，形成所谓的“光学切片”，进而可以利用沿纵轴上移动标本进行多个光学切片的叠加形成组织或细胞中荧光标记结构的总体图像，因此可以用于观察切片和一些表面不平的标本，特别是研究具有长突起的神经元时更有使用价值。

同时可以做三维图像重建和标记强度的半定量分析。

（2）定量或半定量测量Ca2+和pH等细胞内离子浓度及变化：

激光扫描共聚焦显微镜可以提供更好的亚细胞结构中钙离子浓度动态变化的图像，这对于研究钙等离子细胞内动力学有意义。

最好与电生理等技术相结合来观察离子变化与电生理学指标的相关性。

（3）荧光光漂白及恢复技术：

利用高能量激光束将细胞内某一部分中选定靶区域的某种荧光淬灭，然后观察邻近相同的荧光标记物重新扩散入该区域的速度和方式，从而分析细胞内蛋白质运输、受体在细胞膜上的流动和大分子组装等细胞生物学过程。

（4）长时程观察细胞迁移和生长：

激光扫描共聚焦显微镜的软件一般均可自动控制地进行定时和定方式的激光扫描，而且由于新一代激光扫描共聚焦显微镜的探测效率的提高，只需要很小的激光能量就可以达到较好的图像质量，从而减小了每次扫描时激光束对细胞的损伤，因此，可以用于数小时的长时程定时扫描，记录细胞迁移和生长等细胞生物学现象。

（5）其他的生物学应用：

用高能量激光束进行细胞损伤和损毁实验，一般要用紫外激光束进行细胞损毁；细胞间通讯研究；光解笼锁活化技术等。

热重分析（TGA）：

热重分析（TGA），是指在程序控制温度下测量待测样品的质量与温度变化关系的一种热分析技术，用来研究材料的热稳定性和组份。

光敏剂：

在光化学反应中，有一类分子，它们只吸收光子并将能量传递给那些不能吸收光子的分子，促其发生化学反应，而本身则不参与化学反应，恢复到原先的状态，这类分子称为光敏剂。

由光敏剂引发的光化学反应称为光敏反应。

通常，人们把有氧分子参与的伴随生物效应的光敏反应称为光动力反应，把可引发光动力反应破坏细胞结构的药物称为光动力药物，即光敏药物。

金纳米粒子（AuNPs）的制备：

粒径为13nm的金纳米粒子根据之前报道的柠檬酸钠还原氯金酸的方法合成。

首先，将实验所用的玻璃器皿用王水（浓HCl/浓HNO3，3:

1）浸泡处理，然后用超纯水冲洗干净，置于烘箱中烘干后备用。

将100mL的质量分数为0.01%的HAuCl4水溶液加热至沸腾，在剧烈搅拌下迅速加入2.0mL质量分数为1%的柠檬酸钠水溶液，溶液开始由淡黄色变为无色，逐渐变为酒红色，在沸腾下反应10分钟，接着停止加热，继续搅拌15分钟，溶液在室温慢慢冷却，制备得到的纳米金溶液用0.45μm的滤膜过滤。

透射电子显微镜（TEM）照片显示金纳米粒子的大小为13±2nm（对100个纳米颗粒采样）。

制备的金纳米粒子置于冰箱4℃保存备用。

金纳米棒的制备及表征:

制备晶种（柠檬酸钠还原氯金酸法）：

5mL浓度为0.2M的CTAB水溶液与浓度为5mL0.5mM的HAuCl4水溶液，在搅拌的条件下，混合均匀。

向上述溶液中加入0.6mL浓度为0.01M的冰度NaBH4溶液，得到棕黄色溶液，搅拌2min，室温25ºC保存。

制备金纳米棒（晶体生长法）：

向5mL的浓度为0.2M的CTAB水溶液中，分别加入不同体积浓度为0.004M的AgNO3溶液（50μL,100μL,150μL,200μL）。

向上述溶液中再加入5mLHAuCl4（1mM），温和搅拌，加入70μL维生素C（0.0788M），溶液由深黄色变为无色。

最后加入12μL的晶种溶液，10-20min逐渐变色。

在透射电子显微镜下观察合成的金纳米棒的形貌与尺寸。

介孔二氧化硅的合成：

介孔二氧化硅材料的合成是基于表面活性剂、在酸性或者是碱性条件下进行

的。

硅源可以是白炭黑、硅酸钠和正硅酸四乙脂（TEOS）。

目前，应用最为广泛的介孔二氧化硅为MCM-41型，在低表面活性剂条件下合成。

在合成过程中，少量十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）用作表面活性剂首先溶水中，加入NaOH调节pH为碱性，之后在353K、搅拌的条件下加入正硅酸四乙脂（TEOS），混合液继续反应2h，便生成白色介孔二氧化硅沉淀。

注意：

a、有序介孔相的形成主要取决于表面活性剂和带负电的正硅酸四乙酯（TEOS）的相互作用；

b、介孔二氧化硅的形貌可以通过控制合成过程中的pH值或者是通过添加调节剂（表面活性剂、抑制剂等）的方法进行调节。

论文中上述方法的具体实验步骤：

首先将CTAB（0.5g，1.37×10-3mol）溶解在240mL去离子水中，然后加入1.5mLNaOH（2M），搅拌10min后将温度调至80C。

向上述溶液中逐滴加入2.5mLTEOS（1.29×10-2mol），混合物持续搅拌2h即生成白色沉淀物，该白色沉淀即为MSN。

一部分白色产物用乙醇和水洗涤若干次后烘干得到洗涤的MSN，另外一部分白色固体在450°C下煅烧10h，完全除去CTAB模板剂，得到煅烧的MSN。

方法二：

在低浓度的CTAB作模板剂的条件下，利用氢氧化钠催化TEOS和不同的有机硅烷发生共缩聚反应。

该方法不需要使用任何有机助溶剂或者在共缩聚的过程中不需要瞬间中和酸性溶液。

通过改变加入的有机硅烷的种类和浓度得到了一系列形状不同的纳米颗粒，如球状、棒状和六边型的管。

中空介孔二氧化硅介绍其及制备：

是指中间部分是空腔，壳层是介孔二氧化硅的纳米材料，该类材料兼具了介孔二氧化硅的孔道规则和中空材料负载量大的优点，因此在药物载体领域得到了广泛的关注。

中空介孔二氧化硅的空腔大小和厚度可调。

其制备方法主要为模板法，包括硬模板法和软模板法。

硬模板法是制备中空介孔二氧化硅中比较直接的方法，该方法可靠，有良好的可控性。

一般地，这种制备方法包括四大主要步骤：

①制备硬模板；②在硬模板上进行功能化修饰或者改性，使其适合进一步包覆；③在硬模板上包覆介孔二氧化硅；④除掉硬模板。

步骤③是最关键的一步，因为这一步涉及介孔模板的自组装和硅烷前驱体的水解。

硬模板有金属纳米颗粒、氧化物纳米颗粒和聚合物等，最常用的是单分散的二氧化硅纳米颗粒和聚苯乙烯乳球（PS）。

缺点：

产率不高，有些除去模板的方法会对纳米材料的稳定性有影响。

软模板法：

软模板法制备中空介孔二氧化硅与硬模板法类似，主要是选择的模板不同。

用作软模板的物质主要有乳化剂液滴（油包水或者水包油）、表面活性剂和超分子胶束、聚合物和聚合物囊泡、气泡等。

注意：

在制备HMSN的过程中，调整适当的pH值是比较关键的，一般控制pH在9-10范围内比较合适。

如果碱性较大，会影响金纳米颗粒的稳定性，引起金纳米颗粒的聚集，不利于包覆的进行；碱性过小，不利于硅烷化试剂的充分水解，因此控制加入的氢氧化钠的量是比较重要的。

在不改变其他反应条件的前提下，TEOS的用量会对介孔二氧化硅壳层的厚度产生影响，纳米金的大小相同时，加入TEOS的量越大，包覆的介孔二氧化硅的厚度越大，因此通过改变TEOS的用量可以调整制备的HMSN的规格。

介孔二氧化硅的功能化修饰：

对介孔二氧化硅进行功能化修饰时根据修饰的顺序不同分为两种：

一种是在制备介孔二氧化硅的过程中加入带有官能团的硅烷化试剂，硅烷前驱体和带有官能团的硅烷化试剂会同时发生水解缩合，此时得到的介孔二氧化硅在骨架和表面都有官能团存在；另一种是制备好介孔二氧化硅之后，再加入带有官能团的硅烷化试剂，此时得到的介孔二氧化硅主要是在外表面存在官能团。

氨基化的介孔二氧化硅（MS-NH2）的制备：

（本论文中的方法）

氨基化的介孔二氧化硅的制备参照传统的合成方法并加以少量修改。

将0.25gCTAB溶解于100mL二次水中，搅拌均匀，再向溶液中加入0.875mLNaOH溶液（2M），将溶液加热至85℃搅拌回流30分钟。

1.25mL正硅酸四乙酯（TEOS）和0.25mL3-丙氨基三乙氧基硅烷（APTS）同时逐滴加入到上述溶液中，继续回流反应2小时，产生白色沉淀。

将沉淀用甲醇离心（10000rpm）洗涤两遍之后，沉淀分散于甲醇和盐酸的混合溶液（甲醇和浓盐酸体积比为9:

160），沸腾回流24小时以除去介孔二氧化硅孔道内的CTAB模版。

最后，将沉淀用甲醇离心（10000rpm）洗涤两遍，置于真空干燥箱中干燥，最终得到干燥的氨基化的介孔二氧化硅固体。

氨基修饰的介孔二氧化硅包覆的金纳米棒（AuNRs@MS-NH2）的制备:

氨基修饰的介孔二氧化硅包覆的金纳米棒的合成依据经典的共沉淀方法并加以略微的修改。

将预先合成的金纳米棒溶液离心洗涤（10000rpm,×2）以除去

多余的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，为一种表面活性剂），沉淀重新分散于100mL二次水溶液中。

取30mL上述金纳米棒溶液，向其中加入0.3mLNaOH溶液（0.1M），搅拌10分钟。

然后，同时向其中加入45μL含20%TEOS（正硅酸乙酯）的甲醇溶液以及15μL含2%APTE（3-氨丙基三乙氧基硅烷，是一种硅烷偶联剂）的甲醇溶液，共加入三次，间隔半小时，不停搅拌。

混合液反应24小时形成氨基化的介孔二氧化硅壳层。

将合成的AuNRs@MS-NH2离心（10000rpm），用甲醇和水洗涤数次以去除介孔二氧化硅孔道中的CTAB分子，最终AuNRs@MS-NH2沉淀分散于6mL二次水中,溶液浓度为0.2mg/mL。

制备中空介孔二氧化硅纳米颗粒（HMSN）：

HMSN是通过将AuNPs@MS的纳米金核腐蚀的方法制备的。

腐蚀金的方法主要有氰化法和非氰化法两大类，其基本原理都是金原子与腐蚀剂形成可溶的络合物离子。

非氰化法中最重要的是硫脲法，与氰化法相比，硫脲法提取金有无毒，浸取速度快等优点。

具体的操作方法是：

1mL硫脲试剂（1M，pH=2.0硫酸）与0.5mL富集之后的AuNPs@MS混合。

30min后，向混合溶液中入50μLH2O2（1M）水溶液，5min内金核即被腐蚀完全。

将溶液离心，弃去上清液，水洗沉淀若干次，烘干。

光漂白：

指在光的照射下荧光物质所激发出来的荧光强度随着时间推移逐步减弱乃至消失的现象。

荧光成像的质量很大程度上依赖于荧光信号强度，提高激发光强度固然可以提高信号强度，但激发光的强度不是可以无限提高的，当激发光的强度超过一定限度时，光吸收就趋于饱和，并不可逆地破坏激发态分子，这就是光漂白现象。

核壳结构纳米材料的类型：

纳米材料由于其独特的性质引起了研究者越来越多的的关注。

核壳结构的组装材料类型非常多，目前主要集中在以下四个方面：

1、染料分子作为主体材料的核壳材料

有机染料分子在生物分子标记与检测中扮演着非常重要的角色，但是它本身

存在着很多不足，比如抗光漂白性差，量子产率低等。

因此，我们通过在外面包

裹壳层来改善它在应用中的一些不足，用二氧化硅包裹有机染料形成荧光杂化的

纳米颗粒就是最常见的方法。

但是核壳结构的形成受很多因素的影响，比如内核

材料的电性，壳材料的电性等，这些都会影响核壳结构的稳定性。

此外，如果外

壳材料与内核材料通过共价键或者其它化学键结合，得到的核壳纳米结构会更加

稳定。

2、金属作为主体材料的核壳材料

以金属银和金为代表的金属纳米材料一直占据纳米技术研究领域的重要位置，由于它们在很多领域的独特应用，比如非线性光学调控、免疫测定标记、拉曼光谱增强，使得它们逐渐成为研究热点。

我们可以通过在它们的表面覆盖壳层来改变它们的性质，也可以通过调控壳或核的化学成分、结构和尺寸来实现对这些纳米材料的光学调控。

到目前为止，人们已将这种材料应用于三阶非线性光学，色素分子荧光的增强，光化学过程的促进等领域。

复合物中金属纳米粒子的表面等离子共振效应使得这类复合材料有很多优良的性能。

金属纳米粒子在入射光的激发下，电子（称为局部表面等离子体）受光电场的驱动将发生集体的振荡，并与特定频率的光发生共振，形成所谓的局部表面等离子体共振，表面等离子体共振将引起有选择性的光子吸收、散射及局部电磁场增强等效应。

我们可以选择消光光谱来进行表征，消光光谱是吸收光谱与散射光谱的总和，消光的极值波长即是局部表面等离子体共振吸收峰的峰位。

该共振峰峰位受粒子的尺寸、周围介质或材料自身的介电特性等因素的强烈影响。