DNA提取实验报告.docx

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DNA提取实验报告

生物学大实验

（二）

实验名称：

质粒扩增、提取和鉴定实验

实验目的通过对智力扩增、提取和鉴定试验的实验原理介绍和实际操作，加深对分子生物学基本技术的理解和掌握。

实验仪器设备：

电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等。

实验原理：

质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，通过对细菌、放线菌和真菌的培养来实现对质粒的扩增。

经过处理的线状dna在外界环境恢复正常的时候不能够复性而质粒dna可以复性，从而可以实现质粒dna和染色体dna的分离。

限制性内切酶能特意地结合于一端被称为限制性酶识别系列的dna系列之内或其附近的特异位点上，并切割dna。

当对提取的质粒dna进行电泳时，同一质粒dna其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。

实验步骤：

一质粒扩增

（1）普通lb固体培养基制备：

制备lb培养基，倒入灭菌瓶中高压灭菌，待完全冷却后，保存备用。

（2）将大肠杆菌接种于lb培养基中，37℃振荡培养过夜（200转/分）

二质粒dna的提取（碱法）

1将菌液倒入1.5ml的微量离心管中，12000rpm离心一分30秒，弃去上清液，以得到较多的细菌沉淀；

2、将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。

3、加入100μl用冰预冷的溶液i，剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。

4、加入200μl现配的溶液ii，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免dna断裂），使混合物混匀，冰浴5～10分钟。

5、加入150μl预冷的溶液iii，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液iii中，冰浴5分钟。

6、取上部水相，移入新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇（也可同时加入1/10倍体积的醋酸钠），震荡混匀，室温放置10分钟沉淀双链dna，然后4℃，12000rpm离心10min。

7、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使离心管底部的液体流尽后，加入预冷的1ml70％乙醇。

8、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使液体流尽，置dna干燥5～10分钟。

9、吸除上清液，将管口倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。

10、将沉淀溶于34υlte缓冲液或灭菌水（ph8.0）中，储于-20℃冰箱中

三dna酶切反应

1、将洁净干燥并经灭菌的eppendorf管（最好0.5ml）编号，用微量移液枪分别加入dna（υl）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2υl，将管内溶液混匀后加入0.5υl酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可以用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。

此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。

使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。

2、混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃水浴锅保温2-3小时，使酶切反应完全。

3、每管加入2υl0.1mol/ledta（ph8.0），混匀，以停止反应，置于冰箱之保存备用。

四dna的琼脂糖凝胶电泳

1、取5×tbe缓冲液100ml加蒸馏水至1000ml，配成0.5×tbe稀释缓冲液，待用。

2、胶液的制备：

称取3g琼脂糖置于1000ml锥形瓶中，加入300ml0.5×tbe稀释缓冲液，加入微波炉里加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，此为1%琼脂糖凝胶液。

加热过程中要不时摇动，使其附于瓶盖上的琼脂糖颗粒进入溶液。

加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发。

3、胶版的制备：

想冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭（eb）溶液使其终浓度为0.5υlg/ml。

倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则溶液出现气泡，待胶完全凝固后，拔出梳子注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5υ×tbe稀释缓冲液至页面恰好没过胶板上表面

4、加样：

取20υl的酶解液与2υl10×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中，每加完一个样品要更换tip头以防止互相污染，注意上样时要小心操做，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿

5、电泳：

加完样后合上电泳槽盖，立即接通电源，控制电压保持在60-80v，电流在40ma以上，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿2cm时停止电泳

6、观察和拍照

五实验结果

六实验结论

通过本次试验加深了对分子生物学以及基因工程的深入了解，右上第三第四根亮柱是我的结果。

结果显示，第三条中酶切效果良好，rna被降解的很完全，第四根没有被酶切，质粒dna跟rna同时存在，出现了两条亮带，质粒dna跟rna分离效果较好。

本实验需要细致认真的完成，所以特别在凝胶电泳中要十分注意以下事项：

（1）取出梳子之前，一定要耐心等待琼脂糖凝胶的凝固，拔梳子是一定要手稳，而且要

垂直拔出；

（2）点样要细心，枪头不要碰到凝胶，以免点样枪刺破凝胶；

（3）电泳时，电极一定要连接正确

（4）染色剂溴化乙锭是强诱变剂，有致癌性和强毒性，使用时一定要带一次性手套，使

用后废液不可不可随意丢弃。

生物科学071班姓名：

刘欢学号：

20073305篇二：

dna的提取和电泳实验报告

基因组dna的提取和电泳（实验五）实验报告

一、实验目的

了解dna提取的方法，以及琼脂糖凝胶电泳分析dna技术。

二、器材和试剂

1.器材

水平琼脂糖电泳仪，离心机，水浴锅，研钵，离心管、移液枪、水稻幼苗等

2.试剂

1.1mol/ltris.cl（ph8.0）的配制：

称取12.11g的tris，置于80ml的ddh20,加入浓盐酸

（约4.2ml）,调节ph值至8.0，定容至100ml。

2.0.5mol/ledta（ph8.0）的配制：

18.61gna2edta·2h2o，加入80ml的ddh2o,用naoh颗粒调ph值至8.0（约需2g），定容至100ml。

3.提取缓冲液的配制：

100mmol/ltris.cl（ph8.0）,20mmol/ledta,500mmol/lnacl,

1.5%sds

4.80/4/16氯仿：

异戊醇：

乙醇

5.6?

loadingbuffer：

0.15％溴酚蓝，0.15％二甲苯青ff，5mmol/ledta，50％甘油

三、实验步骤

1.在15ml的离心管中加入5ml的提取缓冲液，60℃水浴预热。

2.植物叶1-2g，剪碎，在钵体中加入石英砂，加入预热的提取缓冲液，磨成粉末状，

60℃水浴保温20min，其间不时缓慢摇动。

3.5000rpm离心5分钟，仔细吸取上清液至另一离心管中，

4.加入5ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀（需带手套，防止皮肤损伤），室温下静置

5-10分钟，使水相和有机相混匀。

5.室温下离心5000rpm离心5分钟。

6.仔细吸取上清液至另一离心管中，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出

现絮状沉淀。

7.离心5000rpm，离心5min，弃去异丙醇，室温晾干。

8.视沉淀多少，加入1ml左右ddh2o溶解，可在60℃水浴中放置15分钟以上助溶。

9.取dna样品5μl，加入1μl6?

loadingbuffer，混匀，加入0.7%的琼脂糖凝胶加样孔

中，电泳，检测dna的分子大小。

4、实验结果和讨论

实验分析：

本次实验由于种种原因我是和植保102班的同学一起做的，我们组3人，实验过程比较严谨，受到了老师的表扬，实验结果也很令人满意。

下面是实验过程中的注意点：

1、研磨不能太久太用力，会导致dna片段断掉。

2、实验室的某些试剂，如氯仿，有毒性，应带手套进行。

电泳的时候不知是时间的原因还是都做得不错，结果相差不是很远（如上图），第五组和第六组是我们的，第六组是我自己加的。

实验过程中要耐心细心，这样才能得到满意的结果。

园艺101

石颖

20100107011篇三：

浙大生化实验报告dna的提取

实验报告

课程名称：

生化实验甲指导老师：

成绩：

__________________实验名称：

植物基因组dna的提取实验类型：

生化定性实验同组学生姓名：

及纯度与含量的测定一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习并掌握植物基因组dna的提取原理和方法；2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作；3、学习并掌握对电泳检测基因组dna结果的初步分析；4、学习紫外吸收法测定核酸基本原理和方法；5、学习并掌握紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量的方法。

二、实验基本原理植物基因组dna的提取方法就其提取原理主要有二种：

十六烷基三乙基溴化铵（ctab）法、十二烷基硫酸钠（sds）法。

十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和

核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使dna得以游离出来。

再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸（dna、rna）水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。

上清液中加入无水乙醇使dna沉淀，沉淀dna溶于te溶液中，即得植物基因组dna溶液。

由于植物中的次生代谢产物--多酚类化合物可介导dna降解，而多糖的污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及dna聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。

传统的ctab-dna提取法步骤多，较烦琐，dna产率低，而且由于酚很难完全去除，容易影响以后的酶切等工作的效率。

sds法操作简单，温和,也可提取到较高分子量dna，但所得产物含糖类杂质较多,这将直接影响dna的限制性核酸内切酶酶切效果。

由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤其是氧化酶类）对dna的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。

本实验采用十二烷基硫酸钠（sds）法提取植物基因组dna，基因组dna提取后，①通过琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组dna分子量大小、纯度；②用紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量。

dna的琼脂糖凝胶电泳鉴定:

dna分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。

dna分子在高于等电点的溶液中带负电荷，它在电场中向正极移动。

在一定的电场强度下，dna分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的dna片段泳动速度不同。

dna片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（eb）染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定dna片断在凝胶中的位置。

紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量

核酸--dna和rna所含碱基的苯环结构（嘌呤环和嘧啶环）的共轭双键具有紫外吸收的性质，它们在260nm处有最大的吸收峰。

因此，可以用260nm波长进行核酸含量的测定。

波长为260nm时，dna或rna的光密度的大小不仅与总含量有关，也与它们的不同构型而有差异。

对标准样品来说，浓度为1μg/ml时，dna钠盐的od260＝0.02。

当od260＝1时，双链dna含量约为50μg/ml

单链dna含量约为37μg/ml

rna含量约为40μg/ml

寡核苷酸含量约为30μg/ml（由于底物不同有差异）

1、核酸样品dna、rna含量的测定：

如用1cm光径石英比色皿，用h2o稀释dna或rna样品n倍并以h2o为空白对照，根据此时读出的od260值即可计算出样品稀释前dna的含量：

dna（μg/μl）=50×od260读数×dna样品稀释倍数/1000

rna（μg/μl）=40×od260读数×rna样品稀释倍数/1000

若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用溴化乙锭法或其他方法进行估算。

当dna样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响dna吸光度的准确测定。

由于dna在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。

所以，一般情况下同时检测同一样品的od260、od280和od230，计算它们的比值来判断核酸样品的纯度。

2、核酸样品纯度判断的一般标准：

⑴dna纯度：

od260/od280≈1.8，表示为纯的dna；

od260/od280＞1.9，表示有rna污染；

od260/od280＜1.6，表示有蛋白质、酚等污染。

⑵rna纯度：

1.7＜od260/od280＜2.0，表示为纯的rna；

od260/od280＜1.7时，表示有蛋白质或酚污染；

od260/od280＞2.0时，表示可能有异硫氰酸残存。

⑶od230/od260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐和小分子如核苷酸、氨基酸、酚等的存在。

若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量；同时也会影响酶切和pcr的效果。

三、实验材料与试剂

1、实验材料：

植物幼嫩叶子

2、实验试剂

（1）基因组dna提取缓冲液

（2）氯仿:

异戊醇:

乙醇抽提液

（3）te缓冲液

（4）平衡酚：

（5）rna酶a

（6）酚/氯仿

（7）氯仿/异戊醇

（8）异丙醇、无水乙醇、70%乙醇。

（9）3mol/lnaac

（10）5×tbe缓冲液

（11）6×电泳上样缓冲液

（12）1.0%琼脂糖凝胶

（13）eb

（14）dna分子量markers：

125，564，2027，2322，4361，6557，9416，23130bp.

（15）ddh2o；

四、实验器材与仪器

1、研体

2、离心机、离心管（7ml、5ml）及离心管架；

3、微量移液器10ul、200ul、1000ul及枪头；

4、恒温水浴箱65℃

5、制冰机；

6、冰箱；

7、恒温水浴箱37℃；

8、微波炉；

9、电泳仪及电泳槽；

10、紫外检测仪。

11、紫外分光光度计；

12、石英比色皿（0.5cm光径）或1cm光径的微量石英比色皿（50ul、100ul）。

（二）琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna

1、制胶（1％琼脂糖凝胶）（此步骤由实验室老师准备）

在胶模上架好梳子。

称取01g琼脂糖，置于250ml锥形瓶中，加100ml0.5×tbe电泳缓冲液，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，待其冷却至50～60℃后，加入eb，使其终浓度为0.5mg/l，摇匀后立即倒入准备好的胶模中，待胶凝固后，放入电泳槽中，倒入适量0.5×tbe（刚好淹过胶面），拔去梳子备用。

（注：

eb为诱变剂、致癌物，接触凝胶必须戴手套操作）

2、加样

取5ul纯化的dna原溶液样品，与1ul6×电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中（注：

勿划破或戳穿加样孔，勿带入气泡）。

若dna含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。

每加完一个样品要换枪头以防互相污染。

注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

3、电泳

加完样后，盖上电泳槽盖，立即接通电源，使电压调到100v，恒压电泳。

当溴酚蓝条带移动到距凝胶前缘约2cm时，停止电泳（约需30～60min）。

4、观察和拍照

取出胶块置于紫外灯下观察，dna存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光带，再用成像仪进行拍照，以便于分析。

（注：

紫外光对眼睛有害，观察时戴上防护镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察）。

紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量

将提取的植物基因组dna样品吸取20ul，加到新的5ml离心管中，再加一定量的ddh2o或te缓冲液（ph8.0）稀释100倍，用0.5cm光径石英比色皿（约需1.6ml样品溶液）或微量石英比色皿在紫外分光光度计上测定230nm、260nm、280nm处的吸光度。

计算植物基因组dna样品溶液的dna的含量以及dna样品的纯度。

六、结果与分析

（一）

这是电泳后得到的照片，其中从右往左数第七条带为我所做样品的基因组。

（二）紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量

1、植物基因组dna样品溶液的dna的含量：

dna（μg/μl）=959.328ng/ul

2、植物基因组dna样品溶液的dna的纯度：

od260/od280＝1.97

od230/od260＝2.07

3、样品纯度判断：

⑴od260/od280≈1.8，表示为纯的dna；

⑵od260/od280＞1.9，表示有rna污染；

⑶od260/od280＜1.6，表示有蛋白质、酚等污染。

由od260/od280＝1.97可知，样品含有rna杂质。

七、讨论、心得

注意事项：

影响dna泳动速率（迁移率）的因素有：

⑴dna分子质量的影响：

双链dna分子迁移的速率与dna分子量对数成反比。

分子量越大，迁移率越小。

⑵dna构型的影响：

超螺旋dna＞线状dna＞开环dna

⑶胶浓度的影响：

浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度为1％～2％；

⑷电场强度的影响：

电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。

但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，（一般5v/cm）（电场强度）。

而对于大片段电泳，甚至用0.5～1.0v/cm电泳过夜。

进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。

⑸eb的影响：

溴化乙锭（eb）插入双链dna造成其负电荷减少、刚性和长度增加。

⑹电泳缓冲液的影响:

核酸电泳常采用tae、tbe、tpe三种缓冲系统，但它们各有利弊。

tae价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。

tpe在进行dna回收时，会使dna污染磷酸盐，影响后续反应。

所以多采用tbe缓冲液。

在缓冲液中加入edta，可以鳌合二价离子，抑制dnase，保护dna。

缓冲液ph常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。

⑺碱基组成与电泳温度的影响:

一般影响不大

在dna提取过程中必须始终注意以下几个关键问题：

（1）dna的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即"变性"，因此抽提时避免使用变性的条件。

（2）抑制内外源dnase的活力。

dnase就象一把刀，它能把大分子的dna切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：

a、低温操作；b、调节ph，使偏碱（ph8.0）；c、抽提液中加表面活性剂；d、加螯合剂（edta）除去酶的铺助因子（mg2+），使酶活性丧失。

（3）防止化学降解。

如过酸或过碱以及其它化学因素，会使dna降解，一般综合考虑，取ph8.0左右为宜。

（4）防止物理因素降解。

如温度太高或机械张力剪切等，dna分子特别大，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使dna断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。

（5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取有干扰作用。

因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取dna的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，dna含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。

由结果可知，在加入rna酶的时候可适当多加一点，以免造成得到的dna样品含较多rna杂质。

篇四：

dna提取实验报告

注：

1、报告内的项目或内容设置，可根据实际情况加以调整和补充。

2、学生提交实验报告时间为实验后10日内。

篇五：

dna提取及pcr扩增实验报告

pcr扩增及dna琼脂糖凝胶电泳

刘琳1131428环境科学

一、实验目的

1．学习并掌握pcr扩增的基本原理与实验技术。

2．对扩增后的dna进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。

二、实验原理

1.pcr扩增

多聚酶链反应（pcr）技术的原理类似于dna的天然复制过程。

在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板dna、四种脱氧核苷酸（dntp）、耐热taq聚合酶及两个合成dna的引物，而后加热使模板dna在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。

降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）与模板dna互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。

溶液反应温度升至中温（72℃），在tap酶作用下，用四种dntp为原料，引物为复制起点，模板dna的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。

如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和dna合成这一循环，使产物dna重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物dna可作为后一循环的模板dna而参与dna的合成，使产物dna的量按指数方式扩增。

经过30～40个循环，dna扩增即可完成。

2.dna琼脂糖凝胶电泳实验

dna分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。

在一定的电场强度下，dna分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。

dna分子的迁移速度与其相对分子量成反比。

不同构型的dna分子的迁移速度不同。

该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用dna分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。

三、实验材料

仪器：

pcr扩增仪、0.2ul薄壁管、1.5ml离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。

试剂：

tapdna聚合酶、dntp、buffer、两种引物、16s全长dna样本、无菌ddh2o、模板dna、tbe、琼脂糖、eb、显色剂。

四、实验步骤

1.pcr扩增

本次试验选择细菌16srdnav3区片段进行扩增。

1.1根据计算，首先取1.5ml离心管按照2.5ul10×buffer、1uldntp、0.5ul341gc、0.5ul534、0.125ultaq、19.375uddh2o的比例配置足量的pcr反应体系。

1.2分别向9个薄壁管中分别加入24ul的反应体系，并分别添加8种不同的模版，并于第9个薄壁管中加入无菌ddh2o作为阴性对照。

1.3将薄壁管放入pcr扩增仪中，按照预定程序进行pcr扩增。

其中循环过程需要达到30~40次。

程序如下：

预变性：

94℃3min

循环：

94℃变性30s

55℃退火30s

72℃延伸30s

末次延伸：

72℃5min

1.4pcr扩增完成后，将样品取出并