PCR技术及习题.docx
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PCR技术及习题
PCR技术及习题
PCR（polymerasechainreaction）：
聚合酶链式反应
1、PCR原理：
在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。
实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。
DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
2、PCR反应过程是：
变性→复性→延伸
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：
当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火（复性）：
温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；
③引物的延伸：
72℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
3、结果：
上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。
PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
4、细胞被DNA复制与PCR技术的比较：
细胞内DNA复制
体外DNA扩增（PCR）
不同点
解旋
在解旋酶作用下边解旋边复制
80～100℃高温解旋，双链完全分开
酶
DNA解旋酶、DNA聚合酶
TaqDNA聚合酶
引物
RNA
DNA、RNA
温度
体内温和条件
高温
相同点
①需提供DNA模板
②四种脱氧核苷酸为原料
③子链延伸的方向都是从5'端到3'端
知识点拨：
1、DNA分子复制的人工控制
解开螺旋：
在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。
恢复螺旋：
在50～60℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。
复制条件：
缓冲液，DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。
控制仪器：
PCR仪（温度周期性自动调节仪）。
2、PCR的含义是多聚酶链式反应。
3、PCR技术反应的条件：
①稳定的缓冲溶液环境（之间）；②DNA模板；③合成引物（2个）；④四种脱氧核甘酸；⑤DNA聚合酶；⑥温控设备
4、PCR技术最突出的优点是快速、高效、灵活、易于操作。
5、TaqDNA聚合酶的特点是：
耐高温。
知识拓展：
1、DNA聚合酶不能够从头合成DNA，只能从DNA的3'端开始延伸DNA链，因此DNA复制需要引物。
2、引物:
引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
3、PCR引物设计原则：
（1）PCR引物通常长15-25碱基，其中G＋C约占50%。
（2）引物之间不能互配形成双链结构，引物内部也不能形成发夹结构。
（3）引物的3’末端必须与目的片段完全相配。
（4）引物的5’末端可以不与目的片段互补，可以包含内切酶位点或启动子序列，但在下一轮反应中，这些序列会被同样合成
习题训练
1．聚合酶链式反应（PCR技术）是在实验室中以少量样品DNA制备大量DNA的生化技术，反应系统中包括微量样品DNA、DNA聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷酸及ATP等。
反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板，故DNA数以指数方式扩增，其简要过程如右图所示。
（1）某个DNA样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A:
G:
T:
C=1:
2:
3:
4，则经过PCR仪五次循环后，将产生个DNA分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是个。
（2）分别以不同生物的DNA样品为模板合成的各个新DNA之间存在差异，这些差异是。
（3）请指出PCR技术与转录过程的三个不同之处：
①。
②。
③。
2．通过DNA重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。
运用这一技术使羊奶中含有人体蛋白质，下图表示了这一技术的基本过程，在该工程中所用的基因“剪刀”能识别的序列和切点是一G↓GATCC一，请回答：
（1）从羊染色体中“剪下”羊蛋白质基因的酶是。
人体蛋白质基因“插入”后连接在羊体细胞染色体中时需要的酶是。
（2）请画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。
（3）人体蛋白质基因之所以能“插入”到羊的染色体内，原因是
，“插入”时常用的工具是。
3．下面甲图中DNA决定某一多肽链中的酪氨酸和丙氨酸过程示意图，乙图示样品DNA经PCR技术（聚合酶链式反应）扩增，可以获取大量DNA克隆分子。
分析回答：
（1）甲图中含有种核苷酸；丙氨酸的遗传密码子是。
该图表示了DNA中遗传信息的过程。
（2）有一种贫血症是血红蛋白分子的一条多肽链上，一个酪氨酸被一个苯丙氨酸所替代造成的。
此种贫血症的根本原因是，即发生了改变。
（3）乙图的“PCR”与人体内的DNA复制相比有何特殊之处?
。
（4）现在要通过“PCR”得到甲图中DNA片段的1024个克隆片段，则至少要向试管中加入个腺嘌呤脱氧核苷酸。
PCR检测上岗证试题
一、选择题（共20题，每题2分）
1、PCR技术扩增DNA,需要的条件是（）
①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体
A、①②③④B、②③④⑤C、①③④⑤D、①②③⑥
2、镁离子在DNA或RNA体外扩增反应的浓度一般为（）
3、多重PCR需要的引物对为（）
A、一对引物B、半对引物C、两对引物D、多对引物
4、PCR是在引物、模板和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应，其特异性决定因素为（）
A、模板B、引物C、dNTPD、镁离子
5、在PCR反应中，下列哪项可以引起非靶序列的扩增的扩增（）
A、TaqDNA聚合酶加量过多B、引物加量过多
C、A、B都可D、缓冲液中镁离子含量过高
6、PCR技术的发明人是（）
A、MullisB、史蒂文.沙夫C、兰德尔.才木
7、PCR产物短期存放可在（）保存。
A、4℃B、常温C、-80℃D、高温
8、PCR产物长期储存最好置于（）。
A、4℃B、常温C、16℃D、-20℃
9、PCR的基本反应过程包括（）
A、变性、退火、延伸B、变性、延伸C、变性、退火
10、在实际工作中，基因扩增实验室污染类型包括（ ）
A、扩增产物的污染B、天然基因组DNA的污染C、试剂污染和标本间交叉污染
D、A、B、C都可能
11、PCR技术于哪一年发明（）
A、1983B、1971C、1987D、1993
12、TaqDNA聚合酶酶促反应最快最适温度为（）
A、37℃B、50-55℃C、70-75℃D、80-85℃
13、以下哪种物质在PCR反应中不需要（）
A、TaqDNA聚合酶B、dNTPsC、镁离子D、RNA酶
14、PCR检测中，经过n个循环的扩增，拷贝数将增加（）
A、nB、2nC、2nD、n2
15、PCR基因扩增仪最关键的部分是（）
A、温度控制系统B、荧光检测系统C、软件系统D、热盖
16、以下哪项不是临床PCR实验室设计的一般原则（）
A、各区合并B、注意风向C、因地制宜D、方便工作
17、PCR实验室一般包括（）
A、试剂准备区B、标本制备区C、扩增区和产物分析区D、A、B、C都含
18、PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法。
若要检测一个人是否感染了艾滋病病毒，你认为可以用PCR扩增血液中的（）。
A、白细胞DNAB、病毒蛋白质C、血浆抗体D、病毒核酸
19、如果反应体系中加入模板DNA分子100个，则经过30个循环后，DNA分子的数量将达到（）个。
A、100×30B、100×30×2C、100×302D、100×230
20、PCR扩增产物的分析方法主要有（）
A、凝胶电泳分析法B、点杂交法C、荧光探针定量PCR法D、A、B、C都是
二、判断题（共20题，每题2分）
1、PCR引物设计的目的是在扩增特异性和扩增效率间间取得平衡。
（）
2、在PCR反应中，dATP在DNA扩增中可以提供能量，同时作为DNA合成的原料。
（）
3、DNA扩增过程未加解旋酶，可以通过先适当加温的方法破坏氢键，使模板DNA解旋。
（）
4、PCR反应中，复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成。
（）
5、PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高。
（）
6、PCR技术可用于基因诊断，判断亲缘关系等。
（）
7、PCR技术需在体内进行。
（）
8、PCR反应体系中的缓冲液相当于细胞中的体液。
（）
9、核酸的复制是由5＇——→3＇方向进行的。
（）
10、配对的碱基总是A与T和G与C。
（）
11、HBsAg转阴性后一段时间才出现可检测的HBsAb，此段间隔期称之为“窗口期”。
（）
12、市面上多数试剂用淬灭基团Q基团和报告基团R基团来标记荧光定量PCR的探针。
（）
13、PCR反应体系中Mg2+的作用是促进TaqDNA聚合酶活性。
（）
14、若标本中含有蛋白变性剂（如甲醛），PH、离子强度、Mg2+等有
较大改变都会影响Taq酶活性。
（）
15、每个子代DNA分子中均保留一条亲代DNA链和一条新合成的DNA链，这种复制方式称之为半保留复制。
（）
16、发生溶血的标本对PCR结果没影响。
（）
17、“平台效应”是描述PCR后期循环产物对数累积趋于饱和。
（）
18、逆转录聚合酶链式反应（reversetranscription-PCR，RT-PCR）就是在应用PCR方法检测RNA病毒时，以RNA为模板，在逆转录酶的作用下形成cDNA链，然后以cDNA为模板进行正常的PCR循环扩增。
（）
19、在定量PCR中，72℃这一步对荧光探针的结合有影响，故去除，实际上55℃仍可充分延伸，完成扩增复制。
（）
20、PCR可应用于遗传病、肿瘤及病原体检测三大方面（）
三、简答（共两题，每题10分）
1、PCR技术
2、简述定量PCR检测操作的全过程。
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