感受态细胞制作和转化效率的研究.docx

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感受态细胞制作和转化效率的研究

天津农学院

毕业论文

中文题目:

感受态细胞制作和转化效率的研究

英文题目:

EstablishmentofCompetentCellsand

AnalysisofTransformationEfficiency

学生姓名于晓猛

系别动物科学系

专业班级2010级动物医学专升本班

指导教师李吉霞

成绩评定

2012年6月

目录

1前言1

2材料与方法2

2.1材料与仪器2

2.1.1菌种及质粒2

2.1.2培养基2

2.1.3仪器设备2

2.2方法2

2.2.1制备感受态细菌2

2.2.2DNA重组子的转化感受态大肠杆菌3

2.2.3质粒DNA提取5

3结果8

3.1感受态细菌转化效率观察8

3.2质粒提取结果观察10

4讨论11

4.1DNA重组受体系统11

4.2感受态细胞的制备11

4.3质粒转化效率12

参考文献13

致谢14

附录1：

外文文献原文15

附录2：

外文文献原文译文20

摘要

质粒转化进入大肠杆菌感受态细胞是分子克隆的关键步骤，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中频繁使用的一项重要的常规操作。

本研究通过复苏和扩增DH5α细菌，每50ml菌液用10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬，冰浴30min。

于4℃，离心回收。

每50ml初始培养物用2ml用冰浴的0.1mol/L的CaCl2重悬，100ul/份，-4℃放置24h。

转化流程为：

100ul感受态DH-5α+5ulPCI-Neo-hTERT冰上放置30min，42℃,热激90s，冰浴2min，加入400ulLB培养基，于37℃,50r/min振摇45min，之后取200ul涂布于含Amp琼脂板，37℃倒置培养12~16h。

次日观察，并随机选择阳性克隆，用LB液体培养基进行扩增，然后按照质粒提取试剂盒操作说明提取质粒，检测转化效率。

结果表明，通过上述方案可以得到活力较好的感受态细菌，经质粒转化后，效率较高，可以应用于载体的转化。

关键词：

感受态细胞：

质粒：

转化

ABSTRACT

ItisakeystepforPlasmidtransformedintoEscherichiacolicellsinthemolecularcloning.TheimportantroutineoperationsarefrequentlyusedinthestudyofgenecloningandDNAlibraryconstruction.Inthisstudy,recoveryandamplificationofDH5αbacteria,per50mlbacteriumfluidwith10mlprecooling0.1mol/LofCaCl2resuspendedice-bath30min.In4℃,centrifugalrecovery.Initialcultureofeach50mlicebath0.1mol/LCaCl2resuspendedwith2ml.100ul/part,Thetransformationflowsareasfollows:

Firstly,theoperatorputsthe100ulcompetentofDH-5αand5ulPCI-Neo-hTERTontheicefor30minutes,keepsthetemperatureat42degrees,heatsitfor90secondsandice-bathesitfor2minutes,thenadds400ulLBcultureandshakesoutitatthespeedof50roundsperminutefor45minutesatthetemperatureof37degrees.Secondly,theoperatortakesout200ulontheagarplatewithAmp,thenconvertsandculturesitfor12to16hoursatthetemperatureof37degrees.Thennextday,theoperatorobservesit,choosesthepositivecloningatrandomandusestheLBliquidculturetoexpendit.ThentheoperatorextractstheplasmidaccordingtotheinstructionofthePlasmidExtractionKitanddetectsthetransformationefficiency.Itturnedoutthatnotonlybyusingabovemethodswecangetmanymoredynamiccompetentcells,butalsoshowsahigherefficiencywhichwouldappliedtovectorconversion.

Keywords:

CompetentCells;Plasmid;Transformation

感受态细胞制作和转化效率的研究

于晓猛

（天津农学院动物科学系）

1前言

分子生物学实验中,DNA重组技术和外源基因的表达是最为常用的研究手段之一[1]。

而体外构建的DNA重组子必须导入合适的受体细胞,才可以复制、增殖和表达。

载体与外源目的基因构成的重组载体可以通过转化直接导入受体细胞,从而实现基因在异源细胞的表达。

感受态细胞的制备是实现上述目标的一个重要环节,其制备质量的好坏直接影响后续工作的进行。

目前人们已经建立很多种感受态细胞的制备方法,最早的大肠杆菌感受态细胞制备的方法是Cohen[2]于1972年建立的。

该方法的主要原理是细菌通过冰冷的CaCl2低渗溶液处理后,加入待转化质粒DNA，经42℃短时间热冲击,细菌细胞可增加对该质粒DNA的摄入。

这一方法成为目前实验室制备感受态细胞的常规方法。

电转化法[3]是另外一种常用的细胞转化方法,其主要特征为速度快而且有很高的转化效率,每微克质粒DNA转化菌落数可高达109～1010个,但这一方法要求昂贵的设备,技术性较强。

1990年NishimuraA报道的一种镁盐法（Nishimura）制备感受态细胞的方法,该方法制备的感受态细胞效价高可达到108,但该方法操作仍显复杂。

1989年Chung等报道转化效率比CaCl2法要高的TSS法,而且不需要热休克。

同时还采用与TSS法操作完全相同,仅用等摩尔浓度MgSO4替换MgCl2的NewTSS法。

周国林等研究结果表明上述4种方法中TSS转化效率最高,其次为CaCl2法,再次为Nishimura法,最次为NewTSS法[4]TSS法对细胞的毒性较小,无需加入其他成分,转化方便,效率高,与其他方法相比便宜可靠,并可在-70℃下长期保存。

Tsen等发现大肠杆菌的某些菌株可以自然地在细胞质中与细胞外质粒低频率结合。

Chen等提出一种方便快捷的质粒转化大肠杆菌的方法,它几乎与传统的钙转化方法有相同的转化效率,而且这种方法大约只需2min.基于这种方法,建立了一个利用大肠杆菌感受态细胞转化质粒的系统,感受态细胞和质粒能长期储存,而且便于以后实验的扩增和利用。

一般实验室没有电穿孔技术所需要的特殊仪器，而利用氯化钙法将质粒重组入大肠杆菌细胞，操作方便、应用广泛，但是氯化钙法在实际操作中的转化效率常常不能完全满足试验的要求。

目前，实验室中常用的感受态细胞多为公司直接提供的，其价格昂贵，不适于普通基因克隆操作中的频繁使用[5]。

因此，对感受态细胞制备方法进行合理优化是提高转化效率的关键。

2材料与方法

2.1材料与仪器

2.1.1菌种及质粒

PCI-Neo-hTERT质粒、大肠杆菌DH5α由天津农学院动物科学系分子育种中心保存；胰蛋白胨、酵母提取物、氨苄青霉素和小量质粒提取试剂盒等购自北京索来宝科技有限公司，DMarker

购自上海拜利生物。

2.1.2培养基

LB固体培养基的配方：

胰蛋白胨（Tryptone）10g/L，酵母提取物（Yeastextract）5g/L，氯化钠（NaCl）10g/L，琼脂粉15g/L。

配制100ml的LB培养基加入1.5g琼脂粉，高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。

大约10mL倒1个板子。

培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15min。

用封口胶封边，并倒置放于4℃保存备用。

LB液体培养基的配方：

胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g。

配置100mL，高压灭菌后备用。

2.1.3仪器设备

恒温水浴箱（常州市国立设备实验研究中心，HH-S）；超净工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂，SW-CJ-LF）；高速冷冻离心机（Centrifuge,5424）；恒温摇床（哈尔滨东联生化仪器有限公司，HZQ-F100）；生化培养箱（SANYO，MCO-18AIC）。

2.2方法

2.2.1制备感受态细菌

以1:

100的比例吸取过夜菌液（250ul）加入25mlLB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养2-3h。

将25ml菌液移至预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置30min，使培养物冷却到0℃。

于4℃，以4000rpm离心10min，回收细胞。

倒出培养液，将管倒置1min（于滤纸/吸水纸上），使最后残留的痕量培养液流尽。

每50ml菌液用10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2，重悬每份沉淀，放置于冰浴上30min。

于4℃，以4000rpm离心10min，回收细胞。

倒出培养液，将管倒置1min（于滤纸/吸水纸上），使最后残留的痕量培养液流尽。

每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L的CaCl2（含15%甘油）重悬每份细胞沉淀。

在冰上将细胞分装成小份，100ul/份，-4℃放置24h。

（见图1-图2）

图1感受态制备中的冰浴

2.2.2DNA重组子的转化感受态大肠杆菌

实验流程如下所示。

100ul感受态细胞DH-5α+5ulPCI-Neo-hTERT（如图2）───→轻轻旋转混合───→冰上放置30min───→42℃,热激90S（如图3）───→冰浴2min───→400ulLB培养基───→37℃,50r/min振摇45min───→取200ul涂布于含Amp琼脂板───→室温放置，使液体吸收───→37℃倒置培养12~16h。

次日观察转化效率。

图2质粒结构图谱

图3感受态制备中的热应激

2.2.3质粒DNA提取

随机选择阳性克隆，用LB液体培养基进行扩增，然后按照质粒提取试剂盒操作说明提取质粒，如图4~图8。

（1）取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

（2）向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液Ⅰ，使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

注意：

如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。

（3）向离心管中加入250ul溶液Ⅱ，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

注意：

混匀一定要温和，以免污染细菌基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过5min，以免质粒受到破坏。

（4）向离心管中加入350ul溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。

12000rpm离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。

注意：

溶液Ⅲ加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。

如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

（5）将上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室温放置2分钟，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（6）向吸附柱中加入700ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

（7）向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

（8）12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。

（9）将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的无内毒素洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心1min。

（10）为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置5min，12000rpm离心1min。

质粒提取后置于-20℃保存，并进行凝胶电泳，见图9。

图4随机挑取单克隆菌落

图5单克隆扩增后形成的菌液

图6收集沉淀细菌

图7加入溶液I后进行涡旋振荡

图8质粒提取

图9加样电泳

3结果

3.1感受态细菌转化效率观察

比较对照平皿和转化平皿，转化平皿中有白色菌落生长，表面光滑，数目较多，估算菌落数>104个，表明转化效率较高，见图10、图11和图12。

图10感受态DH5α涂氨苄琼脂板生长结果

图11感受态DH5α于未加抗生素琼脂板上生长结果

图12质粒转化后生长氨苄抗性琼脂板上的DH5α菌落

3.2质粒提取结果观察

经电泳后，取出凝胶，在凝胶成像仪上观察，DNA存在处显荧光条带。

如图5所示，1道为DMarker

，最大条带为4500bp，2,3,4,5道表示提取的质粒，条带较亮。

试验只提取4株阳性菌落进行扩增和提取质粒DNA,结果均为阳性。

见图13。

图13质粒电泳结果图

4讨论

4.1DNA重组受体系统

目前,DNA重组技术中应用最广泛的受体系统是大肠杆菌系统。

影响转化效率的因素很多,其中感受态细胞的转化能力是关键。

大肠杆菌感受态细胞转化方法,目前主要有氯化钙法、醋酸锂法、电激法等多种手段。

而氯化钙法由于操作简单,成本较低,因此在常规实验中应用最为广泛[8]。

用于氯化钙转化法的大肠杆菌菌株主要有JM109,HB101,XL1-blue和DH5α等，国内对于大肠杆菌HB101的感受态制备条件优化鲜有报道。

感受态细胞菌种的来源对转化效率的影响非常显著。

实验结果表明,对于大肠杆菌HB101,取自保存于-70℃的原始菌种,其转化效率最高。

因此,制备感受态时,要尽量选取超低温状态下保存的原始菌种,而经过多次继代的菌种,由于菌种的衰退,其转化效率明显下降。

4.2感受态细胞的制备

感受态细胞的制备是分子生物学实验中的一项基本操作,CaCl2法制备过程中需要2次4℃下10min离心,离心时间较长,且要求实验室具备冷冻离心机。

大肠杆菌感受态建立的过程中，Ca2+是感受态建立和转化的必要条件。

刘志洪[9]研究表明，大肠杆菌在用CaCl2溶液处理后，胞外Ca2+可大量进入胞内，且进入细胞的钙离子量与胞外钙离子浓度相关，对数生长前期的细胞与对数生长后期和稳定期的细胞相比，胞内自身Ca2+浓度低，但其摄取外源Ca2+的能力最强，这应该与其生理代谢活性是相关的，而且这一时期是大肠杆菌细胞最易建立人工诱导感受态的时期。

虽然Ca2+、Mg2+、Sr2+在元素周期表中处于同一主族，Mn2+与Ca2+处于同一周期，但这些离子诱发产生的感受态，其转化效率都比Ca2+低，而当这些离子与Ca2+按一定比例组合时却只有Ca2+、Mg2+的组合诱导的转化效率升高，其它组合都会使转化效率下降，说明Ca2+具有不可完全替代性。

有人研究[10-13]显示Ca2+能与细胞膜形成复合物以利于外源DNA的渗入，在这个过程中金属离子是必需的，PHP也是重新合成然后整合到膜上，因此感受态形成过程可能有内在调节机制而不是完全依靠人工诱导。

42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动[14]，形成间隙有利于质粒DNA分子进入细胞，但若只采用热激处理还是不能形成感受态。

PEG处理细胞，能够影响细胞膜的通透性促进质粒DNA与感受态细胞膜结合[15]，适当的溶菌酶也可使细胞壁变薄或形成孔隙，但单用它们处理大肠杆菌JM109时都不能形成感受态，与CaCl2配合制备感受态，转化效率不升高反而下降，因此，感受态的产生也不是简单的膜结构改变。

4.3质粒转化效率

转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

受体细胞经过一些特殊方法（如电击法、CaCl2、RbCl等化学试剂法）的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。

进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子。

为了提高转化效率,要考虑以下几个重要因素：

（1）细胞生长状态和密度。

不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。

DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右（不同的菌株情况有所不同）,这时比较合适。

密度过高或不足均会影响转化效率。

（2）质粒的质量和浓度。

用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA。

转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。

一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。

（3）试剂的质量。

所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的（GR.或AR.）,并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。

（4）防止杂菌和杂DNA的污染：

整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。

参考文献

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4176-4180.

致谢

首先，在这里我要感谢我的导师李吉霞老师。

可以说，这篇论文如果没有她的悉心指导和严格监督是不能顺利完成的。

李老师平时工作繁忙，但是秉着对学生认真负责的态度，从论题的选定到实验的进行到论文的完成，她都始终坚持和我们在一起，对我们进行监督、指正并且总是耐心解答疑问。

她十分关切我的论文进展情况，总是不断与我交流，在我遇到困难的时候及时指导我去解决。

在我的论文初步完成时，李老师一丝不苟对我论文的每个细节都进行了多次修改，并给我提出了很多有用的意见和建议，让我受益匪浅。

然后我要感谢大学四年来所有教过我的老师，是他们倾囊相授才让我学到了很多知识，并打下了坚实的专业基础。

同时我还要感谢我的同学和我的室友们，感谢他们对我在学习和生活上的支持和帮助。

同时我要感谢我自己，我在做毕业论文中认真学习和积极主动的态度也是我论文能顺利写完的一个很大因素，因此，我也要对自己说，谢谢！

最后我还要感谢母校四年来对我的大力栽培。

谢谢母校奉献我成长的环境，谢谢母校给予我跟随各位老师学习的机会，谢谢母校赠与我与各位同学相识相知的机会！

在此，我要奉上我深深地敬意！

谢谢！

附录1：

外文文献原文

AhomemadekitforplasmidDNAmini-preparation

Simeon