环境生物修复中高效基因工程菌的构建策略刘和.docx

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环境生物修复中高效基因工程菌的构建策略刘和

浙江大学学报（农业与生命科学版　28（2:

208~212,2002

JournalofZhejiangUniversity（Agric1&LifeSci1

　　收稿日期:

2001204202

基金项目:

浙江省科学技术厅重点资助项目（001103258作者简介:

刘和（1974-,男,江西吉安人,博士生,主要从事环境生物技术的研究.

文章编号:

100829209（20020220208205

环境生物修复中高效基因工程菌的构建策略

刘和,陈英旭

（浙江大学环境工程系,浙江杭州310029

摘　要:

通过对环境污染物的生物降解机制及妨碍污染物降解的因素进行分析,提出了几种高效基因工程降解菌的构建策略,包括重组污染物降解基因以优化污染物降解途径、重组污染物摄入相关基因以改善对污染物的生物可利用性和重组环境不利因子抵抗基因以增强其环境适应性等Λ关　键　词:

生物修复;基因工程菌;污染物降解基因;中图分类号:

X502　　　文献标识码:

A

LIUHe,CHENYing2（t.Engineering,ZhejiangUniv.,Hangzhou310029,China

Coniesgeneticallyengineeredbacteriaforenvironmentbioremediation.JournalofZhejiangU（Agric1&LifeSci1,2002,28（2:

2082212

Abstract:

Geneticallyengineeredbacteriaholdpromisingpotentialinthefutureapplicationsofbioreme2diation.Thispaperpresentsseveralconstructionstrategiesofgeneticallyengineeredbacteriaforthebioremediationpurposethroughanalyzingthebiodegradationmechanismsofpollutantsandencumber2ingfactorsforefficacyofbiodegradation.Thesestrategiesincludeoptimizationofthedegradationpath2ways,improvementofthebioavailabilitytopollutantsandenhancementoftheabilitiesoftolerancetotheenvironmentalhazardousfactors.

Keywords:

bioremediation;geneticallyengineeredbacterium;pollutantcatabolicgene;environmental

biotechnology

　　受污染环境的生物修复技术是一项蓬勃发

展的环境污染治理技术,因其对受污染环境的生态风险小、费用低廉而日益引起各国政府部门和环境科学研究者的关注Λ微生物丰富的生物多样性决定了其代谢类型与污染物降解途径的广泛多样,因此在实际中得到了更多的应用Λ

然而受微生物对污染物特别是难降解污染物的降解能力所限,生物修复技术具有修复周期长的明显缺点,阻碍了这一技术在现实中的发展和应用Λ

　　构建高效的基因工程菌可以显著提高污染物的降解效率[1],它为解决生物修复周期长等问题提供了崭新的途径Λ环境微生物尤其是细菌中的污染物降解基因、降解途径等许多污染物降解机制的阐明为构建具有高效降解性能的污染物降解基因工程菌提供了可能[2]Λ本文通

过对污染物生物降解机制以及阻碍污染物降解的相关因素进行分析,提出几种高效基因工程菌的构建策略Λ

1　优化污染物的降解途径

1.1　重组互补代谢途径

　　有机污染物在降解菌编码的一系列酶催化作用下,逐步从复杂大分子化合物降解成简单的无机小分子化合物Λ一些难降解有机污染物特别是人工合成化合物（xenobiotics还需要不同降解菌之间的协同代谢或经共代谢等复杂机制才能最终得以降解,这无疑降低了污染物的降解效率Λ因为污染物代谢产物在不同降解菌间的跨膜转运是耗能过程,对细菌来说这是一种不经济的营养方式Λ另外,某些污染物的中间代谢产物可能具有毒性或对代谢活性有抑制作用,如不能被迅速代谢利用,

谢过程产生抑制作用Λ

菌降解污染物的种类、

在显著差异,

重组,

途径组合起来以构建具有特殊降解功能的超级降解菌,可以有效地提高微生物的降解能力,从而提高生物修复效率Λ

　　近年来,随着对污染物降解机理的逐步阐明及分子生物学实验手段的飞速发展,运用污染物互补降解途径重组策略已构建出越来越多的超级降解工程菌Λ多氯联苯（PCBs是自然环境中广泛存在的一类难降解污染物ΛPCBs在好氧条件下通过细菌bphA基因编码的联苯双加氧酶催化联苯裂解,生成氯代苯甲酸（CBA以及异戊二烯酸Λ后者最终降解成CO2和H2O,但细菌对CBA因缺乏相应的降解基因而不能继续降解Λ由于CBA对联苯双加氧酶具有强烈的抑制作用,使整个PCBs的降解效率显著降低Λ与此同时,某些细菌中发现的脱卤素基因,如Pseudomonasaeruginosa142中的ohb以及ArthrobacterglobiformisKZT1中的fcb等,它们能迅速脱除CBA上的氯,使CBA顺利进入后续降解步骤,同时也解除了CBA对整个降解途径的抑制作用Λ因此用脱卤素基因和

bph基因构建的重组体bph∷ohb弥补了PCB的代谢缺陷Λ

　　实际上,自然界细菌在污染物的选择压力下相互间的同源基因也存在着遗传交换和重组,以形成新的污染物降解途径,但是概率极低Λ运用互补代谢途径重组策略可以极大地扩展细菌的污染物降解范围以及增强细菌对污染物特别是难降解污染物的降解能力,这对于提高生物修复的效率无疑具有重要意义Λ

1.2　改变污染物代谢产物流向

　　污染物降解过程中由于抑制性中间代谢产

（end2pp

Λ

使抑制性中间产物不生成或尽快转化,从而提高污染物降解效率Λ例如,苯、甲苯、二甲苯（BTX是环境中常见的石油化工污染物,它们单独存在时被细菌通过TOL或TOD两种途径降解,但两种途径都存在缺陷:

TOD途径中,二甲苯降解产生的中间产物3,62二甲基邻苯二酚是一截止式代谢产物（dead2endproduct,因不能被后续的加氧酶识别而导致二甲苯降解不完全Λ而在TOL途径中,降解BTX的P.putidamt22菌体内不存在识别苯的加氧酶,致使苯不能被降解而在环境中积累Λ然而研究发现,P.putidamt22菌体内的对甲基苯甲酸脱氢酶能识别TOD途径中经甲苯双加氧酶催化苯降解产生的二羟基二氢对二甲苯,使之得以完全降解Λ因此,可以通过将TOD途径中编码甲苯双加氧酶的基因转移到P.putida的TOL途径中,利用TOL途径中的脱氢酶来催化TOD途径中生成的二羟基二氢对甲苯,使二甲苯不再进入3,62二甲基邻苯二酚途径Λ这样通过TOL和TOD途径整合到一起,污染物降解前段利用TOD途径,后段利用TOL途径,通过改变污染物的代谢流向而将BTX完全降解（见图1所示Λ

902

　第2期　刘和,陈英旭　　环境生物修复中高效基因工程菌的构建策略　　　　　

　　图中实线表示TOL途径,虚线表示TOD途径,箭头上的横截线分别表示TOL和TODΛ缩写说明:

TDO:

甲苯双加氧酶;BCG:

顺式21,22二羟基21,22二氢苯;XCG:

顺式21,22二羟基21,22XO:

二甲苯氧化酶;BADH:

苯甲醇脱氢酶;BALDH:

苯甲醛脱氢酶;BA:

苯甲酸;:

;;BACG:

顺式22,32二羟基22,32二氢苯甲酸;TACG:

顺式22,322TACGDH:

顺式22,32二羟

基22,32二氢对甲基苯甲酸脱氢酶;CTL:

邻苯二酚;42M:

:

22,32双加氧酶

图Fig.BTXdegradationpathway

1.3　　DNA（DNAshuffling最早是由Stemmer提出的一项对蛋白质进行人工体外快速定向进化的方法[3]Λ常规的PCR中,需要设计特定的引物对选定的DNA片段进行扩增Λ然而,DNA体外随机拼接技术既依赖于PCR,又不同于传统的PCR技术Λ这一DNA

构建策略可以简单概括为重组、扩增、筛选三个阶段,以上步骤反复进行直至得到所希望的重组酶蛋白Λ其一般过程是将一组不同来源的基因DNA或来自同一基因不同突变体的DNA经DNA酶随机切割消化,获得DNA随机酶切片段混合体,以此混合体在不加引物的情况下进行PCR扩增ΛDNA酶切割的DNA片段因相互间的同源性进行随机互补,并以此为引物,经PCR扩增,DNA分子复制,从而获得大量DNA不同区域间的随机重组的新DNA突变体Λ完成这一PCR随机扩增后,再加入特定引物进行最后的PCR扩增,便可获得全长基因的PCR产物Λ将PCR产物在寄主细胞中表达,筛选出理想的突变体,如此多次循环Λ由于同源基因DNA体外随机拼接是一项效率极高

的DNA重组技术,它能够在极短的时间内筛选出所需要的DNA重组蛋白,因此这一技术

又被称为蛋白质定向进化技术Λ这一先进的DNA重组策略可以运用于污染物降解基因的重组Λ双加氧酶是细菌体内广泛存在的一类多组分复合酶,它们通过将两个氧原子激活、加合到苯环上的方式活化苯环,使其进入后续的裂解开环步骤Λ由于双加氧酶是催化芳香化合物降解的一系列酶中最重要的酶之一,它对底物的选择特异性决定了细菌对污染物的降解范围,它对底物的降解效率很大程度上决定了芳香化合物的降解速率Λ因此,双加氧酶编码基因应该是DNA随机拼接技术的理想材料ΛBurkhorderiacepaciaLB400和P.pseudoal2caligenesKF707是两株降解性能迥异的PCB降解菌,前者的污染物选择范围宽于后者,而后者则对PCB同系物中的某些污染物具有更高的降解效率Λ尽管如此,它们的PCB双加氧酶编码基因bphA1却具有极高的同源性,运用DNA随机拼接策略将两株菌的bphA1基因重组,筛选后得到的双加氧酶重组体不但具有更高的降解活性,而且还能降解一些其亲本双加

012　　　　　

浙江大学学报（农业与生命科学版

　第28卷　

氧酶所不能降解的苯和甲苯类单环芳香化合物[4]Λ

2　提高污染物生物可利用性

2.1　重组表面活性剂编码基因

　　污染物的生物可利用性与生物修复效果密切相关ΛBosma等人认为污染物的生物可利用性在多数情况下决定了生物修复的可行性及修复效率[5]Λ尽管目前的研究结果不尽一致,但是普遍认为,表面活性剂能通过改善疏水性化合物的水溶性和表面张力等理化性质而提高其生物可利用性Λ而生物表面活性剂由于具有高表面活性、对热和pH值波动的稳定性好、低毒性和生物可降解性而比化学表面活性剂有着更广泛的应有优势Λ但由于生物表面活性剂的生产得率较低,因此现在的趋势是利用基因工程的

量Λ

这些工程Λ而提高污染物生物可利用性的另一途径是直接对污染物降解基因和表面活性剂编码基因进行重组,然后转化到合适的宿主菌中表达Λ如将从RhodococcuserythropolisIGTS8分离得到的脱硫基因dsz转化到产生鼠李糖脂的假单胞菌中可使构建的工程菌的生物脱硫效率明显提高[6]Λ

2.2　重组污染物跨膜转运基因

　　污染物降解速度还与微生物细胞对污染物的摄取速率有关,提高污染物的摄取速度有助于提高污染物的降解速度Λ例如,许多芳香烃类化合物进入降解细菌内部需要依靠细胞膜上的透性酶载体蛋白,这类酶蛋白不但对不同的底物具有特异性,甚至对化合物分子的空间构象也有选择性Λ因此将这些膜转运蛋白编码基因重组到污染物降解菌中可以提高其对污染物的摄取效率Λ另外,P.putida的42羟基苯甲酸转运蛋白Pcak还具有生物趋化作用Λ某些降解细菌中质粒编码的膜转运蛋白NahY对细菌的降解底物萘也有趋化作用[7]Λ这些特殊的生物学现象的发现及其机理的阐明将为构建此类基因工程菌提供坚实的理论基础Λ

3　增强细菌的环境适应性

3.1　增强细菌的抗毒能力

　　污染物降解菌在生物修复应用中要充分发挥降解性能就必须提高其对环境毒物的抵抗能力Λ许多芳香烃类污染物由于具有高度的疏水性而易在细菌细胞膜的脂质层积累,对细菌产生毒性Λ通过对此类化合物具有高度耐受性的细菌细胞膜结构进行研究后发现,构成细胞膜脂质双层的脂肪酸空间构象全部由顺式转变成反式结构,,

:

细胞内

这些耐受机制促使细菌在高浓度芳香烃类污染环境下得以生存Λ由于以上抗毒机制的相关编码基因已经得到分离,因此将污染物降解基因转入到此类细菌中可构建出对有毒污染物具有更强耐受力的基因工程菌,这将是提高细菌降解能力的有效途径Λ

3.2　增强细菌的放射线耐受性

　　许多微生物对放射线具有耐受性,但目前分离到的放射线耐受菌多属产芽孢菌,而且很多还是致病菌,因而限制了它们的应用Λ对

Deinococcaceae属细菌的研究发现,它们具有一些与众不同的特性,如繁殖体也具有高活度放射线耐受性,基因在不发生突变的前提下可完整地表达,无致病性,易分离培养等,这些特性使其成为最有希望用于放射性环境下进行生物修复的细菌Λ因此,将污染物降解基因转化到这类菌体中便有可能构建出耐受放射环境的污染物降解菌Λ将P.putida中分离得到的甲苯双加氧酶基因todC1C2A转移到D.radiodurans中,构建的工程菌能在高放射性压力下降解甲苯、氯苯以及3,42二氯丁烯[8]Λ另外,将编码汞离子还原酶的merA基因转化D.radiodurans得到的细菌可在6000radh的放射环境下将浓度极高的（30~50ΛmolLHg2+转化成无112

　第2期　刘和,陈英旭　　环境生物修复中高效基因工程菌的构建策略　　　　　

毒、易挥发性的Hg0+[9]Λ与此类似,一些其它的耐受重金属环境及极寒或极热环境条件的相关编码基因也被克隆分离出来,将这些基因与污染物降解基因重组可得到耐极端环境条件的污染物降解菌,这一构建策略为极端环境条件下的生物修复提供了可能Λ

致　谢:

感谢白晓慧博士在本文完成过程中提供的帮助Λ

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85290.

最近,浙江大学农业与生物技术学院教授周雪平等先后发现和命名了两种植物新病毒,这是为数不多的由我国科技工作者独立发现和命名的植物新病毒Λ

据了解,周雪平等在对植物DNA病毒研究中,在云南烟草上分离了多种病毒分离物,经生物学、血清学及病毒基因组全序列测定,从中发现了两种新病毒,遂分别命名为云南烟草曲叶病毒（TobaccoleafcurlYunnanVirus和烟草曲基病毒（TobaccocurlyshootVirusΛ有关结果已先后在《ArchivesofVirology》和《科学通报》上发表Λ据介绍,周雪平等曾于1997年在国际上首次发现植物DNA病毒基因组重组可产生新病毒,有关研究结果在国际上引起了广泛关注Λ目前,他们正在继续开展植物DNA病毒基因组结构、功能及致病机理研究Λ该项研究得到国家杰出青年基金的资助Λ

——本刊编辑室　　　　212　　　　　浙江大学学报（农业与生命科学版　第28卷