不同剂量丹参素对小鼠产后子宫内膜洪燕妮.docx
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不同剂量丹参素对小鼠产后子宫内膜洪燕妮
编号：
福建中医药大学
学生科研课题申请书
课题名称：
不同剂量丹参素对小鼠产后子宫内膜
边缘细胞的增殖修复作用
课题负责人：
洪艳妮
所在班级：
中西医结合学院08临床医学乙班
起止年限：
2011年2月至2011年9月
申请日期：
2010年11月
共青团福建中医药大学委员会制
一、主要研究内容（研究目的、意义、技术经济价值）：
1、研究目的：
采用动物小鼠实验研究中药丹参中的水溶性成分——丹参素的不同剂量对小鼠产后子宫内膜边缘群（sidepopulation，SP）细胞是否有增殖修复作用。
2、研究意义：
据报道，小鼠与人类的子宫内膜结构最相似[1]，因此研究不同剂量丹参素对小鼠产后子宫内膜边缘群细胞的增殖修复作用为降低现代妇女产后子宫炎症疾病具有一定的参考价值。
［1］易晓芳、徐丛剑等.子宫内膜异位症动物模型的研究进展，现代妇产科进展，2001年7月第10卷第4期
3、技术经济价值
子宫疾病是妇科的常见病之一［1］，据权威资料统计：
30岁以上的妇女约有20%患有子宫肌瘤，20%的妇女患有功能性子宫出血，随着人口的老龄化，患子宫疾病（尤其是子宫内膜炎及子宫内膜癌等）的病人日渐增多。
大部分患者在药物治疗后没有显著效果，最终有些人可能要行子宫切除术。
目前，我国每年做子宫切除的妇女超过100万人，在全球，每年有四分之一的30岁以下的女性染上子宫疾病，子宫疾病已经成为当今世界女性健康的最大杀手。
据初步统计，我国丹参种植总面积为5.8万多亩［2］，年产量在2000万公斤以上，部分被用来做中药饮片、溶液、制剂等，主要用于抗氧化、抗肿瘤、妇科、内科及外伤科等，其成分还有相当多资源没有被开发利用。
据资料显示，其水溶性成分丹参素对于内皮祖细胞具有增殖修复作用。
本实验为丹参中水溶性成分丹参素的提取，若能证实不同剂量丹参素对小鼠产后子宫内膜边缘群干/祖细胞有增殖修复作用，则能为治疗产后子宫炎症妇科疾病的应用提供一定的参考价值，具有较大的经济效益。
［1］瞿美钧，妇科疾病发率增高及时预防及时治疗，江阴新女性，2010.4.17
［2］杨朝勇、滕树川等.肥料种类及用量对中药材丹参产量的影响.耕种与栽培.2005年第2期
二、国内外现状、水平及发展趋势：
产后子宫复旧及产后子宫疾病一直是产科学界的关注点。
近年来，有关对子宫复旧不全及其他并发症的研究也越来越广泛和深入。
我国在这方面主要以传统中医药为主，如生化汤［1］、五加生化胶囊［2］，同时也见于其他临床研究［3］［4］。
随着干细胞研究的深入，子宫内膜研究方向转向干细胞的研究，使得干细胞成为子宫内膜研究的热点，早在30多年前，有的学者就推测子宫内膜可能存在干细胞［5］。
体内和体外实验研究证明，子宫内膜在起源上具有单克隆性。
国外学者对人类子宫内膜基质和腺体进行体外培养，检测了子宫内膜细胞的克隆能力［6］，目前，这种假设尚未在其他学者研究和其他动物的子宫中得到证实［7］。
中药丹参在临床上广泛应用于包括冠心病在内的缺血性疾病的防治［8］。
其水溶性成分丹参素多用于活血化瘀，理气止痛，用于胸憋闷，心绞痛［9］［10］。
丹参素具有对体外培养内皮祖细胞数量和功能的影响等作用，而且丹参中丹参素的含量又高，所以研究不同剂量丹参素对小鼠产后子宫内膜边缘群干/祖细胞是否有增殖修复作用具有深远意义。
参考文献：
［1］崔晓萍、杨鉴冰、杨援朝.生化汤对药物流产后子宫复旧及生殖周期再恢复的影响
［2］刘长丽，卢杰平，潘丽丽.五加生化胶囊促进流产后子宫复旧的临床疗效与机制分析
［3］严继承,朱心强等.硫丹对小鼠子宫内膜细胞的增殖作用，卫生毒理学杂志，2003年，第17卷，第01期
［4］朱立勤，张才丽.血管内中性白细胞部分介导卵巢切除小鼠子宫内膜内皮细胞对雌激素的增殖反应[英]／HeryantoB…／／Reproduction．国外医学：
妇产科学分册，2005年第32卷第1期
［5］ChanRW.GargettCEIdentificationoflabel-retainingcellsinmouseendometrium.2006（06）
［6］MutterGL.LinMC.FitzgeraldJTChangesinendometrialPTENexpressionthroughoutthehumanmenstrualcycle2000（06）
［7］谌兵来、胡随瑜、谢小毛等.小鼠胚胎干细胞建系新方法的初步研究湖南大学学报（自然科学版），2003年05期
［8］肖刚峰、张怀勤等.丹参的两种主要成分对培养内皮祖细胞药理作用
研究，中医药学刊，2006年06期
［9］张琦、李邦华.丹参素、川芎嗪对小鼠外周血造血干细胞动员作用的研究，实用临床医学，2008年第9卷第5期
［10］肖刚峰，张怀勤丹参素对体外培养内皮祖细胞数量和功能的影响，中医药学刊，2006年第3期
三、研究的阶段性目标、最终目标及采用的实验方法：
（一）研究的阶段性目标：
第一阶段：
提取丹参的水溶性成分丹参素，并测定丹参素的含量，配制不同剂量的丹参素溶液，熬炼生化汤；
第二阶段：
实验小鼠静脉灌胃不同剂量的丹参素溶液、不同剂量的生化汤；
第三阶段：
小鼠产后/未产子宫内膜的剥离，子宫内膜边缘群细胞的数量测定及形态观察；
第四阶段：
子宫内膜边缘群细胞的体外加药培养；
第五阶段：
子宫内膜边缘群细胞的体外加药培养的形态观察及计数
（二）最终目标：
采用动物小鼠实验研究中药丹参中的水溶性成分——丹参素的不同剂量对小鼠产后子宫内膜边缘群（sidepopulation，SP）细胞是否有增殖修复作用。
（三）实验方法：
1、实验药物
丹参、生化汤对照药物、培养基、胎牛血清、马血清、胰蛋白酶、II型胶原酶等
2、实验器材
眼科剪、眼科镊、虹膜剪、4号针头（针尖用细砂纸磨钝后折弯30度）、玻璃表皿、2培养液、仪器解剖镜、超净工作台、电子显微镜无菌青霉素瓶、流式细胞仪、分光光度计、高效液相色谱仪等
3、实验方法
3.1提取丹参中水溶性成分丹参素，及测定其含量
3.1.1丹参素的提取及溶液配制：
准确称取丹参10g,10倍量水,煎煮3次,每次2h的煎煮方法。
过滤，分别定容只200ml，测定丹参素的含量如下表：
提取次数
丹参素含（mg/g）
累积含量（mg/g）
1
1.8818
1.8818
2
1.0538
2.9356
3
0.4356
3.3712
结果表明，第三次提取丹参素含量已经很少，所以水煮发提取丹参素含量为3.3712mg/g。
根据2倍稀释法配制不同剂量的丹参素溶液，分别为：
1/2丹参素1.6856g/l；
1/4丹参素0.8428g/l；
1/8丹参素0.4214g/l。
3.1.2对照药物生化汤的制作：
生化汤的原料:
当归8钱，川芎6钱，桃仁5分（去蕊），黑姜5分，炙甘草5分，米酒
生化汤的制作方法:
1.第一药∶使用药方重量十倍米酒（约600cc），浸泡1小时，再以大火煮沸後，改用小火加盖煮30分钟，过滤取汁。
2.第二药∶将煮第一药剩下的药材用5倍量米酒煮（约300cc），小火煮沸後，过滤取汁。
3.将第一次和第二次药汁混合，小火不加盖煮到药汁浓缩到300cc，装於保温瓶中备用。
制作好的生化汤根据丹参素溶液的不同剂量应配制成1.6856g/l、0.8428g/l、0.4214g/l三种剂量。
3.2实验小鼠静脉灌胃药物
实验分为五个大组：
A、实验组：
怀孕小鼠15只+灌胃丹参素溶液+生仔+产后取子宫内膜与非子宫内膜细胞观察
（从15只中随机均等分为a、b、c组，分别灌胃1.6856g/l、0.8428g/l、0.4214g/l丹参素溶液）
B、对照组：
未怀孕小鼠15只+灌胃丹参素溶液+取子宫内膜与非子宫内膜细胞观察
（从15只中随机均等分为a、b、c组，分别灌胃1.6856g/l、0.8428g/l、0.4214g/l丹参素溶液）
C、对照组：
怀孕小鼠15只+灌胃生化汤溶液+生仔+产后取子宫内膜与非子宫内膜细胞观察
（从15只中随机均等分为a、b、c组，分别灌胃1.6856g/l、0.8428g/l、0.4214g/l生化汤溶液）
D、空白对照组：
怀孕小鼠15只+生理盐水+取子宫内膜与非子宫内膜细胞观察
（从15只中随机均等分为a、b、c组，分别灌胃1.6856g/l、0.8428g/l、0.4214g/l生理盐水）
3.3子宫内膜的剥离及观察
器械：
眼科剪、眼科镊、虹膜剪、4号针头（针尖用细砂纸磨钝后折弯30度）、玻璃表皿（直径60rain）；2培养液；仪器解剖镜、超净工作台、电子显微镜等。
①子宫的获得：
脱颈处死妊娠小鼠，于70％酒精中浸泡消毒后转移至超净工作台，剖腹取出双侧子宫角，置于盛有1.0lmlF12培养液的表皿里，剪去卵巢及输卵管，洗净血迹后修去子宫颈部分，将已分离的两侧子宫角移入另一表皿中备用。
②挤压法：
挤压法先用眼科镊夹住单侧子宫角的近输卵管端，然后持处理过的4号针头从近输卵管端逐渐向子宫颈方向挤压滑动，注意用力要适当，直至子宫内膜呈长条状完全滑出。
③观察：
肉眼观察大体形态和显微镜下观察内膜边缘群细胞的数量、形态。
3.4子宫内膜边缘群细胞的体外加药培养
主要试剂:
DMEM-F12培养基,胎牛血清,马血清，胰蛋白酶，II型胶原酶。
取小鼠分离的子宫内膜放入培养缓冲液中（20mMHEPES-NaOH,130mMNacl,1mMNaH2PO4,4mM葡萄糖，3mMKCL），在上述少量的缓冲液中用剪刀将小鼠分离的子宫内膜剪成1～3mm3大小的碎块，并移入无菌青霉素瓶中。
小鼠产后子宫内膜的分离:
事先用小针头制备无菌小转子一个，放入无菌青霉素瓶中，待剪碎的子宫内膜移入青霉素瓶中后，在其中加入约2毫升0.08%胰酶-0.1%II型胶原酶混合液（1:
1），放在温控磁力搅拌器上磁力搅拌消化（37℃，转速达到约20-30转/分钟）。
第1次消化6min,弃上清，以后每次消化5min,将消化液吸入到已装有1毫升20%胎牛血清DMEM-F12培养基的15毫升离心管中以终止胰酶作用，并于4℃冷藏保存，重复以上步骤，共消化约7-8次。
将上述收集好的子宫内膜消化液混合后于1100转/分钟离心10min,弃上清,用含20%胎牛血清,5%马血清的DMEM-F12培养基重悬，滤网过滤细胞悬液以去除大块有形成份。
将过滤好的细胞液收集到培养皿中,置于37℃CO2培养箱培养1.5小时,吸出尚未贴壁的细胞悬液转入另一培养皿中,置于37℃CO2培养箱中培养，48小时后换液。
根据3.3剥离子宫内膜实验及观察细胞数量，哪个浓度剂量对小鼠子宫内膜边缘群细胞的增殖修复作用更加明显，则作为细胞体外培养的初始浓度，继续根据2倍稀释法稀释，加药于细胞培养皿中。
3.5观察体外培养的细胞：
步骤：
（1）取50μl细胞悬浮液与50μltrypanblue（orErythrosinbluish）等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
（2）取少许混合液（约15μl）自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色（或红色-Erythrosinbluish）。
（3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数（至少乘以2，因与trypanblue等体积混合），最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。
若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞（或计下线与左线之细胞）。
（注：
4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml。
计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。
高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
）
参考文献：
［1］周侠、胡谨等.丹参素的提取工艺研究.化工生产与技术，2003年第10卷第6期
［2］金玉琼、黄冲等.小鼠静脉灌胃和吸入不同剂型两性霉素B的药动学比较.中国医药工业杂志，2009.40（5）
［3］胡菲菲、廖联明、刘嘉茵.产后小鼠子宫内膜边缘群细胞的分离纯化 ，生殖医学杂志，2008年04期
［4］唐力军、高毅等.人骨髓来源的多能成体祖细胞分离纯化及体外培养的实验研究，中国临床康复杂志，2005年02期
［5］金培峰，张浩等.糖尿病大鼠来源骨髓间充质干细胞体外培养观察及其生物学特性.温州医学院学报，2010年2月40卷1期
四、研究进度
2011.02——2011.03申请实验室、所需实验器材、
联系厂商，预购实验材料
2011.03——2011.04a、提取丹参的水溶性成分丹参素，并测定丹参素的含量，配制不同剂量的丹参素溶液，熬炼生化汤；
b、实验小鼠静脉灌胃不同剂量的丹参素溶液、不同剂量的生化汤
2011.04——2011.06小鼠产后/未产子宫内膜的剥离，子宫内膜边缘群细胞的数量测定及形态观察
2011.06——2011.07子宫内膜边缘群细胞的体外加药培养
2011.07——2011.08子宫内膜边缘群细胞的体外加药培养的形态观察及计数
2011.08——2011.09实验后期观察、数据处理及论文最后撰写
五、申请经费金额（写明经费总数及需要的理由）：
项目
经费预算
使用计划
购买实验动物及药物试剂
1000
小鼠、丹参、生化汤原材料、培养基、胎牛血清、马血清、胰蛋白酶、II型胶原酶等
购置费
300
车费、材料运费等
文献检索费
200
资料检索、复印、打印等
总计
1500
六、课题主要成员
负责人
姓名
性别
年龄
参加
月数
课题中的分工
所在班级
签名
洪艳妮
女
20
8
课题的整体设计、实验安排
08临床医学乙班
主
要
参加人员
温华香
女
23
8
购买实验动物及药物试剂、子宫剥离实验
08临床医学乙班
黄永亮
男
20
8
查询文献资料、制备溶液、动物静脉灌胃
08临床医学乙班
黄宗伟
男
21
8
申请实验室、所需实验器材、联系厂商，预购实验材料、平时动物管理、体外细胞培养
08临床医学乙班
指导老师
姓名
性别
年龄
职称
专业
工作单位
签名
蔡晶
女
41
教授
中西医结合
中西医结合研究院
七、课题结束后的计划：
①、向本校《福建中医药大学校报》投稿，期望获得肯定和指导。
②、回顾整个课题研究过程，总结研究过程中所出现的问题，保留好的经验及纠正不必要的错误。
③、撰写总结，与大家分享大学生研究课题过程中的经验与感悟。
④、继续与指导老师学习实验方法、提升自我的科研思路。
八、所在院系审核意见：
年月日（盖章）
九、校团委审核意见：
年月日（盖章）
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