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酶的多功能性催化KnoevenagelMichaelAldol反应研究

酶的多功能性催化Knoevenagel、Michael、Aldol反应研究

独创性声明

学位论文题目:

酶的多功能生催化坠曼盟垦鳇:

丛堡鳇△鱼

厦应研究

本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的

研究成果。

论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果,文中已加

了特别标注。

对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同

仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。

签字日期:

擗月日

学位论文作者:

询寺帮毕

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本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规

定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允

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咿不保密,

口保密期限至年月止。

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导师签名:

弓督、延多易

学位论文作者签名:

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专目录

摘要?

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第一章绪论

.绿色化学的产生、发展和定义..

.绿色化学的特点和原则?

.绿色化学的重要性.绿色化学与酶促反应.酶的多功能性的定义?

.酶的多功能性研究进展?

.酶的多功能性研究的意义.

.课题研究意义和前景?

第二章碱性蛋白酶催化的反应研究?

.弓言.结果与讨论?

.结沧.实验部分.

第三章猪胰脂肪酶催化的加成反应合成抗凝血剂及其衍生物?

.引言.结果与讨论?

.结论.实验部分

第四章酸性蛋白酶催化的不对称反应研究?

.引言

.结果与讨论

.结论.实验部分.

第五章猪胰脂肪酶催化的不对称反应研究?

心

.引言.结果与讨论?

结论.实验部分.

参考文选?

附录:

部分化合物液相图附录:

部分化合物氢谱、碳谱图致谢?

硕士期间发表的文章?

■

彦

摘要

酶的多功能性催化、、反应研究

有机化学专业硕士研究生谢帮华

指导教师何延红教授

摘要

随着绿色化学的兴起和发展以及人们对环境保护意识的加强,酶促有机化学反应,因其

具有高效性、高选择性、反应条件温和、后处理简单和对环境友好等特点,而备受化学家和

生物学家们关注。

目前发现生物酶大约有多种,且随着蛋白质工程和基因工程技术的发

展,人工修饰天然酶或合成非天然的新酶成为现实,极大的推动了酶在有机化学领域的应用

和发展,尤其是酶的高立体选择性,已经成为手性药物合成的一种重要手段。

从目前来看,

生物转化技术在很多领域已经实现其产业化、规模化。

酶促有机化学反应作为绿色化学发展

的一个重要的方向之一,是目前化学领域研究的一个热点和重点。

传统理论认为,酶只有在其天然的水溶液环境中才能显示其高效的催化活性和立体选择

性。

这种理论极大的限制了酶在有机化学中的应用和发展,直到二十世纪八十年代初期,

发现酶不仅可以在含有少量或微量的水、甚至无水的有机溶剂中保持其催化活性,而

且还显示出在天然水溶液环境中没有的新的一些特性,比如酶的稳定性提高,反应底物类型

的改变,化学反应立体选择性的改变和催化其他在水中不能发生的反应等特点。

这些特征被

称为酶的多功能性。

酶的多功能性,是目前催化领域的一个新发现,

把酶的

多功能性主要分为三类:

第一类就是酶催化环境的多功能性,指的是酶能够在除水溶液的天

然环境以外的催化环境表现出的催化活性,比如说酶能够在无水有机溶剂中催化某些有机化

学反应,或者是其他与天然催化反应不同的温度、值条件下的化学反应;第二类是酶催化

底物多样性,是指酶能够催化除天然底物以外的其他底物的化学反应;第三类是酶的催化多

惑

样性,是指单一酶的活性位点能够催化多种类型的化学反应。

一

近年来,酶催化的多功能性研究发展迅速,也取得了一定的成果。

越来越多的酶尤其是

童

水解酶作为生物催化剂被用于不对称合成和手性药物合成。

目前水解酶已经被广泛应用于催

化反应、加成反应、反应、反应等。

但是,从目前关于酶的多功

能性报道来看,不少酶在反应的催化活性和立体选择性上仍然有一定的局限性,对酶催化的

反应机理的研究更是鲜有人报道,这些问题都值得我们进一步的去研究和探索。

酶的多功能

性在有机化学中的应用为绿色化学的发展提供了新的有效的途径,是一个极具挑战性和吸引

力的研究领域。

本论文的主要内容是论述酶的多功能性在催化、、

反应中的应用。

反应是有机合成中形成碳碳双键的重要方法之一。

反应常常被多功能性在催化加成反应中的应用也日趋成为一个热点。

苄丙酮香豆素

作为最有效的抗凝血剂,在临床医学上已经使用了半个多世纪。

而目前主要是采用手性胺类

有机小分子催化剂,比如手性一级胺,手性二级胺等合成具有高选择性的苄丙酮香豆素及其

衍生物,而采用生物转化的方法合成手性苄丙酮香豆素还从未有人报道过。

本论文首次报道

了在少量水有机溶剂中,猪胰脂肪酶作为生物催化剂催化.羟基香豆素和苄叉丙酮类%卢不饱

和酮化合物的加成反应合成苄丙酮香豆素及其衍生物。

实验结果表明,在含水量为

%的/’溶剂体系中,.羟基香豆素和不饱和酮的投料比为:

含酶量为

/时,猪胰脂肪酶催化的加成反应获得了高达%的收率和%的∞值。

反应是有机合成中生成键最常用的一种方法。

它在药物化学和天然产物合成中

起着非常重要的作用。

本论文的第四章和第五章主要论述酸性蛋白酶和猪胰脂肪酶在催化

反应中的应用。

酸性蛋白酶是宇佐美曲霉经液体发酵培养后产生,它在酸性条件下能够

迅速水解蛋白质,且被广泛用于制革、毛纺、饲料、酿造等行业。

猪胰脂肪酶

是一类重要的水解酶,分子量约.道尔顿之间,其主要作

用是分解甘油三酯为脂肪酸和甘油,在食品、皮革、化妆品、医药等许多领域中均有广泛的

占

应用。

本论文首次发现酸性蛋白酶和猪胰脂肪酶分别对芳香醛和环状酮之间的反应有较

好的催化活性和立体选择性。

我们选择对硝基苯甲醛和环己酮反应为模型反应,对反应

条件进行系统的优化,包括反应溶剂、反应温度、含水量、值等,在最优条件下,对两种

酶催化的反应其他底物的适应性进行了考察,获得了比较理想的结果。

在含水量为%

的/,的溶剂体系中,醛和酮的投料比为:

反应温度为,含酶量为

时,酸性蛋白酶催化的反应产物获得了最高:

的值/和%的∞值。

在磷酸盐缓冲液每.//:

溶剂体系中,醛和酮的投料比为:

反应温度为

含酶量为

/时,猪胰脂肪酶催化的反应也获得了高达%的收率,:

值/和%的值/。

Ⅱ关键词:

酶催化多功能性;水解酶;反应;反应;

反应

西南大学硕学位论文

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西南大学硕十学位论文第一章绪论

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第一章绪论

.绿色化学的产生、发展和定义

化学作为一门实验科学和实用科学,其研究成果和应用对推动人类社会发展,

改善人类生活环境,提高人类生活质量起着非常重要的作用。

但是我们也看到化

学在给人类创造财富的同时,也伴随着严重的环境污染,特别是世纪工业革命

之后,人类的贪婪和疯狂追逐经济利益,却是以牺牲环境为代价。

资源的匮乏,

能源危机和环境问题的日益显现:

比如说白色污染,水土污染,大气污染,以及

病毒变异带来一系列新的疾病等问题才使人们逐渐认识到只有改变以前的先污染

后治理的发展观念,采取预防为主,防治结合的方式才能实现人类社会与环境可

持续发展。

但随着化学品的大量生产和广泛应用,人类对全球性环境污染的加剧以

及能源的匮乏和资源减少的日益关注。

人们逐渐发现,仅仅依靠开发更加有效的污

染控制技术对改善环境是很有限的,而把注意力集中到原始污染的预防上则对消

除污染更为有效。

正是在这样的时代背景下,催生了绿色化学的产生和发展。

绿色化学是近二十多年才产生和发展起来的,是化学发展的一个新的分支。

绿色化学

又称为环境无害化学

清洁化学,是指设计生产不具有或具有较小环境负作用,并在技术和

经济上具有可行性的化学品和化学过程。

英国《绿色化学》杂志

把绿色化学定义为:

在制造和应用化学产品时应有效利用最好可再生原料,也就

是使原料得到最优使用,消除废物和避免使用有毒的和危险的试剂和溶剂。

它涉

及有机合成、催化、生物化学、分析化学等多门学科,内容广泛,覆盖范围宽。

绿色化学的最大特点或者说核心就是在始端就采用预防污染的科学手段,实现过

程和终端均为零排放或零污染。

绿色化学已成为世纪化学发展的重要方向之一。

而目前绿色化学的主要研究方向是:

改善化学反应条件,降低对人类健康和

环境的危害,减少废弃物的产生和排放;设计或重新设计对人类健康和环境

更为安全的化合物和产品,这是绿色化学的关键部分;探求新的、更安全的、

高效的、对环境更友好的化学合成路线和生产工艺,这可从研究、变换基本原料

和起始化合物以及引入新试剂入手。

绿色化学的发展理念,在西方发达国家尤其受到重视。

最早是由美国提出的,

年,美国通过了一个“防止污染行动”的法令。

年后,“绿色化学”由

美国化学会提出并成为美国环保署的中心口号,并立即得到了全

世界的积极响应。

年月美国副总统宣布了国家环境技术战略,进一步

推动了绿色化学向前发展。

年,美国设立了“绿色化学挑战奖,以表彰那

些在绿色化学领域中做出杰出成就的企业和科学家。

在同年的时候,日本也制定我国对绿色化学这一新兴学科的研究也十分重视。

年,中国科学院化学

部确定了“绿色化学与技术?

推动化工生产可持续发展的途径的院士咨询

课题;年,国家自然科学基金委员会与中国石油化工集团公司联合资助了“环

境友好石油化工催化化学与化学反应工程’’重大基础研究项目。

自年开始举

办的国际绿色化学高级研讨会,推动了我国绿色化学的发展。

以后每年举行次,

至今已成功举办了届举办地点分别是合肥、成都、广州、济南、合肥、成

都、珠海、北京、合肥,推动了我国绿色化学的发展。

总之,绿色化学的研究已

成为国外企业、政府和学术界的重要研究与开发方向。

这对我国来说,既是严峻

的挑战,也是难得的发展机遇。

.绿色化学的特点和原则

绿色化学发展迅速,但其总的来看,大概包含以下主要特点:

充分利用资源和能源,采用无毒、无害的原料。

在无毒、无害的条件下进行反应,以减少废物向环境排放。

提高原子的利用率,力图使所有作为原料的原子都被产品所消纳,实现“零排

放。

生产出有利于环境保护、社区安全和人体健康的环境友好的产品。

..和..在年出版的《绿色化学理论和实践》一书曾

经提出绿色化学的条原则‘捌,目前已得到国际化学界的认可,这些原则是实验

化学家开发和评估一条合成路线、一个生产过程、一个化合物是不是绿色的指导

方针和标准,也为绿色化学未来发展指明了方向。

防止污染优于污染形成后处理。

尽可能使反应中使用和生成的物质对人类和环境无毒或毒性很小。

设计化学产品时应尽量保持其功效而降低其毒性。

尽量不用辅助剂,需要使用时应采用无毒物质。

能量使用应最小,并应考虑其对环境和经济的影响,合成方法应在常温、常

压下操作。

最大限度地使用可更新原料。

尽量避免不必要的衍生步骤。

催化试剂优于化学计量试剂。

第一章绪论

化学品应设计成使用后容易降解为无害物质的类型。

分析方法应能真正实现在线监测,在有害物质形成前加以控制。

化工生产过程中各种物质的选择与使用,应使化学事故的隐患最小。

设计合成方法时应最大限度地使所用的全部材料均转化到最终产品中。

绿色化学条原则的提出,既是绿色化学发展研究的成果概括和总结,也是

时代发展的必然要求和结果。

.绿色化学的重要性【】

绿色化学从产生到现在才二十多年,但是发展却非常迅速,也获得了丰硕的

研究成果。

绿色化学体现了化学科学、技术和社会的相互联系和相互作用,是社

会对化学科学发展的新要求。

它对于保护人类赖以生存的环境、实现人类社会的

可持续发展具有重要意义。

据不完全统计,迄今化学家已经合成大约超过万

个化合物,世纪年代以来每年新增化合物大约为多万个。

但是目前化学

的发展现状并不乐观,近年来,化学工业向大气、水和土壤等排放了大量有毒有

害的物质。

以年美国为例,仅按种有毒物质排放估算,化学工业的排

放量为万吨。

年美国化学工业用于环保的费用高达亿美元,清理

已污染地区花去了亿美元。

年美国公司的化学品销售总额为

亿美元,环保费用为亿美元。

人类为先污染后治理的作法付出了惨重的代

价,而且有些污染是很难彻底根治的,如气候变暖、臭氧层破坏、重金属和农药

在环境介质间的传递等等。

所以,从环保、经济和社会的发展来看,绿色化学是

化学科学与化学工业可持续发展的必由之路。

绿色化学是当今国际化学科学研究的前沿,它吸收了当代化学、物理、生物、

材料、信息等科学的最新理论和技术,是具有明确的社会需求和科学目标的新兴

的交叉学科。

从科学的角度看,绿色化学是化学科学基础内容的更新;从环境角

度看,它是从源头上消除污染以及在中端和终端实现零排放;从经济的角度看,

它是合理有效利用资源和能源、降低生产成本,符合经济可持续发展的客观要求

和需要;从生态的角度看,它将传统的化学学科与资源环境的协调发展联系起来,

更加强调化学的生态价值要求与实践。

.绿色化学与酶促反应

就目前来看,实现绿色化学的途径大概有以下几种:

开发”原子经济”反应

在年首次提出了原子经济性

的概念,即原料分子中究

竟有百分之几的原子转化成了产物。

理想的原子经济反应是原料分子中的原子百

分之百地转变成产物,不产生副产物或废物。

实现废物的”零排放”。

两南大学硕十学位论文

对于大宗基本有机原料的生产来说,选择原子经济反应十分重要。

目前有关原子

经济性的反应典范也陆续得到报道【。

采用无毒、无害的原料为使制得的中

间体具有进一步转化所需的官能团和反应性,在现有化工生产中仍使用剧毒的光

气和氢氰酸等作为原料。

为了人类健康和社区安全。

需要用无毒无害的原料代替

它们来生产所需的化工产品。

采用无毒、无害的溶剂或者在无溶剂的条件大

量的与化学品制造相关的污染问题不仅来源于原料和产品,而且来源于在其制造

过程中使用的物质。

最常见的是在反应介质、分离和处理中所用到的溶剂。

当前

广泛使用的溶剂是具有挥发性有机化合物。

其在使用过程中有的会引起地

面臭氧的形成和引起水源污染。

因此。

需要限制这类溶剂的使用。

采用无毒无害

的溶剂代替挥发性有机化合物作溶剂已成为绿色化学的重要研究方向。

而目前在

有机合成中常用无毒无害的溶剂主要有离子液体睁、超临界流体【.引、水【.】

以及在无溶剂【训】条件下催化合成的反应。

采用物理的方法促进化学反应采

用物理的方法促进化学反应主要是指借助光、电、热等机器设备为化学反应提供

能量从而引发和促进有机化学反应的发生的一种方式,它也是绿色化学发展方向

之一。

近年来,微波促进化学反应的研究已取得重大进展。

在有机合成方面,微

波已经广泛应用于.反应、重排、缩合以及其他的许多重要的有

机反应【】。

酶促有机化学反应生物酶催化的有机化学反应由于存在高效性、

高选择性、反应条件温和、后处理简单和对环境无污染等优点一直备受化学家青

睐。

近十几年来,生物有机化学家们在酶促有机化学反应的理论和应用研究方面

做了许多的工作并取得了一定的成绩,如酶一底物的相互识别和作用理论的发展,

特别是蛋白质工程和基因工程技术的发展,为酶的反应机理研究也奠定基础。

核

酸酶、抗体酶和杂化酶的发现以及酶在有机溶剂中反应新的特性的发现和应用,

酶化学修饰技术和模拟酶的合成的发展等,更使酶促有机化学反应的应用前景一

片光明。

实现绿色化学途径还有高效合成法【‘、定向合成方法等。

但是本论文

主要论述酶促反应主要是酶的多功能性在绿色有机化学中的应用,特别是酶

的多功能性在有机催化、和反应中的应用。

.酶的多功能性的定义

近些年来,生物转化过程由于其反应条件温和、环境友好等特点,是有机合

成中比较理想的合成方法而越来越受到化学家的关注。

而在生物转化的类型中,

由于大多数酶催化的有机反应具有高效性、高的化学选择性和立体选择性,对环

境无污染等特点,且随着蛋白质工程和基因工程技术的发展,也极大的促进了生

物酶的开发和利用,因此生物酶催化的有机反应也越来越受到有机化学家和生物

学家的青睐。

传统理论认为,生物酶只能在水溶液中催化其天然底物的化学反应,

第一苹绪论

喜爱?

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也就是说酶只具备化学反应的专一性,而酶的多功能性却一直受到忽视列。

直到

世纪年代,和发现酶不仅能在有机溶剂中能保持良好的催化

活性【,而且还表现出酶在水溶液中所不具有的特点,比如说反应底物类型的

改变,化学反应立体选择性的改变和催化其他的新的化学反应类型掣¨。

酶在有

机溶剂中所表现出的这些独特的性质很快受到化学家们的关注,酶促有机化学反

应顿时也掀起一股热潮,越来越多的酶被陆续发现除了能催化天然底物的反应外,

还能催化其他非天然底物的化学反应,这种特征被称为酶的多功能性。

比如说

氨基肽酶通常水解的是氨基键,但是它却同样能水解磷酸酯?

键

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图.氪基肽酶同样能催化水解磷酸酯

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对于酶的多功能性,有几种不同的分类方法,从广义来说,

把酶的多功能性分为三类:

第一类就是酶催化环境的多功能性,指的是酶能够在

除水溶液的天然环境以外的催化环境表现出催化活性,比如说酶能够在无水有机.

溶剂中催化某些有机化学反应,或者是其他与天然催化反应不同的温度、值条

件下的化学反应;第二类是酶催化底物多样性,是指酶能够催化除天然底物以外

的其他底物的化学反应;第三类是酶的催化多样性,是指单一酶的活性位点能够

催化多种类型的化学反应。

狭义的酶的多功能性就是酶的第三类的定义,即一种

酶能够催化多种不同反应机理或者不同断键方式的化学反应。

而目前研究的最多

和应用最多的也是酶的催化多样性。

本论文也主要讨论酶催化的非天然属性在有

机化学中的应用。

.酶的多功能性研究进展

近几年在酶的多功能性研究中,水解酶由于原料丰富易得,研究技术成熟,

且很多水解酶催促有机反应可以直接应用于工业生产,因此目前研究焦点主要是

水解酶的多功能性在有机化学中的应用。

本文就水解酶在催化反应、反应,反应,

反应和反应进展作一简单概述,对于酶催化的

反应和反应,我们将在第一章和第三四章中序言部分提到。

两南大学硕士学位论文

..酶的多功能性催化加成反应

加成反应是有机合成中生成.键或者碳杂原子键的一类基本的反

应。

它具有很好的原子经济性,一步加成反应便能形成三个手性中心。

目前不对

称催化加成反应的方法主要有有机金属催化和有机小分子催化和酶催化

。

研究小组首次报道了使用脂肪酶和酵母在水相中催化.三氟甲基

.,得到了较低的收率和中

丙烯酸和苯硫酚的不对称加成反应

等的对映选择性【。

及其同事报道了非水介子中脂肪酶和蛋白酶催化咪唑类

和嘧啶类化合物与口,声不饱和烷基类化合物的加成反应刈。

年,

变体催化的,.二羰基化合物与

等报道了和.

.,在此反应中.

口,‖不饱羰基化合物的加成反应

变体几乎显示出与其催化天然反应相当的催化活性【。

变体同样能够催化乙酰丙酮

在年的时候,他们还发现.

和口,环饱和羰基酸酯的加成反应。

与此同时,课题组报道了

固定化脂肪酶.和.催化的甲基乙烯基酮与.硝基乙酸甲酯的加成反应,获得了高达%的转化率,但是却

的甲苯溶剂中,

没有立体选择性【。