抑癌基因p53的突变与修护激活.docx

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抑癌基因p53的突变与修护激活

抑癌基因p53的突变与修护激活

031134潇钦

摘要：

p53作为一种代表性的抑癌蛋白，是肿瘤分子生物学的研究热点。

然而，野生型的p53通过不同位点的点突变会形成不同类型的突变型p53，突变型p53不仅丧失了野生型p53的抑癌功能，更获得了一些癌症症状起促进作用的新功能。

本文着重介绍野生p53的结构和功能，阐述其突变的方法和类型，罗列突变p53的危害，以及重新激活修护p53的方法。

关键词p53；突变；激活修护

野生型p53的介绍

人的p53基因位于第17号染色体短臂，分布于大约20Kb的DNA区域中。

它由11个外显子和10个含子组成。

启动子中不含有CAAT、TATA、GC盒等常见启动序列，转录产生2.5kbmRNA，翻译生成由393个氨基酸残基组成的，分子量为53kd的蛋白质。

（1）

p53蛋白包括3个功能调节区域（如图1）:

图1

（1）N-端的活化：

通过与转录因子TFⅡD结合而发挥转录激活功能，序列上又可细分为转录活化域和富含脯氨酸的SH3域；

（2）序列中段DNA结合域：

能与特定的DNA序列结合,调节靶基因的转录活性，p53突变多发于此区域；

（3）C端功能域：

包含核定位信号、出核信号、四聚化结构域及一个调控功能域,参与p53细胞定位、四聚化以及对中央DNA结合域的调控作用。

（2）（3）

正常情况下细胞p53蛋白的含量很低,这主要是由MDM2介导的p53快速降解来调节的。

当应激各种损伤信号时,p53蛋白被磷酸化修饰,避免了在细胞质中发生的MDM2对p53的降解，从而使核的p53水平迅速升高。

激活的p53通过其DNA结合区结合靶基因的启动子。

并借助其转录激活区诱导其下游基因的转录表达。

p53活化对细胞有两种潜在影响:

一是使细胞停止在G1或G2期，导致损伤的细胞得以修复；二是诱发细胞凋亡，去除变异细胞。

但p53的抑癌功能常因突变而消失，使细胞无限分裂增殖，导致癌症的发生。

（3）（4）但肿瘤细胞中的p53或因突变而失活，或因与宿主或病毒的某种蛋白质的结合而失活。

失活后的p53蛋白便丧失上述功能。

P53的调控机制

近年来，对p53抑癌机制研究日趋深入。

在不同的癌症中，其调节网络各有特点。

下面就一个典型的调节通路：

MDM2的调控作简要介绍。

癌基因MDM2编码的蛋白质通过与p53的17-22位氨基酸残基相结合，阻断p53的转录调控通路。

MDM2还可与p53特异的泛素酶共同作用,促进p53蛋白降解。

MDM2-p53复合物广泛存在于s和G2/M期细胞中。

p53激活MDM2的表达，而生成的MDM2蛋白抑制p53活性，形成MDM2依赖的负反馈调节机制。

研究发现，MDM2在肉瘤,乳腺癌,脑瘤,膀胱癌,肺癌和白血病中的表达量明显高于正常组织或细胞。

乙酰化是调节p53蛋白活性十分重要的方式：

1.乙酰化可封闭p53赖氨酸泛素结合位点，抑制其降解，增强p53稳定性。

2.乙酰化有助于转录调节活性的短暂分离，对下游靶基因的活化起重要作用。

3.乙酰化作用或许诱发p53C端构象变化，破坏C端的回折，提高p53与DNA的结合能力。

4.乙酰化可协调p53在胞质与胞核间的分隔分布。

磷酸化可增强p53与乙酰化酶的相互作用，促进p53C端乙酰化，建立p53磷酸化-乙酰化级联反应，p53在细胞聚集并向核转位。

修饰后的p53形成有生物学活性的四聚体，与靶基因的p53反应元件结合，控制着下游靶基因的表达，从而引起细胞生长阻滞、凋亡。

研究发现MDM2的酸性结构域是抑制p300介导的p53乙酰化的必要因素，该结构域还介导p53去乙酰化作用，进而影响p53的功能和活性。

研究发现p14ARF不但可使MDM2失活,还可促进p53蛋白的稳定表达。

检查点激酶1和检查点激酶2可诱导p53磷酸化，削弱MDM2与p53的结合，从而提高p53稳定性。

（3）

p53的突变类型

TP53突变在肿瘤发生中是非常常见的,不同位点的点突变产生了多种形式的突变P53蛋白

（1）。

P53突变的类型包括基因片段缺失、插入,点突变引起的错义突变,以及杂合性缺失。

但是在所有p53突变形式中,占主导地位的还是因点突变引起的错义突变,其比例约占总体的80%。

而在这些p53错义突变中,发生在DBD区的点突变比例高达97%。

实际上，p53的DBD区每一个氨基酸都可发生点突变而形成相应的突变体,。

但是以下6个位点的突变在癌症中高频率出现，与癌症进程紧密关联，被称为热点突变。

它们分别是:

R175、G245、R248、R249、R273、R282（标注如图1）。

p53的突变可以分为三类：

1.DNA结合缺陷突变体：

是指那些负责与特定DNA序列结合的氨基酸残基发生点突变，致使p53与DNA结合能力减弱。

例如R273H（小鼠中为R270H）。

2.构象突变体：

是指那些发生点突变后改变了原来野生型p53的整体构象。

例如R175H（小鼠中为R172H）。

3.以上突变都改变了p53的三维结构,而R273H突变失去DNA结合能力是因为273位突变后的精氨酸残基支链过长,空间效应抑制了和DNA的结合。

从功能上来说,突变型p53在丧失了抑癌基因功能后，还可以通过显性负效应抑制野生型p53的活性。

显性负效应是指一个等位基因上发生的突变损害了另一个等位基因的正常功能，使其产生没有活性的蛋白。

在癌症发生过程中，通常是p53,的一个等位基因发生突变，另一个保持野生型p53活性。

这时在细胞同时存在突变型p53和野生型p53两种蛋白单体，突变型p53与野生型53通过彼此C端四聚化结构域形成寡聚蛋白时，突变型p53抑制野生型p53活性，占据主导地位。

最终，在癌症的发展过程中，野生型53等位基因丢失。

（2）

后果

1.突变型p53能够形成更稳定的四聚体：

以往的研究证明p53在正常细胞含量很低，野生型p53是通过修饰避免了水解从而得到激活。

而突变p53是怎样避免水解的呢？

研究发现,MDM2作为p53最主要的负调控因子，它的转录表达处于p53的控制之下。

突变p53不能有效激活MDM2表达，使p53失去了MDM2的负调控,从而导致了突变p53在肿瘤细胞的核积累。

这一发现提示突变p53形成的四聚体可能具有与野生型p53不同的转录激活功能。

（4）

2.“功能缺失”与“功能获得”：

功能缺失：

一般来说，p53发生突变后,会丧失野生型p53所具有的细胞周期阻滞、诱导凋亡发生、介导细胞衰老、维护基因组稳定、错配DNA碱基修复等抑癌基因功能。

功能获得：

突变型p53获得了一系列类似癌基因特性的功能,例如转录一系列靶基因加速癌症进程、增强癌细胞化学耐药性、阻止癌细胞凋亡的发生、抑制p63、p73活性等,这一过程被称为突变型p53的“功能获得”。

新近研究表明,突变型p53还抑制了MRN-ATM通路活性。

（2）

3.改变转移能力：

已有数据表明,p53+/−、p53−/−小鼠高度肿瘤易感,具有在早期自发成瘤的表型。

在其所生肿瘤中,淋巴瘤和肉瘤占主体，但是在人类Li-Fraumeni综合征中较常见的上皮组织来源的瘤却很少。

而基因型为p53mutant/+、p53mutant/−小鼠的肿瘤谱结构发生了较大改变,上皮组织来源的瘤比例大幅提高，并伴有较高的肿瘤转移率，能更好地模拟人类Li-Fraumeni综合征。

可见，mutp53在肿瘤发生和转移中发挥了重要作用。

（2）

突变型p53获得癌基因特性的机制

研究者们认为至少存在着两种机制（图2）:

1.突变型p53可以作为具有癌基因活性的转录因子,调控下游一系列靶基因的表达,加速肿瘤的发生发展。

这其中又包括两种情况,mutp53独立启动的转录和与其他蛋白因子协同启动的转录;

2.突变型p53可以与p53家族的另外两个重要抑癌基因—p63、p73相互作用,抑制了p63、p73的活性。

图2

肿瘤治疗新策略：

肿瘤细胞重新激活p53

小分子和多肽再激活p53

绝大多数的P53突变是错义突变,这些突变位点多发生在p53的DNA结合结构域,导致突变的p53不能与DNA正常结合,失去了转录激活能力,进而失去了肿瘤抑制的能力。

后来科学研究发现，引入小分子或多肽与突变p53结合可以恢复其与DNA的结合功能。

1.引入多肽

实验证明，通过引入针对突变p53R273H、R273C、R248Q、R282W的C末端设计的多肽，通过其与突变蛋白的相互作用改变其构象能恢复突变p53对特定序列的DNA结合能力，进而产生生长抑制或诱导凋亡。

这一结果可能是因为该多肽稳定了p53的核心折叠构象,加强了与DNA的结合能力。

p53核心结构域（DNA结合区）对p53发挥其抑癌作用起关键作用,因此可以设想如果能稳定野生型p53的核心结构域和校正突变p53的核心结构域就能使其发挥抑癌作用。

这一策略的构想是找到一种配基,能正确与突变p53核心结构域结合，并且能通过与突变p53的结合改变突变p53的核心结构域，使它的折叠构象向正确方向转变。

p53蛋白的稳定还与细胞的分子伴侣有关,研究发现p5能与Hsp40、Hsp70和Hsp90结合。

未折叠的突变p53与Hsp70有高亲和力，远超过野生型p53，这一发现提示我们，Hsp蛋白可能稳定了突变p53的未折叠构象，因此阻止Hsp蛋白与突变p53的结合有可能使突变p53恢复折叠构象。

（4）

2.引入小分子

相比多肽来说,小分子治疗拥有更多优势，如不易引起免疫排斥反应，使用方便,可静脉注射或口服等,因此寻找有效的小分子就显得尤为重要。

（5）对作用于突变p53的小分子的寻找有两个主要途径：

蛋白分子水平分析和细胞水平效应分析。

前一种方法可以确认突变p53蛋白与小分子作用后的蛋白变化和了解相应的机制，但不能确定该小分子是否能进入细胞及是否有细胞毒性等；而后一种方法可以观察到小分子作用后细胞的变化，是否能诱导细胞凋亡等，但却不容易解释详细的分子机制。

通过以上两种方法，目前找到了一些作用于突变p53的小分子化合物，如CP-31398、PRIMA-1、MIRA-1等。

CP-31398是在热变性条件下，从大量,小分子中筛选出的能保护p53核心结构域的小分子，而PRIMA-1、MIRA-1这两个小分子则是通过筛选能引起表达突变p53的肿瘤细胞凋亡的小分子发现的。

在体外,这些小分子能激活p53的正常功能,诱导p53目的基因如p21、MDM2和PUMA等的表达，而且CP-31398、PRIMA-1还能在小鼠体抑制肿瘤生长。

重组的腺病毒在肿瘤细胞中表达野生p53

通过重组包含p53cDNA的腺病毒Advexin，在肿瘤细胞中表达野生p53进而激活p53途径，抑制和清除肿瘤。

选用Advexin载体是因为它能够转染多种细胞，包括分化和未分化的细胞，并且不会整合到宿主基因组上，同时它能够大批量生产，并且它的安全性已经得到证实。

抑制MDM2来重新激活p53

1.p53-MDM2复合物的空间晶体结构已经清楚，它们之间的疏水间隙被p53的3个氨基酸p53-Phe19,Leu26和Trp23占据，因此可以设想一些小分子模拟这3个氨基酸和它们的方位来阻止MDM2-p53的相互作用。

通过高通量分析和计算机模拟，发现了一些MDM2-p53阻断分子，如Nutlins-3。

在含野生p53并过度表达MDM2的野生型和肿瘤衍生的细胞系中，低浓度的Nutlins-3就能有效激活p53途径，诱导细胞周期抑制和细胞凋亡。

2.以往的p53-MDM2抑制小分子多是根据他们之间的3个氨基酸p53-Phe19、Leu26和Trp23设计的，而MI-63的设计还加入了第4个氨基酸Leu22,该氨基酸对p53-MDM2结合有重要作用。

（6）MI-63高度亲和的结合MDM2上，抑制p53-MDM2相互结合。

MI-63表现出比Nutlins-3更强的p53-MDM2抑制能力，更强的促凋亡能力,同时还发现MI-63与阿霉素有强协同作用。

3.绝大多数的MDM2-p53干扰小分子都是结合到MDM2上的来抑制MDM2-p53相互作用的，可看作MDM2的抗体。

但RITA不同，RITA结合到p53N端，促进p53的积累，同时在体外抑制p53与MDM-2的相互作用,因此RITA促进了p53下游基因的表达并能有效诱导凋亡，RITA的肿瘤抑制能力是野生型p53依赖的。

（7）但这一解释遭到了质疑，最新的研究发现RITA在一些含p53热点突变的肿瘤治疗中重新激活了p53介导的细胞凋亡，也就是说RITA并不是完全野生型依赖的。

RITA稳定p53的机制还在研究中,Krajewski通过NMR数据证明RITA并不是直接作用于p53而是通过其他机制稳定了p53。

[4]

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