实验方法mh.docx
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实验方法mh
1.组织RNA及组织、细胞蛋白提取
1.1组织RNA提取
1.使用Biopulverizer冰冻粉碎组织并对粉碎的组织进行匀浆。
匀浆或裂解后样品于15～30℃孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。
Trizol含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
2.取100mg组织匀浆置于1.5mlEP管中，向每个EP管加入1mlTrizol试剂并颠倒混匀。
3.打开管盖，向每管加入相当于Trizol体积1/5的氯仿，盖紧管盖，剧烈震荡混匀15秒，室温静置3min。
4.4℃低温离心机，12,000×g离心15min。
5.离心后自然分出上层无色水相和下层有机相，RNA存在于上层。
将上层水相液体小心吸到新的EP管中，并加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温静置5min，
6.4℃低温离心机，12,000×g离心10min。
离心后，管底会出现白色沉淀，吸走上清液，
7.加入1ml的75%乙醇，洗涤RNA沉淀。
上下颠倒后，
8.4℃，10,000×g离心5分钟。
9.小心去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5～10分钟。
10.使用去RNA酶水彻底溶解RNA，用NanoDropND-1000测定RNA浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳法评估RNA完整性。
获得的RNA溶液立即用于逆转录反应，合成cDNA。
（RNA含量多50-100μl；含量少20μl）
11.细胞RNA
12.500ulTrizol静置15min
13.5:
1加入100ul三氯甲烷，震动30s，常温放置10min
14.4℃12000离心15min
15.200ul上清移入EP管中，加入等量异丙醇，静置10min
16.4℃12000离心10min，弃上清
17.500ul乙醇，洗涤
18.4℃7500离心5min，吸干上清
19.干燥后用DEPC水溶解，量少20ul,量多50-100ul
所需溶液：
1DEPC处理水：
DEPC1ml加入1L双蒸水中，室温搅拌4h以上至完全溶解，高温灭菌30min。
1.2组织蛋白及细胞蛋白提取
组织蛋白的抽提
1.使用Biopulverizer冰冻粉碎组织并对粉碎的组织进行匀浆。
2.每100mg组织匀浆加入 T-PERTissueProteinExtractionReagent 试剂1ml。
操作全程在冰上进行，避免组织蛋白降解。
3.组织裂解液用BCA蛋白浓度测定试剂盒（BCAProteinAssayKit）检测蛋白浓度。
4.测定浓度后，向每管蛋白裂解液中加入5×LoadingBuffer以及β-巯基乙醇至1×浓度。
5.加入LoadingBuffer后混匀蛋白裂解液，后在100℃煮沸5-10min使蛋白变性，冻存于-20℃备用。
细胞蛋白的抽提
1.用l×PBS洗细胞三次，
2.10cm培养皿加入500μl的IP裂解液（IP细胞裂解液，Beyotime，碧云天，江苏海门）和PMSF，6cm培养皿加入220μl的IP裂解液和PMSF，六孔培养板中每孔加入100ul的IP细胞裂解液，
3.冰上裂解10min，刮下细胞；
4.然后12,000g、4℃离心10分钟，
5.将上清移入灭菌eppendorf管中，分装，
6.每管加入5×LoadingBuffer和β-巯基乙醇，100℃煮5min，冷却至室温后-80℃冰箱冻存。
BCA蛋白分析试剂盒进行蛋白定量
1.梯度稀释标准蛋白
2.将BCA反应试剂A与试剂B按照50:
1的比例混合，制成工作液;
3.酶标板中加入5ul标准蛋白或5ul样品，再加入100ulBCA工作液，震荡混匀
4.37℃孵育30min
5.酶标仪读取570nm吸光度值
6.以吸光度值为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。
根据标准曲线，计算样品的浓度。
2.组织RealtimeRT-PCR检测
2.1总RNA逆转录反应
逆转录合成cDNA：
RNA溶解后在0.65mlPCR管中配置反应溶液，反应体系见表1；逆转录反应前，所以样品RNA稀释到500ng/μL浓度作为逆转录反应模板。
表1.总RNA逆转录反应体系
成分
体积/反应（ul）
10×RTBuffer
2.0
25×dNTPMix（100nM）
0.8
10×RT随机引物
2.0
MultiscribeReverseTranscriptase
1.0
DEPC水
4.2
总体积/反应
10
加样后将反应管置于PCR仪，反应条件为37℃30分钟→85℃5分钟→4℃保存。
2.2目的基因的实时定量PCR检测
2.2.1RealtimePCR引物设计：
根据待检测基因标准序列，通过Primer6.0软件设计正义、反义PCR引物，并利用NCBI在线引物设计及特异性检验工具PrimerBLAST进行引物检验。
表2是待测基因的序列表。
表2.待检测基因及内参基因realtimePCR引物信息
Table2.RealtimePCRprimerforcandidategenesandendogenousreferencegene
基因名引物序列引物长度
CTHRC1F：
TGGTATTTCACATTCAATGGAGCTG25bp
R：
TGGGTAATCTGAACAAGTGCCAAC24bp
β-actinF：
TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC22bp
R：
ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG22bp
COL1A1F：
AAGAGGAAGGCCAAGTCGAG20bp
R：
CACACGTCTCGGTCATGGTA20bp
ACTA2F：
CAGCCAAGCACTGTCAGG18bp
R：
CCAGAGCCATTGTCACACAC21bp
TGFβ1F：
CCCTGGACACCAACTATTGC20bp
R：
CTTCCAGCCGAGGTCCTT19bp
F：
Forwardprimer;R：
Reverseprimer
2.2.2PCR反应体系：
在96孔板中配制20ul反应体系。
每反应设3个复孔，以β-actin为内参基因进行相对定量检测。
实验重复3次，Realtime扩增体系如表3；
表3.目的基因实时定量PCR扩增体系
Table3.Quantitativereal-timePCRamplificationsystemoftargetgenes
成分
浓度
体积（ul）
PowerSYBRGreenMasterMix
2×
10
ForwardPrimer
1uM
4
ReversePrimer
1uM
4
cDNA模版
2
总体积
20
将加好样品的96孔板放在ABI7300荧光定量PCR仪中进行反应，热循环体系如下：
预变性95℃30秒→变性95℃5秒→退火/延伸60℃31秒，PCR循环反应共40次。
数据由ABI7300系统软件SDS自动生成，以PCR循环数对Rn作扩增曲线来确定Ct值（即到达阈值Threshold所需的循环数）。
目的基因相对表达量以-actin校正后按以下公式计算：
2-Ct[Ct=Ct（目的基因）Ct（-actin）]。
数据分析：
用exel2003自带的软件分析，采用TTEST检验均数差异的显著性，以P＜0.05为具有统计学意义。
3.肝硬化组织芯片及组织切片免疫组化染色
3.1组织芯片的构成，组织芯片购于西安艾丽娜公司，包含80点，分布示意图如图1所示。
图1肝硬化组织芯片构成模式图
图2.肝硬化组织芯片HE染色图
3.2免疫组织化学染色
通风橱电话84093
①脱蜡至水化：
二甲苯1-20分钟>二甲苯2-20分钟>1/2二甲苯20分钟>无水乙醇10分钟>95%乙醇10分钟>85%乙醇10分钟>75%乙醇10分钟>PBS洗至水化（2*5分钟）；
②抗原热修复：
沸水加热0.01M柠檬酸钠抗原修复液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片或组织切片加热15分钟，然后自然冷却至室温；（α-SMA抗体染色不需抗原热修复步骤；）
③消除内源性过氧化物酶活性：
0.3%过氧化氢37℃孵育30分钟，PBS冲洗（2*5分钟），（用甲醇配置0.3%过氧化氢，现配现用；）
④抗原封闭：
10%牛血清（BSA，质量体积比PBS配置）室温封闭1小时；在湿盒内进行，结束后倾去血清，甩去多余液体，勿冲洗；
⑤一抗孵育：
滴加一抗150-200ul，4℃孵育过夜，PBS冲洗5分钟*3次；置湿盒；
Tips：
1、一抗需要摸浓度以及时间2、切片上勿留过多血清，否则等同稀释一抗3、一抗恢复室温后再配置4、一抗浓度高，孵育时间长易造成背景染色深5、一抗二抗都用1%BSA配置
⑥二抗孵育：
滴加二抗（山羊抗兔-HRP标记二抗1:
500稀释，兔抗小鼠-HRP标记二抗1:
200稀释）150-200ul，室温孵育1小时，置湿盒，PBS洗5分钟*3次；
⑦发色：
DAB40μL:
1000μL30s显色1-5分钟，显微镜下控制发色程度，自来水终止反应，PBS冲洗；
Tips：
1、DAB最好现配现用2、DAB显色时间很短（几秒到几十秒）就出现很深的棕褐色，说明抗体浓度过高，孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短富裕时间。
反之，说明浓度低或封闭时间过长
⑧苏木精复染1-2分钟，自来水冲洗10分钟；（复染时间看室温、溶液新旧，目标抗原定位，一半数秒到数分钟，胞浆蛋白时间长，胞核蛋白短）
⑨脱水，75%乙醇5分钟85%乙醇5分钟95%乙醇5分钟
无水乙醇5分钟1/2二甲苯10分钟二甲苯20分钟，晾干。
⑩中性树胶封片、镜检。
3.3免疫组化结果判读
以胞浆或胞外基质着色为阳性反应部位，对每个阵列点阳性细胞的阳性强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别打0、1、2、3分，着色阳性面积按无着色、着色<1/3、1/3～2/3、>2/3分别打0、1、2、3分，然后根据两项打分之和判断其结果：
0分为阴性（－），1～3分为弱阳性（+），4～6分者为阳性（＋＋），由两名有经验的病理科医生分别打分（注：
每张切片选择有代表性的区域，在400倍视野下进行计数，共计5个视野，取其平均值以避免随意性）。
所需溶液配制：
1柠檬酸钠修复液：
1LPH=6.0配方，二水柠檬酸三钠3克，一水合柠檬酸钠0.4克
210%BSA：
质量体积比m/v，1克BSA溶于10ml1xPBS中
3一抗及二抗溶液：
1%BSA按比例配制
43%或0.3%过氧化氢溶液：
甲醇与30%的过氧化氢配制
5DAB工作液：
按说明书配制
6中性树胶液：
纯树胶：
二甲苯=1:
1配制
4.组织蛋白WesternBlotting实验
4.1SDS-PAGE凝胶电泳
1、清洗玻璃板：
一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
2、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
3、根据蛋白分子量大小确定分离凝胶浓度和体积配制分离胶溶液，加入TEMED混匀后，立即将分离胶注入两层玻璃板间隙中。
灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加少量去离子水，液封后的胶凝的更快。
（加水液封时要慢，否则胶会被冲变型）于室温放置30min（为促进凝固也可放置于37℃恒温箱中）。
4、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
5、将配制好的浓缩胶立即注入玻璃板间隙中，将剩余空间灌满浓缩胶然后缓慢插入梳子，避免产生气泡，室温放置30min后浓缩胶凝固。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
6、在浓缩胶聚合后拔去梳子，用水冲洗一下浓缩胶孔，将凝胶放入电泳槽，加入1×电泳缓冲液。
7、加足够的电泳液后开始准备上样。
（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板）用白枪头贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。
将白枪头插至加样孔中缓慢加入样品。
（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出）每个泳道上样等量（20ug）蛋白样品进行电泳。
8、电泳条件：
60-70V电泳至样品跑过浓缩胶，增加电压至110-120V直至溴酚蓝刚刚跑出分离胶为止。
4.2电转膜
1.预先将电转缓冲液冷却至4℃，剪好4张滤纸与1张硝酸纤维素膜（NC膜，Millipore公司），膜的大小等同于分离胶大小（PVDF膜需置于甲醇中浸泡5min激活）。
2.预先将滤纸与NC膜用超纯水预湿，再用电转缓冲液浸泡5min以上，4℃放置。
在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
3.电泳结束后，轻轻撬开薄玻璃板，用电转缓冲液将分离胶冲洗干净，切掉浓缩胶。
4.将夹子打开按顺序白板—海绵—两层滤纸—NC膜—胶--两层滤纸--海绵—黑板，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。
一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。
膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
5.将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。
电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。
电转条件300mA60-80分钟（电转时，分离胶一侧靠近负极，NC膜一侧靠近正极）。
电转条件：
电转1块胶恒流200-300mA，80min或更长；同时并联电转两块胶恒定电流400mA，电转80min或更长时间；也可采用恒定电压电转，100V电转1-2h。
4.3封闭、孵育抗体、显色：
1.转膜结束，将膜放在TBS（Tris缓冲液）漂洗一次，与胶接触的一面膜始终朝上，扫膜时与胶接触的一面膜向下贴板。
2.将NC膜浸入5%脱脂牛奶或1%BSA（100mgBSA溶于10mlPBS）封闭孵育，室温一小时（此时可将目的条与内参条同时剪开分别孵育一抗）。
3.用1%BSA稀释一抗，将NC膜从封闭液取出后直接放入I抗稀释液中。
4.4℃孵育过夜。
5.I抗孵育结束后，回收一抗，取出NC膜，用TBS漂洗3x5min（脱色摇床进行）。
6.用TBS稀释荧光II抗[Anti-rabbitIgG（H+L）（DylightTM800Conjugate#5151）稀释比：
Fluorescentwesternblotting：
1:
15000；Anti-mouseIgG（H+L）（DylightTM680Conjugate#5470），稀释比：
Fluorescentwesternblotting：
1:
15000]，
7.将NC膜孵育在荧光II抗稀释液中，室温30min，TBS漂洗3x5min，避光在脱色摇床漂洗。
8.II抗孵育结束后，回收二抗，用LI-COR®BiosciencesOdyssey® InfraredImagingSystem进行图像扫描，保存图像并用ImageJ软件进行条带灰度值分析，扫膜时与胶接触的一面膜向下贴板。
注意：
1B-actin内参一抗来源为鼠，二抗应为鼠抗（DKK2为兔）
5.鼠肝原代细胞分离、培养
5.1大鼠肝脏原代星状细胞的分离、培养。
5.1.1原位消化大鼠以乙醚麻醉后，仰卧固定。
用75%乙醇消毒皮毛，呈十字形剖腹剪开皮肤及肌层暴露内脏。
显露门静脉、肠系膜上静脉后，用头皮针进行门静脉穿刺，见回血后进行Hank’s液灌注，灌注开始后剪断下腔静脉放血。
约灌注5min后，肝脏血液排出，颜色变黄，换为链霉蛋白酶（PronaseE，Roche）灌注约3min，消化肝实质细胞；灌注完毕后续用IV型胶原酶缓慢灌注约5min，消化肝脏内胶原等结缔组织，待肝脏软化后停止灌流。
5.1.2分散细胞快速取下肝脏，取出肝包膜以及韧带等结缔组织，将肝脏放入装有胶原酶/链霉蛋白酶E/DNA酶的50ml离心管中进行剪碎，然后置于37℃水浴锅中恒温震荡30min，转速180r/min。
通过机械力及酶消化进一步分散肝脏细胞。
5.1.3星状细胞的密度梯度分离细胞充分震荡消化后，加入等体积的含链霉素、青霉素双抗的Hank’s液进行终止反应。
用200目钢制筛网进行过滤细胞悬液，将滤过筛网的细胞悬液在540rpm转速下离心3min，留取上层悬液到新的50ml离心管中，1600rpm离心10min，取沉淀。
注意，离心机调节时，升速Accel可调至“9”，降速Decel应调至“1-3”。
用Hank液重悬细胞沉淀，将细胞悬液逐滴加入到18%Nycodenz密度梯度分离液表面，使细胞悬液悬于分离液之上。
使用2400rpm转速离心25min，小心吸取密度梯度分离液与上层液体间的絮状细胞层，吸取后置入新的离心管内，用DMEM培养液洗细胞1次，将细胞置于培养皿中培养，培养液要求用含20%FBS的DMEM培液培养。
次日换液，注意观察细胞形态及激活状态。
新鲜分离的HSC：
胞质内脂滴丰富、透光度好，边缘折光，呈小圆形外观。
5.2C57小鼠肝脏原代星状细胞的分离、培养。
C57小鼠肝脏原代星状细胞的分离方法和步骤与SD大鼠星状细胞分离方法相近。
关键区别在于，C57小鼠肝脏原代星状细胞的分离使用8.2%的Nycodenz密度梯度分离液。
5.3SD大鼠肝脏原代门脉成纤维细胞、血窦内皮细胞、Kupffer细胞的分离、培养。
图3所示。
6.细胞、组织免疫荧光实验
6.1准备细胞爬片用的圆形玻片 直径10mm的圆形盖玻片经1NHCl浸泡过夜后洗净，用70%乙醇充分浸泡5小时后晾干，放入无菌24孔板中，用紫外照射正反两面各半小时后备用。
用于免疫荧光实验的组织切片按照免疫组化的方法进行脱蜡至水化。
6.2对数生长期的LX-2细胞消化后用含10%FBS的DMEM培养基重悬后加入24孔板中（1×104/well），待其贴壁生长24小时后进行固定。
原代鼠肝星状细胞分离后，计数并以1×104/well密度种到24孔板中。
注意用于接种原代星状细胞的圆形玻片应提前用Fibronectin处理，便于HSC粘附。
6.3去除培养基并用1×PBS洗涤1次，加入1ml2%多聚甲醛固定15min；去除固定液，用1ml0.2%TritonX-100处理1min。
PBS洗三遍。
组织切片不需要多聚甲醛和Triton处理。
6.4用5%BSA封闭玻片1小时，如果BSA封闭效果不好，可以换用Dako公司生产的驴血清封闭，细胞及组织免疫荧光均需要进行封闭处理。
6.5吸干BSA，把玻片移至孔的中央，在其表面加入15ul一抗（CTHRC1：
50，α-SMA1:
500），室温孵育75min或者4℃过夜。
组织切片需要滴加一抗100-150ul，孵育在湿盒中进行。
6.6PBS洗涤6遍后充分吸干，再加入50ul荧光二抗，避光孵育75min。
6.7PBS洗涤6遍后充分吸干液体，加入50ulDAPI（工作浓度：
1-10μg/ml）避光染色30min染细胞核。
6.8PBS洗涤6遍后用抗荧光淬灭封片剂（碧云天）封片，暂存于-20摄氏度冰箱。
7.胶原晶格收缩（collagenlattice）实验
7.1CTHRC1过表达细胞和对照组LX-2细胞先用无血清DMEM培养液饥饿培养过夜；消化细胞，离心，计数；按下述配方配制胶原晶格，全程冰上进行（2mL）：
3mg/mL鼠尾胶原凝胶0.2mL
0.1NNaOH0.04mL
1.76×DMEM细胞培养液0.92mL
胎牛血清FBS0.19mL
DMEM含5×105/ml细胞0.67mL
按需要的总体积制成混合液体。
每个3.5cm皿加入混合液2mL，摇匀，置于37℃细胞培养箱培养；
7.2“摇松”，45min至1小时凝胶凝固后小心加入0.5mLDMEM培养液，小心上下、左右晃动使凝胶漂浮于液体中；每4-6小时观察凝胶面积大小，去培养皿盖拍照，拍照时培养皿旁边放直尺；
7.3IPP软件计算凝胶面积，EXEL自带的TTEST法统计分析。
7.4重组CTHRC1蛋白处理的胶原晶格收缩实验
配制collagen混合液，分为至少4个处理组，分别加入重组CTHRC1蛋白，0nm，1nm，20nm，50nm，每组内各三皿，每皿需加混合液2ml，计算总量。
配方3mg/mL鼠尾胶原凝胶3mL
0.1NNaOH0.6mL
1.76×DMEM细胞培养液13.6mL
胎牛血清FBS2.85mL
DMEM含5×105/ml细胞10mL
具体操作全部在冰上进行。
细胞准备：
将2个10cm皿长满的LX-2细胞消化，离心，加入11ml培养液重悬细胞，取出10ml细胞悬液加入到配好的collagen混合液中，用电动移液器反复吹打混匀，然后以7ml为一组将细胞/collagen混合液吸出分别加到4个50ml离心管中，在4个离心管中分别加入重组CTHRC1蛋白使蛋白浓度达到0nm、1nm、20nm、50nm。
将每个离心管的混合液用电动移液器充分混匀，以2ml/皿的量将混合液分别加到各个3.5cm培养皿中，2ml可分两次加。
培养箱培养。
1小时后进行“摇松”操作，每隔4小时拍照1次，注意拍照应关掉闪关灯，避免液体表面反光。
注意拍照时应戴口罩、不讲话，避免污染细胞。
8.重组CTHRC1蛋白亲和层析纯化
收集CTHRC1-V152转染的293细胞培养液，进行蛋白亲和层析纯化。
步骤如下。
8.1组装层析柱子。
层析柱由层析管、垫片、出口塞、顶盖以及管内琼脂糖磁珠组成。
CTHRC1-StrepIItagged融合蛋白所用的亲和Beads是由iba公司（Goettingen，Germany）生产的Strep-TactinSepharose。
StrepTagII是仅8个氨基酸的新型融合蛋白标签，V152载体是基于这个序列开发出的完备的融合蛋白真核生物表达系统。
StrepTag纯化技术是基于biotin（生物素）/streptavidin（抗生物素蛋白链菌素）特异性结合的原理。
StrepTagII可以结合到Streptavidin的生物素口袋上，Strep-Tactin是改造过的Streptavidin，Strep-Tactin与StrepTagII的亲和力超出普通Streptavidin约100倍，是非常高效的亲和层析分子。
将层析柱中加入2mlStrep-TactinSepharose。
8.2加入5mlBufferW洗涤层析柱1次。
8.3分次加入收集的细胞培养液，至总上样量20ml左右。
加入培养液后，让液体由重力控制缓慢流过层析柱，全程在4℃条件操作。
细胞培养液在上柱前进行离心，14,000rpm，5min，4℃。
8.4洗柱。
用BufferW洗柱5次，每次用BufferW2ml。
8.5用2.5mMBufferE洗脱蛋白。
每次加入BufferE1ml，分6次加入共6mlBufferE，分次接纳BufferE洗脱下来的蛋白溶液，依序标记，每管留出20μl蛋白溶液用于SDS-PAGE检测。
8.6柱子再生。
用BufferR洗柱子3次使柱
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