实验方法mh.docx

1、实验方法mh1. 组织RNA及组织、细胞蛋白提取1.1组织RNA提取1. 使用Biopulverizer冰冻粉碎组织并对粉碎的组织进行匀浆。匀浆或裂解后样品于1530孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。Trizol含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。2. 取100mg组织匀浆置于1.5ml EP管中，向每个EP管加入1ml Trizol 试剂并颠倒混匀。3. 打开管盖，向每管加入相当于Trizol体积1/5的氯仿，盖紧管盖，剧烈震荡混匀15秒，室温静置3min。4. 4低温离心机，12,000g 离心15min。5. 离心后自然分出上层无色水相和下层有机相，

2、RNA存在于上层。将上层水相液体小心吸到新的EP管中，并加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温静置5min，6. 4低温离心机，12,000g 离心10min。离心后，管底会出现白色沉淀，吸走上清液，7. 加入1ml的75%乙醇，洗涤RNA沉淀。上下颠倒后，8. 4，10,000g离心5分钟。9. 小心去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀510分钟。 10. 使用去RNA酶水彻底溶解RNA，用NanoDrop ND-1000测定RNA浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳法评估RNA完整性。获得的RNA溶液立即用于逆转录反应，合成cDNA。（RNA含量多50-100l；含量少20l）11. 细胞RNA12. 5

3、00ul Trizol 静置15min13. 5:1 加入100ul 三氯甲烷，震动30s，常温放置10min14. 4 12000离心15min15. 200ul上清移入EP管中，加入等量异丙醇，静置10min16. 4 12000离心10min，弃上清17. 500ul 乙醇，洗涤18. 4 7500离心5min，吸干上清19. 干燥后用DEPC水溶解，量少20ul,量多50-100ul所需溶液：1 DEPC处理水：DEPC 1ml加入1L双蒸水中，室温搅拌4h以上至完全溶解，高温灭菌30min。1.2 组织蛋白及细胞蛋白提取组织蛋白的抽提1. 使用Biopulverizer冰冻粉碎组织并

4、对粉碎的组织进行匀浆。2. 每100mg组织匀浆加入T-PER Tissue Protein Extraction Reagent试剂1ml。操作全程在冰上进行，避免组织蛋白降解。3. 组织裂解液用BCA蛋白浓度测定试剂盒（BCA Protein Assay Kit）检测蛋白浓度。4. 测定浓度后，向每管蛋白裂解液中加入5Loading Buffer以及-巯基乙醇至1浓度。5. 加入Loading Buffer 后混匀蛋白裂解液，后在100煮沸5-10min使蛋白变性，冻存于-20备用。细胞蛋白的抽提1. 用 lPBS洗细胞三次，2. 10cm培养皿加入500l的IP裂解液（IP细胞裂解液，B

5、eyotime，碧云天，江苏海门）和PMSF，6cm培养皿加入220l的IP裂解液和PMSF，六孔培养板中每孔加入100ul的IP细胞裂解液，3. 冰上裂解 10min，刮下细胞；4. 然后12,000g、4离心10分钟，5. 将上清移入灭菌eppendorf管中，分装，6. 每管加入5Loading Buffer和-巯基乙醇，100煮5min，冷却至室温后-80冰箱冻存。BCA蛋白分析试剂盒进行蛋白定量1. 梯度稀释标准蛋白2. 将BCA反应试剂A与试剂B按照50:1的比例混合，制成工作液;3. 酶标板中加入5ul标准蛋白或5ul样品，再加入100ulBCA工作液，震荡混匀4. 37孵育 3

6、0min5. 酶标仪读取 570nm吸光度值6. 以吸光度值为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线，计算样品的浓度。2. 组织Realtime RT-PCR检测2.1总RNA逆转录反应逆转录合成cDNA：RNA溶解后在0.65mlPCR管中配置反应溶液，反应体系见表1；逆转录反应前，所以样品RNA稀释到500ng/L浓度作为逆转录反应模板。表1. 总RNA逆转录反应体系成分体积/反应（ul）10 RT Buffer2.025 dNTP Mix (100nM)0.810 RT 随机引物2.0Multiscribe Reverse Transcriptase1.0DEPC水4.

7、2总体积/反应10加样后将反应管置于PCR仪，反应条件为37 30分钟85 5分钟4保存。2.2目的基因的实时定量PCR检测2.2.1 Realtime PCR引物设计：根据待检测基因标准序列，通过Primer6.0软件设计正义、反义PCR引物，并利用NCBI在线引物设计及特异性检验工具Primer BLAST进行引物检验。表2是待测基因的序列表。 表2. 待检测基因及内参基因realtime PCR引物信息Table 2. Realtime PCR primer for candidate genes and endogenous reference gene基因名 引物序列 引物长度CTH

8、RC1 F：TGGTATTTCACATTCAATGGAGCTG 25bp R：TGGGTAATCTGAACAAGTGCCAAC 24bp-actin F：TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC 22bp R：ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG 22bpCOL1A1 F：AAGAGGAAGGCCAAGTCGAG 20bp R：CACACGTCTCGGTCATGGTA 20bpACTA2 F：CAGCCAAGCACTGTCAGG 18bp R：CCAGAGCCATTGTCACACAC 21bpTGF1 F：CCCTGGACACCAACTATTGC 20bp R：CTTCCAGCCG

9、AGGTCCTT 19bpF：Forward primer; R：Reverse primer2.2.2 PCR反应体系：在96孔板中配制20ul反应体系。每反应设3个复孔，以-actin为内参基因进行相对定量检测。实验重复3次，Realtime扩增体系如表3；表3. 目的基因实时定量PCR扩增体系Table 3. Quantitative real-time PCR amplification system of target genes成分浓度体积（ul）Power SYBR Green Master Mix210Forward Primer1uM4Reverse Primer1uM4cD

10、NA模版2总体积20将加好样品的96孔板放在ABI7300荧光定量PCR仪中进行反应，热循环体系如下：预变性9530秒变性95 5秒退火/延伸60 31秒，PCR循环反应共40次。数据由ABI 7300系统软件SDS自动生成，以PCR循环数对Rn作扩增曲线来确定Ct值（即到达阈值Threshold所需的循环数）。目的基因相对表达量以-actin校正后按以下公式计算：2-Ct Ct = Ct (目的基因)Ct(-actin)。数据分析： 用exel2003自带的软件分析，采用TTEST检验均数差异的显著性，以P0.05为具有统计学意义。3. 肝硬化组织芯片及组织切片免疫组化染色3.1 组织芯片的

11、构成，组织芯片购于西安艾丽娜公司，包含80点，分布示意图如图1所示。图1 肝硬化组织芯片构成模式图 图2.肝硬化组织芯片HE染色图3.2免疫组织化学染色通风橱电话 84093脱蜡至水化：二甲苯1 -20分钟 二甲苯2 -20分钟 1/2二甲苯20分钟 无水乙醇10分钟 95%乙醇10分钟 85%乙醇10分钟 75%乙醇10分钟 PBS洗至水化(2*5分钟)；抗原热修复：沸水加热0.01M柠檬酸钠抗原修复液（pH6.0）至95左右，放入组织芯片或组织切片加热15分钟，然后自然冷却至室温；（-SMA抗体染色不需抗原热修复步骤；）消除内源性过氧化物酶活性：0.3%过氧化氢37孵育30分钟，PBS冲洗

12、 （2*5分钟），（用甲醇配置0.3%过氧化氢，现配现用；）抗原封闭：10%牛血清（BSA，质量体积比PBS配置）室温封闭1小时；在湿盒内进行，结束后倾去血清，甩去多余液体，勿冲洗；一抗孵育：滴加一抗150-200ul，4孵育过夜，PBS冲洗5分钟*3次；置湿盒；Tips：1、一抗需要摸浓度以及时间 2、切片上勿留过多血清，否则等同稀释一抗 3、一抗恢复室温后再配置 4、一抗浓度高，孵育时间长易造成背景染色深 5、一抗二抗都用1%BSA配置二抗孵育：滴加二抗（山羊抗兔-HRP标记二抗1:500稀释，兔抗小鼠-HRP标记二抗1:200稀释）150-200ul，室温孵育1小时，置湿盒，PBS洗5分

13、钟*3次；发色：DAB 40L:1000L 30s显色1-5分钟，显微镜下控制发色程度，自来水终止反应，PBS冲洗；Tips：1、DAB最好现配现用 2、DAB显色时间很短（几秒到几十秒）就出现很深的棕褐色，说明抗体浓度过高，孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短富裕时间。反之，说明浓度低或封闭时间过长苏木精复染1-2分钟，自来水冲洗10分钟；（复染时间看室温、溶液新旧，目标抗原定位，一半数秒到数分钟，胞浆蛋白时间长，胞核蛋白短）脱水，75%乙醇5分钟 85%乙醇5分钟 95%乙醇5分钟无水乙醇5分钟 1/2二甲苯10分钟 二甲苯20分钟，晾干。 中性树胶封片、镜检。3.3免疫组化结果判读以胞浆

14、或胞外基质着色为阳性反应部位，对每个阵列点阳性细胞的阳性强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别打0、1、2、3分，着色阳性面积按无着色、着色2/3分别打0、1、2、3分，然后根据两项打分之和判断其结果：0分为阴性（），13分为弱阳性（+），46分者为阳性（），由两名有经验的病理科医生分别打分（注：每张切片选择有代表性的区域，在400倍视野下进行计数，共计5个视野，取其平均值以避免随意性）。所需溶液配制：1 柠檬酸钠修复液：1L PH=6.0 配方，二水柠檬酸三钠 3克，一水合柠檬酸钠 0.4克2 10%BSA ：质量体积比 m/v， 1克BSA 溶于10ml 1xPBS中 3 一抗及二抗溶液

15、： 1%BSA按比例配制4 3%或0.3%过氧化氢溶液：甲醇与30%的过氧化氢配制5 DAB工作液：按说明书配制6 中性树胶液：纯树胶：二甲苯= 1:1配制4.组织蛋白Western Blotting 实验4.1 SDS-PAGE凝胶电泳 1、清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。 2、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。3、 根据蛋白分子量大小确定分离凝胶浓度和体积配制分离胶溶液，加入TEMED混匀后，立即将分离胶注入两层玻璃板间隙中。灌胶时，可用 10ml 枪吸取 5ml 胶沿玻璃放出，待胶

16、面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加少量去离子水，液封后的胶凝的更快。（加水液封时要慢，否则胶会被冲变型）于室温放置 30min（为促进凝固也可放置于37恒温箱中）。4、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等 3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。5、 将配制好的浓缩胶立即注入玻璃板间隙中，将剩余空间灌满浓缩胶然后缓慢插入梳子，避免产生气泡，室温放置30min后浓缩胶凝固。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。6、 在浓缩胶聚合后拔去梳子，用水冲洗一下浓缩胶孔，将凝胶

17、放入电泳槽，加入1电泳缓冲液。7、 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板）用白枪头贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将白枪头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出）每个泳道上样等量(20ug)蛋白样品进行电泳。8、 电泳条件：60-70V电泳至样品跑过浓缩胶，增加电压至110-120V直至溴酚蓝刚刚跑出分离胶为止。4.2 电转膜1. 预先将电转缓冲液冷却至4，剪好4张滤纸与1张硝酸纤维素膜（NC膜，Millipore公司），膜的大小等同于分离胶大小（PVDF膜需置于甲醇中浸泡5min激活）。2. 预先将滤纸与NC膜用超纯水

18、预湿，再用电转缓冲液浸泡5min以上，4放置。在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。3. 电泳结束后，轻轻撬开薄玻璃板，用电转缓冲液将分离胶冲洗干净，切掉浓缩胶。4. 将夹子打开按顺序白板海绵两层滤纸NC膜胶-两层滤纸-海绵黑板，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。5. 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。电转条件300mA 60-80分钟（电转时，分离胶一侧靠近

19、负极，NC膜一侧靠近正极）。电转条件：电转1块胶恒流200-300mA，80min或更长；同时并联电转两块胶恒定电流400mA，电转80min或更长时间；也可采用恒定电压电转，100V电转1-2h。4.3 封闭、孵育抗体、显色：1. 转膜结束，将膜放在TBS（Tris缓冲液）漂洗一次，与胶接触的一面膜始终朝上，扫膜时与胶接触的一面膜向下贴板。2. 将NC膜浸入5%脱脂牛奶或1%BSA（100mgBSA溶于10mlPBS）封闭孵育，室温一小时（此时可将目的条与内参条同时剪开分别孵育一抗）。3. 用1%BSA稀释一抗，将NC膜从封闭液取出后直接放入I抗稀释液中。4. 4孵育过夜。5. I抗孵育结束

20、后，回收一抗，取出NC膜，用TBS漂洗3x5min（脱色摇床进行）。6. 用TBS稀释荧光II抗Anti-rabbit IgG（H+L）（DylightTM 800 Conjugate#5151）稀释比：Fluorescent western blotting：1:15000；Anti-mouse IgG（H+L）（DylightTM 680 Conjugate# 5470），稀释比：Fluorescent western blotting：1:15000，7. 将NC膜孵育在荧光II抗稀释液中，室温30min，TBS漂洗3x5min，避光在脱色摇床漂洗。8. II抗孵育结束后，回收二抗，用L

21、I-COR Biosciences OdysseyInfrared Imaging System 进行图像扫描，保存图像并用ImageJ软件进行条带灰度值分析，扫膜时与胶接触的一面膜向下贴板。注意：1 B-actin内参一抗来源为鼠，二抗应为鼠抗（DKK2为兔）5.鼠肝原代细胞分离、培养5.1大鼠肝脏原代星状细胞的分离、培养。5.1.1 原位消化 大鼠以乙醚麻醉后，仰卧固定。用75%乙醇消毒皮毛，呈十字形剖腹剪开皮肤及肌层暴露内脏。显露门静脉、肠系膜上静脉后，用头皮针进行门静脉穿刺，见回血后进行Hanks液灌注，灌注开始后剪断下腔静脉放血。约灌注5min后，肝脏血液排出，颜色变黄，换为链霉蛋白

22、酶（PronaseE，Roche）灌注约3min，消化肝实质细胞；灌注完毕后续用IV型胶原酶缓慢灌注约5min，消化肝脏内胶原等结缔组织，待肝脏软化后停止灌流。5.1.2 分散细胞 快速取下肝脏，取出肝包膜以及韧带等结缔组织，将肝脏放入装有胶原酶/链霉蛋白酶E/DNA酶的50ml离心管中进行剪碎，然后置于37水浴锅中恒温震荡30min，转速180r/min。通过机械力及酶消化进一步分散肝脏细胞。 5.1.3 星状细胞的密度梯度分离 细胞充分震荡消化后，加入等体积的含链霉素、青霉素双抗的Hanks 液进行终止反应。用200目钢制筛网进行过滤细胞悬液，将滤过筛网的细胞悬液在540rpm转速下离心3

23、min，留取上层悬液到新的50ml离心管中，1600rpm离心10min，取沉淀。注意，离心机调节时，升速Accel可调至“9”，降速Decel应调至“1-3”。用Hank液重悬细胞沉淀，将细胞悬液逐滴加入到18%Nycodenz密度梯度分离液表面，使细胞悬液悬于分离液之上。使用2400rpm转速离心25min，小心吸取密度梯度分离液与上层液体间的絮状细胞层，吸取后置入新的离心管内，用DMEM培养液洗细胞1次，将细胞置于培养皿中培养，培养液要求用含20%FBS的DMEM培液培养。次日换液，注意观察细胞形态及激活状态。新鲜分离的HSC：胞质内脂滴丰富、透光度好，边缘折光，呈小圆形外观。5.2 C

24、57小鼠肝脏原代星状细胞的分离、培养。C57小鼠肝脏原代星状细胞的分离方法和步骤与SD大鼠星状细胞分离方法相近。关键区别在于，C57小鼠肝脏原代星状细胞的分离使用8.2%的Nycodenz密度梯度分离液。5.3 SD大鼠肝脏原代门脉成纤维细胞、血窦内皮细胞、Kupffer细胞的分离、培养。图3所示。6. 细胞、组织免疫荧光实验6.1 准备细胞爬片用的圆形玻片 直径10mm的圆形盖玻片经1N HCl浸泡过夜后洗净，用70%乙醇充分浸泡5小时后晾干，放入无菌24孔板中，用紫外照射正反两面各半小时后备用。用于免疫荧光实验的组织切片按照免疫组化的方法进行脱蜡至水化。6.2 对数生长期的LX-2细胞消化

25、后用含10%FBS的DMEM培养基重悬后加入24孔板中（1104/well），待其贴壁生长24小时后进行固定。原代鼠肝星状细胞分离后，计数并以1104/well密度种到24孔板中。注意用于接种原代星状细胞的圆形玻片应提前用Fibronectin处理，便于HSC粘附。6.3 去除培养基并用1PBS洗涤1次，加入1ml 2%多聚甲醛固定15min；去除固定液，用1ml 0.2%Triton X-100处理1min。PBS洗三遍。组织切片不需要多聚甲醛和Triton处理。6.4 用5%BSA封闭玻片1小时，如果BSA封闭效果不好，可以换用Dako公司生产的驴血清封闭，细胞及组织免疫荧光均需要进行封闭

26、处理。6.5 吸干BSA，把玻片移至孔的中央，在其表面加入15ul一抗（CTHRC1：50，-SMA 1:500），室温孵育75min或者4过夜。组织切片需要滴加一抗100-150ul，孵育在湿盒中进行。6.6 PBS洗涤6遍后充分吸干，再加入50ul荧光二抗，避光孵育75min。6.7 PBS洗涤6遍后充分吸干液体，加入50ul DAPI（工作浓度：1-10g/ml）避光染色30min染细胞核。6.8 PBS洗涤6遍后用抗荧光淬灭封片剂（碧云天）封片，暂存于-20摄氏度冰箱。7. 胶原晶格收缩（collagen lattice）实验7.1 CTHRC1过表达细胞和对照组LX-2细胞先用无血清

27、DMEM培养液饥饿培养过夜；消化细胞，离心，计数；按下述配方配制胶原晶格，全程冰上进行（2mL）： 3mg/mL鼠尾胶原凝胶 0.2mL 0.1N NaOH 0.04mL 1.76DMEM细胞培养液 0.92mL 胎牛血清FBS 0.19mL DMEM含5105/ml细胞 0.67mL按需要的总体积制成混合液体。 每个3.5cm皿加入混合液2mL，摇匀，置于37细胞培养箱培养；7.2 “摇松”，45min至1小时凝胶凝固后小心加入0.5mL DMEM培养液，小心上下、左右晃动使凝胶漂浮于液体中； 每4-6小时观察凝胶面积大小，去培养皿盖拍照，拍照时培养皿旁边放直尺；7.3 IPP软件计算凝胶面

28、积，EXEL自带的TTEST法统计分析。 7.4 重组CTHRC1蛋白处理的胶原晶格收缩实验 配制collagen混合液，分为至少4个处理组，分别加入重组CTHRC1蛋白，0nm，1nm，20nm，50nm，每组内各三皿，每皿需加混合液2ml，计算总量。配方 3mg/mL鼠尾胶原凝胶 3mL 0.1N NaOH 0.6mL 1.76DMEM细胞培养液 13.6mL 胎牛血清FBS 2.85mL DMEM含5105/ml细胞 10mL具体操作全部在冰上进行。细胞准备：将2个10cm皿长满的LX-2细胞消化，离心，加入11ml培养液重悬细胞，取出10ml细胞悬液加入到配好的collagen混合液中

29、，用电动移液器反复吹打混匀，然后以7ml为一组将细胞/collagen混合液吸出分别加到4个50ml离心管中，在4个离心管中分别加入重组CTHRC1蛋白使蛋白浓度达到0nm、1nm、20nm、50nm。将每个离心管的混合液用电动移液器充分混匀，以2ml/皿的量将混合液分别加到各个3.5cm培养皿中，2ml可分两次加。培养箱培养。1小时后进行“摇松”操作，每隔4小时拍照1次，注意拍照应关掉闪关灯，避免液体表面反光。注意拍照时应戴口罩、不讲话，避免污染细胞。8. 重组CTHRC1蛋白亲和层析纯化收集CTHRC1-V152转染的293细胞培养液，进行蛋白亲和层析纯化。步骤如下。8.1 组装层析柱子。

30、层析柱由层析管、垫片、出口塞、顶盖以及管内琼脂糖磁珠组成。CTHRC1-StrepII tagged 融合蛋白所用的亲和Beads是由iba公司（Goettingen，Germany）生产的Strep-Tactin Sepharose。Strep Tag II是仅8个氨基酸的新型融合蛋白标签，V152载体是基于这个序列开发出的完备的融合蛋白真核生物表达系统。Strep Tag 纯化技术是基于biotin（生物素）/streptavidin（抗生物素蛋白链菌素）特异性结合的原理。Strep Tag II 可以结合到Streptavidin的生物素口袋上，Strep-Tactin 是改造过的Str

31、eptavidin，Strep-Tactin与Strep Tag II的亲和力超出普通Streptavidin约100倍，是非常高效的亲和层析分子。将层析柱中加入2ml Strep-Tactin Sepharose。8.2 加入5ml Buffer W 洗涤层析柱1次。8.3 分次加入收集的细胞培养液，至总上样量20ml左右。加入培养液后，让液体由重力控制缓慢流过层析柱，全程在4条件操作。细胞培养液在上柱前进行离心，14,000 rpm，5min，4。8.4 洗柱。用Buffer W洗柱5次，每次用Buffer W 2ml。8.5 用2.5mM Buffer E 洗脱蛋白。每次加入Buffer E 1ml，分6次加入共6ml Buffer E，分次接纳Buffer E洗脱下来的蛋白溶液，依序标记，每管留出20l蛋白溶液用于SDS-PAGE检测。8.6 柱子再生。用Buffer R 洗柱子3次使柱