新教材 精品生物 选择性必修三 第3章 第2节 第2课时将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定.docx

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新教材精品生物选择性必修三第3章第2节第2课时将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定

第2课时　将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定

一、将目的基因导入受体细胞

1．转化的含义

目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2．转化的方法

（1）导入植物细胞

①花粉管通道法：

可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。

②农杆菌转化法：

将目的基因导入双子叶植物和裸子植物时最常用的方法。

a．农杆菌的特点：

农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的TDNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。

b．方法步骤：

目的基因插入Ti质粒的TDNA中→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。

（2）导入动物细胞

①方法：

显微注射技术。

②常用受体细胞：

受精卵。

（3）导入微生物细胞：

常以大肠杆菌作为受体细胞，一般先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。

（1）为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体（　　）

（2）目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法（　　）

（3）农杆菌感染植物的机理：

Ti质粒上的TDNA可转移到植物细胞内，并且与其染色体DNA整合在一起（　　）

（4）基因工程常用的受体细胞都是动植物的体细胞（　　）

答案　

（1）×　

（2）√　（3）√　（4）×

1．用花粉管通道法导入受体细胞的目的基因是否需要和载体结合？

试分析原因。

提示　需要。

因为目的基因只有和载体结合成基因表达载体才容易在受体细胞中稳定维持和表达。

2．在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程，一定要将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上的原因是农杆菌中的Ti质粒上的TDNA（可转移的DNA）可转移至被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体DNA上。

3．将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？

提示　基因表达载体（重组质粒）导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，利于重组质粒的导入。

4．植物基因工程常用的受体细胞为什么可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？

提示　植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。

5．科学家将外源基因导入绵羊的受精卵中，由于外源基因可能随机插入到受精卵的DNA中，因而有时会导致早期胚胎死亡，请分析可能的原因是什么？

提示　外源基因的插入可能使受精卵内生命活动必需的某些基因不能正常表达，因而有时会导致早期胚胎死亡。

6．将胰岛素基因的表达载体导入大肠杆菌，从大肠杆菌中获得的“胰岛素”未能达到期待的生物活性，导致这种差异的原因可能是什么？

提示　大肠杆菌是原核生物，无内质网、高尔基体等细胞器，大肠杆菌中基因表达获得的蛋白质未经加工。

归纳总结

　农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析

（1）两次拼接：

第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的TDNA上；第二次拼接（非人工操作）指被插入目的基因的TDNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。

（2）两次导入：

第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的TDNA导入受体细胞。

二、目的基因的检测与鉴定

1．分子水平的检测

（1）通过PCR等技术检测受体生物的染色体DNA上是否插入目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA。

（2）利用抗原—抗体杂交，检测目的基因是否翻译成相关蛋白质。

2．个体生物学水平的鉴定：

检测目的基因是否赋予转基因生物相应的特性及该特性的程度。

3．基因工程的基本操作程序

（1）抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达（　　）

（2）检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术（　　）

（3）应用PCR等技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达（　　）

（4）基因工程是否成功需进行个体生物学水平的鉴定（　　）

（5）基因工程的四个步骤中都涉及碱基互补配对原则（　　）

答案　

（1）√　

（2）√　（3）×　（4）√　（5）×

若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是什么？

提示　几丁质酶基因没有转录或转录的mRNA没有翻译。

1．将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。

将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，

此外，还有花粉管通道法等；将目的基因导入动物细胞采用最多的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞时，常用大肠杆菌作为受体细胞，应用的方法是Ca2＋处理法。

2．目的基因的检测与鉴定是实施基因工程的第四步。

分为分子水平的检测和个体生物学水平的鉴定。

分子水平的检测又包括通过PCR等技术检测受体生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA；利用抗原—抗体杂交检测目的基因是否翻译出蛋白质。

1．科学家利用现代生物技术，成功培育出世界上第一例体型比普通小鼠大1.8倍的转基因“超级小鼠”。

下列相关叙述正确的是（　　）

A．将含有目的基因的DNA直接注入到小鼠体内

B．该“超级小鼠”的培育利用到了显微注射技术

C．采用的受体细胞是雌性动物的卵细胞

D．目的基因导入受体细胞前不用提纯

答案　B

解析　将目的基因导入动物细胞的培育过程：

首先将含有目的基因的表达载体提纯，然后利用显微注射技术将含目的基因的表达载体导入受精卵。

2．检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因的常用方法是（　　）

A．PCR等技术

B．荧光分子标记技术

C．放射性同位素标记技术

D．显微注射技术

答案　A

3．下列关于目的基因的检测与鉴定的叙述，不正确的是（　　）

A．如受体细胞中检测到目的基因表达的蛋白质，可确定目的基因上游含有启动子

B．目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是目的基因是否转录出了mRNA

C．目的基因的分子检测不都需要PCR技术

D．目的基因的鉴定有时需要进行个体水平的鉴定

答案　B

解析　目的基因导入受体细胞后，首先要检测转基因生物（染色体）DNA是否插入了目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键，B错误。

4．基因工程是在DNA分子水平进行设计施工的，在基因操作的以下步骤中，不进行碱基互补配对的是（　　）

①用PCR技术扩增目的基因

②E.coliDNA连接酶连接目的基因与载体

③将目的基因导入受体细胞

④目的基因的检测和鉴定

⑤个体生物学水平的鉴定

A．①③B．③⑤

C．①⑤D．②③④

答案　B

解析　用PCR技术扩增目的基因，利用了DNA半保留复制的原理，需要进行碱基互补配对，①不符合题意；目的基因与载体结合时，进行碱基互补配对，②不符合题意；将目的基因导入受体细胞时，不进行碱基互补配对，③符合题意；检测目的基因时需要用到PCR等技术，进行碱基互补配对，④不符合题意；个体生物学水平的鉴定是从个体水平鉴定的，不进行碱基互补配对，⑤符合题意。

5．某研究小组为了研制预防禽流感病毒的疫苗，开展了前期研究工作。

其简要的操作流程如下图。

下列有关叙述错误的是（　　）

A．步骤①所代表的过程是逆转录

B．步骤②需使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶

C．步骤③可用CaCl2处理大肠杆菌，使其从感受态恢复到常态

D．检验Q蛋白的免疫反应特性，可用Q蛋白与患禽流感康复的鸡的血清进行抗原—抗体特异性反应实验

答案　C

解析　步骤③可用CaCl2处理大肠杆菌，使其从常态转化为感受态细胞。

6．农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。

下图为农杆菌转化法的示意图，请回答下列问题：

（1）在自然情况下，农杆菌对大多数____________没有侵染能力，利用农杆菌自然条件下侵染植物的特点，能实现_______________________________________________________的目的。

具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在TDNA片段，它具有可转移至受体细胞并整合到受体细胞________________上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到________________（部位）即可。

（2）根据TDNA这一转移特点，推测该DNA片段上可能含有控制__________________（酶的种类）合成的基因。

（3）植物基因工程中导入目的基因的方法除了农杆菌转化法之外，还可采取________________________。

答案　

（1）单子叶植物　将目的基因导入植物细胞　染色体的DNA　TDNA片段（内部）　

（2）DNA连接酶、限制酶　（3）花粉管通道法

解析　

（1）在自然条件下，农杆菌对大多数单子叶植物没有侵染能力，可侵染双子叶植物和裸子植物，利用其侵染性，可实现将目的基因导入植物细胞的目的。

真正可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上的是农杆菌TDNA片段，因此目的基因必须插入到该部位。

（2）根据TDNA这一转移特点，可以推测该DNA片段能控制合成DNA连接酶、限制酶以实现与双子叶植物和裸子植物细胞染色体DNA的整合。

A组　基础对点练

题组一　将目的基因导入受体细胞

1．基因工程中因受体细胞不同，目的基因导入的方法也不同，下列叙述不正确的是（　　）

A．将目的基因导入棉花细胞内常用花粉管通道法

B．将目的基因导入老鼠细胞内常用显微注射技术

C．将目的基因导入大肠杆菌内常用Ca2＋处理法

D．将目的基因导入酵母菌内常用农杆菌转化法

答案　D

2．某实验小组将人生长激素基因导入大肠杆菌细胞制备工程菌，下列相关叙述正确的是（　　）

A．人生长激素基因可以通过从下丘脑细胞获得的mRNA为模板经逆转录获得

B．将人的生长激素基因导入大肠杆菌常采用Ca2＋处理细胞

C．在生长激素基因的上游插入终止子的目的是保证目的基因成功转录

D．利用工程菌制备的和人体细胞合成的生长激素具有相同的空间结构

答案　B

解析　生长激素基因在垂体细胞中表达，在下丘脑细胞不表达，因此下丘脑细胞没有生长激素基因转录的mRNA，A错误；在生长激素基因的上游插入启动子的目的是保证目的基因成功转录，C错误；人体细胞合成的生长激素要在内质网、高尔基体中进行加工，大肠杆菌没有内质网、高尔基体，因此利用工程菌制备的生长激素和人体细胞合成的生长激素的空间结构不同，D错误。

3．抗菌肽对治疗癌症有一定作用，如图表示抗菌肽的合成过程。

下列相关说法正确的是（　　）

→

→

→

→

→

A．用PCR技术克隆目的基因不需要DNA解旋酶

B．基因表达载体包含起始密码子和终止密码子

C．用显微注射法导入基因表达载体

D．筛选菌种时用基因探针检测相关蛋白质

答案　A

解析　PCR技术中采用高温变性使DNA解旋，因此用PCR技术克隆目的基因不需要DNA解旋酶，A正确；基因表达载体包含启动子和终止子，而起始密码子和终止密码子在mRNA上，B错误；将基因表达载体导入酵母菌细胞时应用Ca2＋处理法，C错误；筛选菌种时可用基因探针检测相关基因或mRNA，不能用基因探针检测蛋白质，D错误。

题组二　目的基因的检测与鉴定

4．目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定与检测才能知道。

下列属于目的基因检测与鉴定的是（　　）

①检测受体细胞中是否有目的基因　②检测受体细胞中是否有致病基因　③检测目的基因是否转录出了mRNA　④检测目的基因是否翻译成蛋白质

A．①②③B．②③④

C．①③④D．①②④

答案　C

解析　基因工程中不需要检测受体细胞中是否有致病基因，②错误。

5．在检测抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子水平的是（　　）

A．观察害虫吃棉叶是否死亡

B．利用PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了目的基因

C．利用PCR等技术检测目的基因是否转录出了mRNA

D．检测目的基因表达产物蛋白质能否与相应的抗体形成杂交带

答案　A

解析　A项属于个体生物学水平的鉴定。

6．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。

下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是（　　）

A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因

B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA

C．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列

D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白

答案　D

解析　基因表达的产物是蛋白质，因此，只有在受体细胞中检测或提取到了相应蛋白质才能证明目的基因在受体细胞中完成了表达，A、C项只能说明完成了目的基因的导入，B项只能说明完成了目的基因的导入和目的基因的转录过程。

题组三　基因工程基本操作程序

7．下列有关基因工程的叙述，正确的是（　　）

A．目的基因可来自动物、植物或微生物，受体细胞只可来自动物、植物

B．所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列

C．选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快

D．只要目的基因进入了受体细胞就能成功地实现表达

答案　C

解析　目的基因和受体细胞均可来自动物、植物或微生物，A错误；限制酶能够识别某种特定的核苷酸序列，并在特定位点切割磷酸二酯键，但不是所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列，B错误；细菌作为受体细胞原因有多个，如细胞体积小、繁殖周期短、遗传物质少等，C正确；目的基因进入受体细胞中，由于操作失误和不可预测的干扰等，并不是所有受体细胞都能按照预先设计的方案进行重组和表达，真正能有效表达的只是一小部分，D错误。

8．中美科学家通过改变一种名为NR2B的基因研制出了转基因超级小鼠Hobbie－J，Hobbie－J比普通老鼠更加聪明，大脑运转更加迅速，它能够轻松完成迷宫任务。

下列关于Hobbie－J产生过程的描述，错误的是（　　）

A．NR2B基因可通过PCR技术进行扩增

B．改变后的NR2B基因作为目的基因，可直接注入小鼠受精卵内

C．通常采用显微注射技术将改变后的NR2B基因重组质粒导入小鼠受精卵内

D．可采用PCR等技术检测改变后的NR2B基因是否导入小鼠体内

答案　B

解析　改变后的NR2B基因作为目的基因，需要与载体结合后才可导入小鼠受精卵内，B错误。

9．如图所示为培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。

下列叙述正确的是（　　）

A．过程A需要的启动子，位于基因的下游，有了它才能驱动基因转录出mRNA

B．过程B需要用Ca2＋处理，以提高番茄细胞壁的通透性

C．抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上，就能正常表达

D．转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通过抗病毒接种实验进行鉴定

答案　D

解析　题图中过程A为构建基因表达载体，启动子位于基因的上游，选项A错误；Ca2＋处理只是使农杆菌细胞成为感受态细胞，选项B错误；抗植物病毒基因整合到番茄细胞的染色体上，不一定能正常表达，选项C错误。

10．如图是获得转基因抗虫棉的技术流程示意图。

请回答下列问题：

（1）A→B利用__________技术，其中②过程需要耐高温的________________酶才能完成。

（2）图中将目的基因导入棉花细胞需要经过③过程，该过程为构建______________，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在且可以遗传给下一代，并能表达和发挥作用。

（3）上述流程示意图中，将目的基因导入棉花细胞所采用的方法是________________法，该方法一般__________（填“适宜”或“不适宜”）用于将目的基因导入单子叶植物。

（4）欲确定抗虫基因在G体内是否表达，在个体水平上需要做__________实验。

如果抗虫基因导入成功，且与某条染色体的DNA整合起来，该转基因抗虫棉可视为杂合子，将该转基因抗虫棉自交一代，预计后代中抗虫植株占________。

答案　

（1）PCR　DNA聚合　

（2）基因表达载体　（3）农杆菌转化　不适宜　（4）抗虫接种　3/4

解析　图中③过程为构建基因表达载体，将目的基因导入棉花细胞所采用的方法是农杆菌转化法，农杆菌对大多数单子叶植物没有侵染能力。

由于抗虫基因只整合到一条染色体DNA上，则该抗虫棉产生的配子只有一半含有抗虫基因，雌雄配子随机结合，后代抗虫植株占3/4。

B组　综合强化练

11．在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是（　　）

A．用限制性内切核酸酶切割烟草花叶病毒的核酸

B．用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体

C．将重组DNA分子导入烟草原生质体

D．用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞

答案　A

解析　限制性内切核酸酶只能切割特定的脱氧核苷酸序列，而烟草花叶病毒的核酸是核糖核酸；构建基因表达载体时，需要用限制酶切割得到抗除草剂基因和切开载体，再用DNA连接酶将两者连接形成重组DNA；基因表达载体构建好之后，需要将重组DNA分子导入受体细胞（烟草原生质体）；基因工程的最后一步是目的基因的检测和鉴定，可以用含有除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞。

12．水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中由三种氨基酸构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记。

在转基因技术中，这种蛋白质的作用是（　　）

A．促使目的基因导入受体细胞中

B．促使目的基因在受体细胞中复制

C．使目的基因容易被检测出来

D．检测目的基因是否成功表达

答案　C

13．基因疫苗由病毒核酸的一段无毒序列制成，由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体构建而成。

以下叙述错误的是（　　）

A．被导入细胞后，能与宿主染色体整合

B．接种后若感染此病原微生物，则体内记忆B细胞会产生大量抗体

C．基因疫苗引起免疫反应前必须经过转录和翻译的过程

D．将疫苗基因转移到植物，可以生产可食用的疫苗

答案　B

解析　接种疫苗后人体产生针对该病原体的特异性免疫，若感染此病原微生物，则体内记忆B细胞会迅速增殖分化成效应B细胞，效应B细胞产生大量抗体，B错误。

14．蓝细菌拟核DNA上有控制叶绿素合成的chlL基因。

某科学家通过构建该种生物缺失chlL基因的变异株细胞，以研究chlL基因对叶绿素合成的控制，技术路线如图所示。

下列相关叙述错误的是（　　）

A．①②过程应使用不同的限制性内切核酸酶

B．①②过程都要使用DNA连接酶

C．终止密码子是基因表达载体的重要组成部分

D．若操作成功，可用含红霉素的培养基筛选出该变异株

答案　C

解析　限制性内切核酸酶有特异性，①②过程要切割的DNA序列不同，故应使用不同的限制性内切核酸酶；DNA连接酶的作用是连接被切开的磷酸二酯键，使chlL基因、红霉素抗性基因与质粒结合；基因表达载体由目的基因、启动子、终止子和标记基因等组成，终止密码子是mRNA上密码子的一种；变异株中chlL基因被重组基因替换，重组基因中有红霉素抗性基因，故可用含红霉素的培养基筛选出该变异株。

15．番茄叶片受害虫的损伤后，叶肉细胞迅速合成蛋白酶抑制剂，抑制害虫的消化作用。

人们尝试将番茄的蛋白酶抑制剂基因导入玉米，以对付猖獗的玉米螟。

下图为培育转基因抗虫玉米的流程图，下列描述正确的是（　　）

A．用限制性内切核酸酶切割番茄的DNA得到的产物就是蛋白酶抑制剂基因

B．用Ca2＋处理玉米受体细胞，有利于含目的基因的重组质粒导入

C．重组Ti质粒应有RNA聚合酶识别和结合的部位，以启动蛋白酶抑制剂基因的转录

D．若将目的基因导入玉米花粉细胞，通过花药离体培养可获得稳定遗传的转基因玉米

答案　C

解析　目的基因是用限制性内切核酸酶将DNA酶切后得到的，需筛选；Ca2＋用于处理细菌细胞；基因成功表达的前提是能转录和翻译，转录时需RNA聚合酶识别转录的起点才能启动；花药离体培养得到的是玉米的单倍体，需再用秋水仙素处理单倍体，使染色体加倍才能得到稳定遗传的转基因玉米。

16．2018年1月30日，加拿大食品检验局批准了第三种耐褐变转基因苹果品种上市。

研究人员通过RNA沉默技术，特异性降低苹果细胞内多酚氧化酶基因的表达水平，使苹果被切开后即使长时间暴露在空气中也不会被氧化褐变。

如图是此过程原理示意图，下列有关叙述错误的是（　　）

A．细胞内多酚氧化酶基因的表达包括图示中的①②过程

B．将目的基因成功导入苹果细胞中需限制酶、DNA连接酶和RNA聚合酶

C．“RNA沉默”的含义是mRNA不能翻译产生多酚氧化酶

D．目的基因的表达序列与多酚氧化酶基因的表达序列互补，且要同时在同一细胞内表达

答案　B

解析　图示中的①②过程分别为转录、翻译，多酚氧化酶基因的表达指多酚氧化酶基因控制多酚氧化酶合成的过程，需要经过转录、翻译两个过程，A项正确；将目的基因成功导入苹果细胞中需要构建基因表达载体，该过程需要限制酶和DNA连接酶，不需要RNA聚合酶，B项错误；据图可知，目的基因转录形成的mRNA可以和多酚氧化酶基因转录形成的mRNA互补配对，形成RNA双链，使mRNA不能与核糖体结合，从而阻止了翻译过程，C项正确；使目的基因转录形成的mRNA和多酚氧化酶基因转录形成的mRNA互补配对，应使目的基因的表达序列与多酚氧化酶基因的表达序列互补，且要同时在同一细胞内表达，D项正确。

17．（2019·延安市高二期末）人类复合型免疫缺陷症患者体内缺失腺苷酸脱氨酶（ADA）的基因，导致体内缺乏腺苷酸脱氨酶。

随着基因工程的不断发展，科学家利用基因治疗治愈了人类复合型免疫缺陷症，过程如下图所示，请分析并回答下列问题：

（1）基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤，图中①代表的步骤是__________________。

（2）图中③表示目的基因的检测与鉴定。

检测ADA基因是否存在于T细胞中，所采用的方法是________________________。

检测ADA基因是否转录时，未出现ADA基因转录的mRNA，从基因表达载体的构建角度推测，最可能的原因是___________________________________。

（3）基因工程中常用的载体，除上图所示以外，还有____________和__________________。

答案　

（1）基因表达载体的构建　

（2）PCR等技术　基因表达载体上的目的基因上游未加入启动子　（3）质粒　噬菌体

18．大肠杆菌pUC18质粒是基因工程中常用的载体。

某限制酶在此质粒上的唯一酶切位点位于LacZ基因中，如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出β半乳糖苷酶。

当培养基中含有IPTG和X－gal时，X－gal便会被β半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。

反之，则形成白色菌落。

下图表示利用此质粒实施基因工程的主要流程。

请分析并回答下列问题：

（1）对已获得的目的基因可利用______________技术进行扩增。

（2）目的基因插入质粒构建重组质粒的过程中，需要DNA连接酶恢复____________键。

（3）将试管Ⅰ中的物质和大肠杆菌共同置于试管Ⅱ的目的是________________；大肠杆菌需事先用Ca2＋进行处理，目的是_________