第一节 蛋白质结构与功能.docx

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第一节蛋白质结构与功能

第一章蛋白质的结构与功能

蛋白质译自albuminoid，该词来自拉丁文albumina（蛋白）。

1838年，德国化学家Mulder建议采用protein一词，立即得到瑞典著名化学家Berzelius的支持，逐渐被学术界普遍采用，该词源自希腊文προτο，意为最原始、最基本、最重要的。

可见，蛋白质自发现后一直受到化学家和生物学家的重视。

因为蛋白质是活细胞中含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，是各种生物功能主要的体现者。

蛋白质是以核酸为模板合成的，是基因表达的主要产物，因此人们将核酸称为“遗传大分子”，而把蛋白质称为“功能大分子”。

近半个多世纪以来，以核酸-蛋白质的结构、功能及其相互关系为中心，逐渐形成了分子生物学，成为带领生命科学进入新时代的龙头。

蛋白质是20种天然氨基酸缩合成的大分子，分子量从10kDa至数百kDa，有着极其复杂的结构。

1952年丹麦生物化学家Linderstrom-Lang提出蛋白质三级结构概念，把蛋白质研究纳入正轨。

越来越多的证据雄辩地表明，蛋白质的功能与其特殊的结构有着十分密切的内在联系，结构是特定功能的内在依据，功能则是特定结构的外在表现。

目前，对于蛋白质功能的认识包括以下三个方面：

①蛋白质对生命活动的贡献，即其生物学意义；②蛋白质的分子功能，即它参与完成的生化活动；③蛋白质的亚细胞定位，即其发挥功能的位置与环境。

以水通道蛋白（aquaporin）为例，它的四聚体定位于红细胞、肾细胞等的质膜中，形成一个通道，其功能就是允许水分子通过，为维持细胞内外渗透压平衡作出贡献。

因此，阐明蛋白质的分子结构及其与功能的关系是现代生物化学的基本命题，是揭示生命运动规律的必由之路，应当受到所有生命科学工作者的关注。

随着这些生物大分子及其复合物精确三维结构的测定以指数曲线增长，已累积了相当多的有关数据。

在此基础之上，十多年来形成了以研究生物大分子及其复合物和组装体的三维结构、运动和相互作用，以及它们与生物学功能和病理现象的关系为主要内容的新兴学科——结构生物学，把生命科学推进到新的时代。

1.1蛋白质的分子结构

按结构特点天然蛋白质可划分为：

球形蛋白质（globularprotein）、纤维状蛋白质（fibrousprotein）、膜蛋白（membraneprotein）和天然无序蛋白质（intrinsicallydisorderedprotein），其中，被研究得最早、最多和最深入的当属球形蛋白质。

1952年，丹麦生物化学家Linderstrom-Lang把球形蛋白质的分子结构划分为三个不同的组织层次（level,hierarchy）：

一级结构（primarystructure）指多肽链中氨基酸残基的数目、组成及其排列顺序（N-端→C-端），即由共价键维系的多肽链的一维（线性）结构，不涉及空间排列。

二级结构（secondarystructure）是多肽链主链（backbone）在氢键等次级键作用下折叠成的构象单元或局部空间结构，未考虑侧链的构象和整个肽链的空间排布。

三级结构（tertiarystructure）则指整个肽链的氨基酸残基侧链基团互相作用以及与环境间的相互作用下形成的三维结构。

1958年英国晶体学家Bernal发现寡聚蛋白由具有三级结构的亚基在次级键作用下结合而成，遂把寡聚体内亚基的空间排列称为四级结构（quaternarystructure）。

上述蛋白质分子一、二、三、四级结构的概念已被国际生物化学与分子生物学学会命名委员会正式采纳和定义。

1973年Rossman发现相邻的二级结构往往形成某种有规律的、空间上可辩认的、更高层次的折叠单元，称为超二级结构（super-secondarystructure）或折叠单元（foldingunit），主要涉及这些构象元件在空间上如何聚集。

与此同时，Wetlaufer观察到蛋白质分子中存在相对稳定的球状亚结构，其间由单肽链相互连接，命名为结构域（structuraldomain）。

图1.1和图1.2展示蛋白质（主要指球状蛋白）分子结构的不同层次及其相互联系。

1.1.1蛋白质的一级结构

1.1.1.1蛋白质氨基酸

氨基酸是蛋白质的构件分子。

在蛋白质生物合成中，mRNA指令20种α-氨基酸依次参入，形成特定的多肽链。

这20种蛋白质氨基酸除Gly外，其α碳原子均属不对称碳原子，因而都具有光学活性，且均为L-型氨基酸。

多肽链中氨基酸残基的侧链基团（R）各不相同，对多肽链的构象有很大影响。

蛋白质氨基酸的一些重要参数可参看表1.1。

表1.1蛋白质氨基酸的某些特性

氨基酸

缩写符号

分子量

（Da）

体积

（Å3）

可接触面积

（Å2）

疏水性

（K-D法相）

总频率*

（%）

在内部的频率（%）

在外部的频率（%）

转移自由能

（kcal·mol-1）

Ala（A）

71.08

88.6

115

1.8（7）

8.7

11.0

7.9

0.20

Arg（R）

156.20

173.4

225

－4.0（20）

3.1

0.4

4.0

－1.34

Asn（N）

114.11

117.7

160

－3.5（15）

5.2

2.0

6.3

－0.69

Asp（D）

115.05

111.1

150

－3.5（15）

6.1

2.2

7.4

－0.72

Cys（C）

103.13

108.5

135

2.5（5）

2.7

5.4

1.8

0.67

Gln（Q）

128.14

143.9

180

－3.5（15）

3.6

1.3

4.5

－0.74

Glu（E）

129.12

138.4

190

－3.5（15）

4.9

1.0

6.2

－1.09

Gly（G）

57.06

60.1

75

0.4（8）

9.0

9.7

8.8

0.06

His（H）

137.15

153.2

195

－3.2（14）

2.2

2.4

2.2

0.04

Ile（I）

113.17

166.7

175

4.5

（1）

4.9

10.5

3.0

0.74

Leu（L）

113.17

166.7

170

3.8（3）

6.5

12.8

4.3

0.65

Lys（K）

128.18

168.7

200

－3.9（19）

6.7

0.3

8.9

－2.00

Met（M）

131.21

162.9

185

1.9（6）

1.5

3.0

0.9

0.71

Phe（F）

147.18

189.9

210

2.8（4）

3.8

7.7

2.5

0.67

Pro（P）

97.12

122.7

145

－1.6（13）

4.0

2.2

4.7

－0.44

Ser（S）

87.08

89.0

115

－0.8（10）

7.0

5.0

8.9

－0.34

Thr（T）

101.11

116.1

140

－0.7（9）

6.4

4.6

7.1

－0.26

Trp（W）

186.21

227.8

255

－0.9（11）

1.6

2.7

1.3

0.45

Tyr（Y）

163.18

193.6

230

－1.3（12）

4.4

3.3

4.8

－0.22

Val（V）

99.14

140.0

155

4.2

（2）

6.6

12.7

4.6

0.61

*46种蛋白质共5436个残基中各种氨基酸残基所占百分比为总频率；在分子内部每种残基总数被内部残基总数（1396）除所得百分比为在内部的频率；在分子表面每种残基总数除以表面残基总数（4040）得到的百分比为在表面的频率。

根据侧链基团的性质，20种蛋白质氨基酸可划分为非极性氨基酸（Ile、Val、Leu、Phe、Ala、Pro、Met、Trp）和极性氨基酸，后者又可分为碱性氨基酸（Arg、Lys、His）、酸性氨基酸（Asp、Glu）和中性氨基酸（Gly、Cys、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln）。

一般认为，如果发生同类氨基酸取代，不会对蛋白质的结构和性质产生明显影响。

但是，如果这种取代发生在蛋白质的关键位点，尤其是许多同类氨基酸的翻译后修饰有很大区别，因而很可能出现突出的差异。

例如，Lys的ε-氨基与Arg的胍基都带有正电荷，但前者可被乙酰化、泛素化，后者可被ADPR基化；Tyr的苯环还可被碘化，羟基可被磷酸化，Phe则不能。

对嗜热微生物的研究表明，它们的蛋白质中明显偏爱一些氨基酸，如碱性氨基酸中的Lys，酸性氨基酸中的Glu，非极性氨基酸中的Ile等。

这种选择性很可能与嗜热菌蛋白质结构的稳定性和超强的耐热性相关。

除上述20种蛋白质氨基酸外，近几年在含硒蛋白质中发现的硒代半胱氨酸（Selenocysteine）实际上是在蛋白质合成过程中特殊的Ser-tRNA的修饰产物，识别终止密码子UAG，参入多肽链，在这些含硒蛋白质中具有重要的功能。

1.1.1.2蛋白质一级结构研究进展

蛋白质的一级结构即多肽链中氨基酸残基的排列顺序（N-端→C-端）是由基因编码的，是蛋白质高级结构的基础，因此一级结构的测定成为十分重要的基础研究。

1945—1955年，英国生物化学家Sanger率先完成了人胰岛素的序列测定。

1950年，瑞典科学家Edman发明了以他的名字命名的N-端测定法，并与Begg在1967年发明了序列仪，极大地推动了蛋白质一级结构的测定工作。

尽管如此，蛋白质一级结构测定仍是一项相当耗费时间和资金的工作。

因而测序方法和技术的改进与创新势在必行。

主要进展包括以下几方面：

（1）Edman降解试剂和方法的改进Edman最初使用异硫氰酸苯酯，在许多方面已不能满足测定需要，因此要求进一步提高Edman降解试剂的专一性，并使降解产物（氨基酸衍生物）易于鉴定和提高检测灵敏度。

如采用4-N，N-二甲基氨基偶氮苯-异硫氰酸酯/异硫氰酸苯酯双偶合法，可将测定精度提高1~2个数量级。

同位素标记的降解试剂可用于10－12mol的肽测序。

（2）序列仪的改进与创新早期的液相序列仪样品和试剂用量大，一次只能连续测定20~40个残基。

1980年代中期以来，发展并改良的固相法采用PVDF膜，与待测蛋白的C-端偶联，样品用量减至1~10nmol，一次可连续测定60个残基。

同时问世的气相测序仪灵敏度高，样品用量最少为5pmol，溶剂和试剂消耗为液相序列仪的10%，而且检测速度快。

（3）质谱法在蛋白质测序中的应用质谱法特别适用于小肽测序，质谱/气相色谱联用仪自动化水平高，数秒钟即可完成10个氨基酸的小肽测序。

由于把场致解吸附、等离子非吸附、离子喷射、快速电子冲击等技术引入质谱法，可省去测序中最耗时的分肽程序。

（4）核酸测序与蛋白质测序有机结合，相互印证，仍是当前的最佳选择。

据截止1997年底的统计，主要的蛋白质序列数据库SWISS-PROT已收入69000个蛋白的序列，其中绝大数是根据cDNA或DNA序列推测的。

1.1.2蛋白质的二级结构

1.1.2.1决定蛋白质高级结构的因素

（1）肽链的折叠模式取决于其特定的氨基酸序列

1960年代，C.Anfinsen牛胰RNase变性/复性实验证实（图1.3），多肽链中氨基酸序列包含着决定其三维结构的信息，称为蛋白质卷曲密码（codeofproteinfolding）或立体化学密码（stereochemistrycode），至今尚未完全破译。

（2）细胞内特有的微环境（pH、离子强度、水、温度等）是多肽链折叠成天然构象的重要环境因素。

（3）维持蛋白质三维结构的作用力：

蛋白质的三维构象主要靠二硫键和一些弱的相互作用或非共价键（次级键）来维持，包括氢键、盐键、疏水作用和VanderWaals力等，它们的键能见表1.2。

表1.2蛋白质中的二硫键和几种次级键的键能

键

键能a（kJ·mol－1）

二硫键

210

盐键

12~30

氢键

13~30

疏水作用

12~20b

VanderWaals力

4~8

a.键能指断裂该键所需的自由能。

b.此数值表示25℃下非极性侧链从蛋白质内部转移到水介质中所需的自由能。

此数值在一定温度范围内随温度升高而增加。

实际上它并不是键能，此能量的大部分并不用于肽链伸展过程中键的断裂。

1.1.2.2肽键的性质

Pauling（1945年）和Momany（1975年）先后测定了肽键的基本数据，如图1.4所示。

由于反式构型中两个Cα及其取代基团互相远离，而顺式构型中它们彼此接近，易发生空间位阻，反式构型比顺式构型更稳定。

但脯氨酸残基吡咯环δ碳原子在反式构型中与邻近的氨基酸侧链发生空间位阻，因此形成顺式构型。

由于肽键具有部分双键的性质，肽键两端有关原子（羰基C、羰基O、羰基C连接的Cα、氨基N、氨基H和氨基N连接的Cα）必须处于同一平面，称为肽平面。

绕C-Cα单键转动的为Ψ角，绕N-Cα单键转动的为Φ角，相邻的肽平面通过Cα彼此连接（图1.5）。

Ψ角以Cα-C对N-H键呈反式时为0°，Φ角以N-Cα对C-O键呈反式时为0°。

从Cα看，Cα-C键或N-Cα键顺时针方向旋转用“+”号表示，沿反时针方向旋转用“－”号表示。

分子内非键合原子间的最小距离已经测定，小于这个距离会产生空间位阻，实际上是不允许的。

正因为如此，图1.4（a）的反式肽键比（c）的顺序肽键更加稳定。

在理论上，Φ和Ψ都是

（

到+180°）的旋转范围。

由于肽链中氨基酸侧链基团的大小、形状和性质各异，有的相互吸引或排斥，有的相互作用，从而限制了肽平面间相对旋转的角度，实际允许的二面角只占很少一部分，正如Ramachandran根据13种蛋白质2500个残基的二面角作出构象图所示（图1.6）。

1.1.2.3蛋白质的二级结构

多肽链中的氨基酸均为L-型（除Gly），因而多肽链也具有手性，必须遵循一定的规律盘旋折叠。

其次，构成蛋白质的氨基酸侧链基团既有疏水的，又有亲水的，只有尽量减少疏水基团与水的接触，尽可能多地使亲水基团与水形成氢键，才有利于使其构象保持最低的能量分布。

在这些因素的驱动下，多态链的主链形成以下主要的构象单元：

（1）螺旋（helix）：

多肽链主链Cα-C-N的重复排列，使它容易形成有规律的卷曲构型，即形成螺旋。

通常用每圈螺旋的残基数（s）、氢键环中原子数（m）和螺旋的手性（R或L）表示不同的螺旋（图1.7）。

①α-螺旋：

3.613R，即每圈约3.6个残基，每个肽键N上的H与后面第四个残基上肽键羰基O之间形成氢键，其间包括13个原子，右手螺旋，是球蛋白中最常见的结构。

r=2.3Å，d=1.5Å；φ=－57°，ψ=－47°。

②310R螺旋：

仅见于α-螺旋最末一圈。

r=1.9Å,d=2.0Å;φ=－49°，ψ=－26°。

③π-螺旋：

4.416R，存在于某些天然蛋白质中，如过氧化氢酶等。

r=2.8Å,d=1.1Å。

此外在天然蛋白中还发现γ-螺旋（5.117）、δ-螺旋（4.314L）、胶原螺旋（3.3L）和3.613L等螺旋构象。

（2）β-片层（β-pleatedsheet）：

两股或多股几乎完全伸展的肽链并列聚集，靠主链肽键N上的H与相邻链羰基C上的O原子间规律的氢键，形成β-折叠片。

β-折叠片有的是平行的，有的是反平行的（图1.8）。

β-折叠片在蛋白质结构中占有重要地位，如丝蛋白、羽毛蛋白和一些球蛋白含有大量β-折叠片。

天然蛋白中的β-折叠片往往是非平面的，具有左手扭曲以便进一步组装。

（3）回折（reverseturn）：

肽链要折叠成坚实的球形，必须以某种方式多次改变其方向，如同一肽链形成的β-折叠股之间的连接肽。

3~4个氨基酸残基通过特殊的氢键系统使肽链走向改变180°称为回折或转角。

①β-回折：

由4个氨基酸残基组成，即第一个残基的羰基O与第四个氨基酸残基α-氨基上的H之间形成氢键，包括Ⅰ型和Ⅱ型，常分布在球蛋白表面，可占其全部残基的1/3（图1.9A和B）。

③γ-回折：

由3个氨基酸残基组成，第一个残基的羰基O与第三个残基的α-氨基H原子间形成氢键，常出现在反平行β-折叠股之间（图1.9C）。

（4）Ω环（Ωloop）：

多肽链中由6~16个氨基酸残基（多于β-回折的残基数，少于复合环的残基数）组成的环状节段，两端距离小于0.1nm,状似Ω字形，因此得名。

Ω环形成一个内部空腔，被环上残基的侧链基团包裹，成为致密的球状构象。

根据67种蛋白质、11885个残基的结构分析，处于α-螺旋、β-折叠、β-回折和Ω环中的残基分别占26%、19%、26%和21%。

Ω环以亲水残基为主，几乎总是位于蛋白质分子表面，与生物活性有关。

例如，溶菌酶18~25、44~52、60~75的残基构成三个Ω环，其中的Asn19、Arg21、Arg45、Asp48和Cys-64为其抗原决定簇的组分。

（5）连接条带：

伸展的肽链条带（straps）连接在结构元件之间，它们的长度、走向颇不规则，有的使肽链走向改变，有些使肽链微微弯曲，可使肽链密集，也可出现扭结，在蛋白质肽链的卷曲、折叠过程中具有明确的结构作用。

主链连接条带与之间一般不形成氢键，但常位于蛋白质分子表面，多数是带电荷或有极性的氨基酸残基，能与环境中水分子形成氢键。

比较不同种属的同源蛋白质氨基酸序列，发现连接区常有氨基酸残基的取代、插入、消除等变异，说明连接肽段具有易突变的特点。

从功能角度看，连接条带往往参与形成酶的活性部位或蛋白质的结合部位。

α-螺旋、β-片层可视为蛋白质三维结构的骨架，称为规范的或规正的结构元件，回折、Ω-环和连接条带则称为部分规正的二级结构，不仅把规正的结构元件连接成更复杂的空间结构，而且包含了大部分蛋白质生物学活性必需的基团。

根据部分球状蛋白质的三维结构，统计了各种氨基酸残基出现在α-螺旋、β-片层和β-回折与Ω-环四类二级结构中的几率（表1.3）。

应当指出，氨基酸残基特有的结构与其出现在某种二级结构中的几率存在着一定的联系，例如Pro、Gly、Asn等易形成β-转角，破坏α-螺旋的连续性。

但是，决定二级结构（和其它高级结构）的主要是氨基酸序列，涉及残基附近其它残基的近距离相互作用甚至远距离相互作用。

目前根据同源序列类推和数学模型计算，利用氨基酸序列预测二级结构的成功率最高可达75%。

随着蛋白质结构研究的不断深入和大型计算机的应用，预测成功率将会大大提高。

表1.3氨基酸残基出现在四种主要构象单元中的相对频率

氨基酸

α-螺旋

β-折叠片

β-回折

Ω-环

Ala

1.29

0.90

0.78

0.90

Cys

1.11

0.74

0.80

1.16

Leu

1.30

1.02

0.59

0.75

Met

1.47

0.97

0.39

0.57

Glu

1.44

0.75

1.00

0.93

Gln

1.27

0.80

0.97

0.90

His

1.22

1.80

0.69

1.01

Lys

1.23

0.77

0.96

1.02

Val

0.91

1.49

0.47

0.69

Ile

0.97

1.45

0.51

0.68

Phe

1.07

1.32

0.58

0.85

Tyr

0.72

1.25

1.05

1.06

Trp

0.99

1.14

0.75

0.90

Thr

0.82

1.21

1.03

1.00

Gly

0.56

0.92

1.64

1.35

Ser

0.82

0.95

1.33

1.41

Asp

1.04

0.72

1.41

1.29

Asn

0.90

0.76

1.28

1.48

Pro

0.52

0.64

1.91

1.33

Arg

0.96

0.99

0.88

1.00

蛋白质的二级结构具有某种可变性，例如，pH、温度、溶剂、配体等环境因素影响蛋白质的二级结构；某些序列相同的片断在不同蛋白质中或呈α-螺旋或为β-折叠，称为两可肽。

例如，磷酸丙糖异构酶112~116VAHAL呈α-螺旋；灰色链孢霉蛋白酶25~29同样的VAHAL却呈现β-折叠。

这是因为在磷酸丙糖异构酶中107~111片断倾向于形成α-螺旋；而在灰色链孢酶蛋白酶中20~24片断倾向于形成β-折叠。

1.1.3超二级结构

两个或多个相邻的构象元件被长度、走向不规则的连接肽彼此连接，进一步组合成有规律的、空间上可以辨认的局部折叠，称为超二级结构，是形成完整三维结构的过度性结构层次。

1.1.3.1简单超二级结构：

两个或少数构象单元与连接肽形成简单的超二级结构，又称模体（motif）。

从240种蛋白质的高分辨率结构中发现四种频繁出现的简单超二级结构。

（1）α-拐角（α-αcorner）：

两个α-螺旋经连接肽转90°的弯（图1.10A,B）。

（2）α-发夹（α-hairpin）：

两个α-螺旋经连接肽转180°（图1.10C,D）。

（3）β-发夹（β-hairpin）：

两个等长、反平行的β-折叠股被连接肽连接，两股之间形成1~6个氢键（图1.10F,G,H,I,J）。

（4）拱形结构（arch）：

两个不在同一平面的构象元件经连接肽连接而成，如一个α-螺旋与一个扭曲的β-折叠股形成的拱形结构（图1.10E,K）。

1.1.3.2复杂的超二级结构：

多个构象元件或简单超二级结构可进一步组合成复杂的超二级结构。

（1）复绕α-螺旋（coiled-coilα-helix）:

两个α-螺旋绕同一中心轴形成左手超螺旋，两螺旋的疏水残基多分布于螺旋接触面，侧链彼此啮合，螺距14nm。

常见于α-角蛋白、原肌球蛋白等纤维状蛋白中（图1.11）。

（2）βχβ-单元（βχβ-unit）：

两条平行的β-折叠股由一个χ结构连接，如χ为α-螺旋则为βαβ单元；如χ为β-折叠股则为βββ单元；如χ为无规卷曲则为βcβ单元。

βχβ单元有右手型和左手型（图1.12），在天然蛋白中仅观察到右手型的。

两组βαβ单元组合在一起，形成的超二级结构称为Rossmann折叠，常见于许多球蛋白（图1.13）。

（3）β-迂回（β-meander）：

三条或三条以上反平行β-折叠股由短链相连，可形成多种不同形式的结构（图1.14）。

（4）β-折叠筒（β-sheetbarrel）：

5~15条扭曲的β-折叠股可围成一个圆筒状结构，片层两端的β-折叠股之间以氢键相连，筒的中心由疏水侧链组成。

若β-折叠股排列方向相同，为平行式β-折叠筒：

如彼此反方向排列，则为反平行β-折叠桶（图1.15）。

1.1.3.3一些已知功能的超二级结构

有些超二级结构与某种功能相关，成为研究结构与功能联系的热点和从头设计蛋白质的重点，如下面介绍的一些与DNA相互作用的蛋白因子和钙结合蛋白特有的模体。

（1）螺旋-回折-螺旋（helix-turn-helix,HTH）：

最先发现于λ噬菌体cro阻遏蛋白（B.Matthews等，1983），由两个α-螺旋通过一个β-回折连接而成，含有66个氨基酸残基。

HTH羧基端螺旋可嵌入DNA双螺旋主槽中，螺旋暴露的氨基酸侧链基团与主槽中暴露的碱基之间形成专一的氢键（图1.16）。

其它调控蛋白，如E.coli的CAP、酵母的MA