第三章酶的分离纯化.docx
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第三章酶的分离纯化
第三章酶的分离纯化
第三章酶的分离纯化
第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤
第二节细胞破碎
第三节酶的抽提
第四节酶的纯化
第五节酶的纯度与产量
第六节酶的剂型与保存
第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤
1926年Summer制备了第一个结晶酶，自此以后，酶分离纯化工作进展很快，现已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净，并根据酶的作用特点，理化性质、发展了各种类型的分离纯化方法、试剂和设备。
一、基本原则
二、酶分离纯化的基本步骤
为了能成功地进行酶的分离纯化，需注意以下两个基本原则：
1.防止酶变性失效
防止酶变性失效是酶分离纯化工作很重要的问题，这一点在纯化后期尤为突出。
一般地，凡是用以预防蛋白质变性的方法与措施，都可考虑用于酶分离纯化工作中。
常见的措施有：
（1）低温：
除少数例外，所有操作应在低温下进行，有有机溶剂存在时，更应注意。
二、酶分离纯化的步骤
酶分离纯化时，一般要经过如下步骤：
1.细胞破碎：
除在体液中提取酶或胞外酶，一般都要进行细胞破碎，促使胞内酶溶出，以利于抽提。
2.抽提
3.纯化
下面分节对这三个基本环节加以介绍
第二节细胞破碎
细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。
一、机械破碎法二、物理破碎法
三、化学破碎法四、酶学破碎法：
通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。
1.机械捣碎法：
利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎，转速可高达10000r/min。
常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。
此法在实验宝和生产规模均可采用。
通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的方法，该称为物理破碎法。
物理破碎法包括如下几种方法；
1.温度差破碎法：
通过温度的突然变化使细胞破碎。
即将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将在较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。
温度差破碎法对那些较脆弱易破的细胞破碎效果较好。
超声波细胞破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系。
同时受细胞浓度、溶液粘度，pH值、温度以及离子强度等因素的影响，必须根据细胞种类以及酶的特性加以选择。
一般操作条件为：
音频10kHz或20kHz；功率100、150W；温度0～10℃；pH4~-7；处理时间3～10min，最好间隔几次操作；细胞浓度和溶液粘度不宜太高，最好采用对数生长期的细胞进行破碎。
超声波破碎在实验室应用具有简便、快捷、效果好等特点，特别适用于微生物细胞的破碎。
但要在大规模工业生产中应用，困难很多。
化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变而破坏的方法。
化学破碎法中，常用的化学试剂有：
有机溶剂和表面活性剂。
在一定条件下，通过外加的酶或细胞自身存在的酶的作用，使细胞破碎的方法称为酶学破碎法。
第三节酶的抽提
酶的抽提是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。
一、酶抽提的主要方法
二、酶提取过程中应注意事项
根据酶提取时，所采用的溶剂或溶液的不同，酶抽提的方法主要有盐溶液提取，酸溶液提取，碱溶液提取，有机溶剂提取等。
1．盐溶液提取：
大多数酶在一定浓度的盐存在条件下，酶的溶解度增加，即盐溶，但盐浓度不能太高，否则溶解度反而降低，即盐析。
故：
一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度控制在0.02—0.5mol/L。
例如：
用固体发酵生产的麸曲中的α--淀粉酶，糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mol／L的氯化钠溶液或0.02～0.05mol／L的磷酸缓冲液提取；酵母醇脱氢酶用0.5～0.6mol／L的磷酸氢二钠溶液提取；有少数酶，如霉菌产生的脂肪酶，用清水提取比盐溶液提取的效果较好。
在酶的提取过程中，为了提高提取率并防止酶变性失活，须注意以下几点：
1．温度：
通常抽提温度应控制在0-10oC（0-4oC）。
对某些耐温的酶，如胃蛋白酶等，可适当提高抽提温度，在37oC下保温抽提，效果较好。
因为提高温度、可提高酶的扩散速度，增加酶的溶解度，有利于酶的提取。
第四节酶的纯化
一、酶纯化的一般原则二、酶纯化中常用方法概述
三、沉淀分离法四、离心分离法
五、过滤与膜分离六、层析分离
七、电泳分离八、酶的结晶
九、浓缩与干燥十、酶纯化实例
三、沉淀分离法
沉淀分离是通过改变某些条件，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离。
在酶的分离纯化中，经常采用此法。
沉淀分离的方法有很多，如盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等。
1． 盐析沉淀法2． 等电点沉淀法
3．有机溶剂沉淀法4．复合沉淀法（选择性沉淀法）
四、离心分离法
离心是借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术，是酶的纯化过程中最为常用的一种方法。
进行离心分离时，应根据欲分离物质的大小，密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。
1．离心机种类及用途2．离心方法选择
3.离心条件的确定
五、过滤与膜分离
1.概述
2.粗滤
3．膜分离技术
六、层析分离
1．概述
2.吸附层析
3．离子交换层析
4．分子筛凝胶层析
5． 亲和层析
七、电泳分离
1、电泳基本原理2、影响电泳因素
3、主要电泳技术
八、酶的结晶
结晶是使溶质呈晶态从溶液中析出的过程，它是酶和蛋白质等生物大分子分离，纯化方法之一。
同时，结晶化合物也是生物大分子结构分析研究的材料。
1、蛋白质和酶结晶条件2、结晶方法
九、浓缩与干燥
浓缩与干燥都是使酶与溶剂（通常是水）分离的过程，是酶分离纯化过程中不可缺少的环节之一。
1.浓缩2.干燥
一、酶纯化的一般原则
在酶的提取液中，不可避免地杂有其它小分子和大分子物质，其中，小分子杂质在相继的纯化步骤中一般会自然地除去；而大分子杂质包括有：
核酸、粘多糖、其它蛋白质。
其中核酸和粘多糖易干扰后面的纯化、故最好预先除去。
核酸可加硫酸链霉素，聚乙烯亚胺，鱼精蛋白或MnCl2等，使之沉淀移去，也可使用核酸酶降解。
粘多糖则常用醋酸铅、乙醇、丹宁酸和离子型表面活性剂等处理。
余下就剩杂蛋白，而纯化的主要工作，也是较困难的工作，就是要将酶从杂蛋白中分离出来。
在进行酶与杂蛋白分离工作时，为获得较好的分离效果，应注意以下基本原则：
二、酶纯化工作中常用方法概述
现有的纯化方法都是以酶与杂蛋白在理化性质、稳定性上的差异以及酶的生物特性为依据而建立的，主要有如下几类：
1．根据溶解度建立的方法：
盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀法及选择性沉淀法，等电点沉淀法等。
2．根据分子颗粒大小、重量差别建立的方法：
离心法、凝胶过滤法、超过滤法。
1.盐析沉淀法
（1）盐析法的原理：
根据球蛋白在低盐浓度的溶液中，溶解度随盐离子强度升高而增加，表现为“盐溶”，而随着盐浓度继续升高，并超出某一上限时，其溶解度又会以不同速度下降，表现为“盐析”的这一特性，由于酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中，其溶解度存在差别而建立的一种纯化方法。
在盐析条件下，蛋白溶解度与溶液离子强度间有如下关系：
b.加固体（NH4）2SO4：
当蛋白溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时，以加固体（NH4）2SO4为宜，加入量可查表，也可以下式计算：
W=（g）
式中：
W：
1升S1饱和度溶液提高到S2饱和度时，需加固体（NH4）2SO4的量（g）
S2、S1：
分别为需达到的和原来溶液的（NH4）2SO4饱和度，
A、B：
常数，与温度有关，0oC时，A=0.27、B=707
20oC时,A=0.29、B=756
（3）盐析时的pH控制：
控制盐析pH可以提高纯化效果，一般盐析pH宜接近待纯化酶的等电点。
因为等电点时，蛋白质或酶的溶解度最低，有利于盐析。
另外，有些酶易与杂蛋白形成某种结合，从而干扰盐析，可控制pH<5或pH>9，使它们带相同电荷，以减少络合物形成，改善盐析效果。
（4）盐析时温度控制：
盐析温度以4oC为宜。
此条件下酶溶解度低而稳定性强
（5）盐析时的蛋白质浓度控制：
蛋白质浓度是盐析时一个十分重要但又易被忽视的因素。
一般蛋白浓度<100ug/ml，盐析沉淀很难形成，而当200ug/ml<蛋白浓度<1mg/ml，沉淀虽能形成，但耗时，且回收率不高。
因此为获得较好的盐析效果，蛋白浓度应在1mg/ml以上。
b.分级沉淀：
由于各种酶及某蛋白在不同浓度的盐溶液中，溶解度不同，故可采用分级沉淀法将其逐渐剥离。
例如：
兔肝SOD分离时，采用如下分的沉淀步骤：
反抽提法为：
先加（NH4）2SO4至50%饱和度，得沉淀，再将沉淀悬浮于42%饱和度（NH4）2SO4液中，溶解杂蛋白，而沉淀物即为RNA聚合酶。
反抽提法较一般分级沉淀法，具有一定的优越性：
①许多蛋白质从溶液中析出较为容易，是非特异性的，而要溶解却有相当高的特异性，故反抽提法可以比较细致地除去杂蛋白。
②反抽提法提取，酶不易失活，可能是因为酶蛋白在非溶解状态较能抵御蛋白酶攻击的缘故。
2.等电点沉淀法
（1）等电点沉淀法原理：
两性电解质在等电点时，溶解度最低，而不同的两性电解质是不同等电点，由此可将酶纯化。
3.有机溶剂沉淀法
（1）有机溶剂沉淀法原理：
利用不同蛋白质在有机溶剂中溶解度不同而使之分离的方法为有机溶剂沉淀法。
沉淀原理如下：
a.有机溶剂降低溶液的介电常数
由于分子间的引力是与溶剂的介电常数成反比，而有机溶剂能降低溶液的介电常数，加入有机溶剂，蛋白质分子间引力增加，溶解度降低。
（3）温度控制：
大多数蛋白质遇有机溶剂很不稳定，特别是在温度较高（室温）时，极易变性失效，故操作应在0oC以下进行。
有机溶剂必须先冷到-20oC—-15oC，并在搅拌下缓慢加入，沉淀析出后应尽快在低温下离心分离。
（4）pH控制：
pH以接近目的酶的等电点为宜。
（6）有机溶剂沉淀法的优缺点
a. 优点：
沉淀易于分离，过滤，分辨率高，且有机溶剂易除去或回收，适用于食品工业用酶制剂的制备。
b. 缺点：
易引起酶变性失活，故必须在低温下操作且析出沉淀要尽快分离，分离出的沉淀物应立即用水或缓冲液溶解，以尽量减少沉淀中有机溶剂的含量。
4．复合沉淀法（选择性沉淀法）
（1）复合沉淀法原理：
在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀，再用适当方法将酶从复合物中重新析出，此即为复合物沉淀法。
（2）酶沉淀剂：
能与酶形成复合物沉淀的物质称为酶（蛋白质）沉淀剂，常用的有单宁、聚丙烯酸等高分子聚合物。
聚丙烯酸（Polyalrylicacid，PAA）
PAA+酶⇄PAA-酶↓
PAA-酶+Ca2+⇄PAA-Ca2+↓+酶
PAA-Ca2++SO42-⇄CaSO4+PAA（可循环使用）
1．离心机种类及用途
（1）常速离心机：
转速8000r/min，用于细胞、细胞碎片、培养基残渣及粗结晶等较大颗粒的分离。
（2）高速离心机：
转速10000～25000r/min，用于各种沉淀物、细胞碎片及较大细胞器的分离。
（3）超速离心机：
转速25000～80000r/min，有制备用、分析用、制备分析两用3种类型。
用于生物大分子、细胞器、病毒等的分离纯化以及纯度检测、沉降系数和分子量的测定等。
2．离心方法选择:
主要有差速离心、密度梯度离心、等密度梯度离心。
（1）差速离心：
a.含义：
采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法，称为差速离心。
（3）等密度梯度离心
a.含义：
当欲分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，在离心力作用下，不同浮力密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，一直移动到与它们各自浮力密度恰好相等的位置（等密度点），形成区带。
这种方法称为等密度梯度离心。
或称为平衡等密度离心。
3.离心条件的确定
离心分离的效果好坏与诸多因素有关。
除了上述的离心机种类、离心方法，离心介质及密度梯度等以外，主要的是确定离心机的转速和离心时间。
此外还要注意离心介质溶液的pH值和温度等条件。
（2）离心时间
离心时间依据离心方法的不同而有所差别。
差速离心时间：
是指某种颗粒完全沉降到离心管底的时间。
等密梯度离心时间：
是指颗粒完全到达等密度点的平衡时间。
密度梯度离心时间：
是指形成界限分明的区带的时间。
对于密度梯度离心和等密度梯度离心所需的区带形成时间或平衡时间，影响因素很复杂，可通过试验后确定。
（4）差速离心分离实例：
差速离心分离细胞内组分
1.概述
（1）过滤含义：
借助于过滤介质将不同大小，不同形状的物质分离的技术。
（2）过滤介质有：
滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷及各种高分子膜。
其中以各种高分子膜为过滤介质的过滤称为膜分离技术包括微滤、超滤，反渗透等。
2.粗滤
（1）粗滤含义：
借助过滤介质截留悬浮液中直径大于2μm的大颗粒，而使固液分离的技术称为粗滤。
（2）粗滤常用介质：
滤纸、滤布、玻璃纤维、陶瓷滤板等。
（3）粗滤种类：
常压过滤、加压过滤、减压过滤。
b. 加压过滤：
加压过滤以压力泵或压缩空气为过滤的推动力。
在生产中常用的各种压滤机属于此类。
为了加快过滤速度和提高分离效果，可采用添加助滤剂，降低悬浮液粘度和适当提高温度等措施。
加压过滤设备比较简单；过滤速度较快，过滤效果较好，在生产中广泛使用。
3．膜分离技术：
（1）膜分离技术的含义：
借助于一定孔径的各种高分子薄膜，将不同大小、不同性状和不同特性的物质颗粒或分子分离的技术，统称为膜分离技术。
（2）膜分离技术常用的薄膜：
膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、硝酸纤维素、赛璐玢及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜，有时也可用动物膜和羊皮纸等。
b. 电场膜分离：
电场膜分离是在半透膜的两侧分别装上正，负极，在电场作用下，小分子的带电物质或离子向着与其本身所带电荷相反的电极移动，透过半透膜，而达到分离的目的。
电渗析和离子交换电渗析即属于此类。
用途：
透析主要用于酶、蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化，从中除去小分子物质，也可用于溶液的脱盐等。
透析设备简单，操作简便。
但透析时间长；若不更换水或缓冲液时，只扩散到膜内外平衡为止；透析结束时，透析袋内的保留液体积较大，浓度较低。
1．概述
（1）层析法基本原理：
2.吸附层析
（1）吸附层析含义：
3．离子交换层析：
（1）离子交换层析的含义：
一般规律是：
h.交换剂选择，应考虑交换容量，交换容量包括两个方面：
总交换容量：
每克干离子子交换剂上带有的总交换基数。
实效交换容量：
特定实验条件下，实际可用于交换的交换基数，它与介质的PH、离子强度、温度等有关，也因目的酶分子大小而显著不同。
一般情况，离子交换纤维素的容量小于凝胶，而对于离子交换凝胶，分子量为10,000—100,000的选择SephadexA-50或C-50，分子量大于400,000的，选择SephadexA-25或C-25，或Sepharose。
b.上柱：
打开离子交换柱出口阀，让柱内液体慢慢流出。
当液面刚好到达交换剂表面时，小心加进酶液，使酶液尽快均匀地分布于交换剂的全表面，然后均匀进入交换剂层进行离子交换。
继续加入酶液，直至交换剂的交换容量饱和为止。
c. 洗脱和收集：
上柱完毕后，先用水或缓冲液流过层析柱，使未吸附的物质洗出。
然后用适当的洗脱液，将吸附在离子交换剂上的离子按亲和力从小至大的顺序逐次洗脱下来，分别收集，以达到分离的目的。
注意：
酶液中除了欲得到的某种酶以外，还含有各种杂质。
酶和杂质与离子交换剂的亲和力不同，采用适当的洗脱液洗脱，可使酶与杂质分离。
d. 离子交换剂再生：
洗脱收集完毕后，为使离子交换剂再次使用，需要经过再生处理。
含杂质较少时，再生只要用酸，碱或盐进行转型即可。
但在离子交换剂含杂质较多的情况下，再生时要先经过酸、碱浸泡清洗，用水洗至中性，然后再转型，以备再次上柱进行交换。
如此循环往复，离子交换剂可反复使用一段较长的时间。
如离子交换柱要较长时间停用，可在再生后，加入适当的防腐剂以防止微生物生长。
阳离子交换树脂常用0.02％的叠氮钠作为防腐剂。
而阴离子交换树脂常用的防腐剂是10ppm的苯乙酸汞等。
4．分子筛凝胶层析
（1）凝胶层析基本原理：
是以各种多孔凝胶为固定相利用溶液中酶与其它杂质分子大小不同而进行的分离技术。
示意图如下：
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