最新兽医药理学教案第十五章动物毒理学基础.docx
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最新兽医药理学教案第十五章动物毒理学基础
第十五章动物毒理学基础
以科学研究为目的而进行科学饲养繁殖的动物称为实验动物。
实验动物学作为在现代科学带动崛起的一门以生命科学为主体，以医学、生物为核心的综合性独立的新兴学科，正以崭新的面貌，异乎寻常的速度，影响着整个生命科学各领域，成为生命科学研究的奠基学科和重要支撑条件，因而受到世界各国政府和科学家的重视，甚至作为衡量一个国家生物科学水平高低的标志之一。
食品毒理学的很多研究工作需要通过动物实验来进行。
使用实验动物进行科研的优点是花费人力、物力较少，时间短，易发现单因素与结果的关系，能提供大量有价值的可与人类生命活动现象相类比的资料。
在毒理学实验研究中，健康的实验动物是保证工作顺利进行和获得正确可靠的研究结果的重要条件。
食品毒理学研究外源化学物对于机体（特别是人体）的有害作用及其机制。
食品毒理学研究的主要手段是动物实验。
体内试验是以实验动物为模型，最终目的是通过外源化学物对实验动物的毒性反应，向人（原型）外推，以期评估外源化学物对人的危害及危险性。
体外实验主要用于筛选和预测急性毒性和机制研究；人体实验和流行病学调查则可进一步深化和证实在动物实验中所得到的资料。
实际上，食品毒理学作为一门实验科学是以动物实验为中心的，食品毒理学动物实验的设计、实施、结果观察和评价是毒理学研究的基本方法。
食品毒理学试验是对化学物安全性评价的主要手段，已为各国际组织或各国的行政部门所颁布的规程或指南列为常规试验，有称为法规毒理学试验（regulatorytoxico1ogytest），这类毒理学试验是以筛查和描述外来化学物的毒性为目的，属于描述毒理学范畴。
第一节食品毒理学实验的原则和局限性
一、食品毒理学实验的原则
在毒理学的试验中，有三个基本的原则。
第一个原则，化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人。
基本假设为：
①人是最敏感的动物物种；②人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢，与体重（或体表面积）相关。
这两个假设也是全部实验生物学和医学的前提。
以单位体表面积计算在人产生毒作用的剂量和实验动物通常相近似。
而以体重计算则人通常比实验动物敏感，差别可能达10倍。
因此可以利用安全系数来计算人的相对安全剂量。
已知人致癌物都对某种实验动物具有致癌性；实验动物致癌物是否都对人有致癌性，还不清楚，但这已作为动物致癌试验的基础。
一般认为，如果某一化学物对几个物种实验动物的毒性是相同的，则人的反应也可能是相似的。
第二个原则是实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜在危害的必需的和可靠的方法。
此原则是根据质反应的概念，随剂量或暴露增加，群体中效应发生率增加。
毒理学试验中，一般要设3个或3个以上剂量组，以观察剂量-反应（效应）关系，确定受试化学物引起毒效应及其毒性参数。
毒性试验的设计并不是为了证明化学品的安全性，而是为了表征化学品可能产生的毒作用。
仅仅检测受试化学物在人的暴露剂量是否引起毒效应是不够的。
当引起毒效应的最低剂量（LOAEL）与人的暴露剂量接近时，说明该化学物不安全。
当该剂量与人的暴露剂量有很大的距离（几十倍，几百倍或以上），才认为具有一定安全性，此距离越大，安全性越可靠。
如果在研究中所用的一系列的剂量不能引起毒性效应，则认为所用剂量还不足够高，应增加剂量，以确定受试化学品的毒性。
但如果在试验的最高剂量组的剂量与人可能的暴露剂量有足够的安全界限，则对于安全性评价来说未观察到毒效应的研究是可以接受的。
在毒理学试验中实验模型所需的动物总是远少于处于危险中的人群。
为了在少量动物得到有统计学意义的可靠的结果，需要应用相对较高的剂量，以使效应发生的频率足以检测。
例如，低达0.01％的癌症发生率，这意味着在100万人群中有100人发生癌症，此发生率太高，不能为公众接受。
在实验动物直接检测如此低发生率将至少需要30000只动物。
因此，别无选择，在毒理学试验中，对相对较少的实验动物必须以较高剂量进行试验，然后根据毒理学原则外推估计低剂量暴露的危险性。
第三个原则，成年的健康（雄性和雌性未孕）实验动物和人可能的暴露途径是基本的选择。
选用成年的健康（雄性和雌性未孕）实验动物是为了使实验结果具有代表性和可重复性。
以成年的健康（雄性和雌性未孕）实验动物作为一般人群的代表性实验模型，而将幼年和老年动物、妊娠的雌性动物、疾病状态作为特殊情况另作研究。
这样可降低实验对象的多样性，减少实验误差。
毒理学实验结果的敏感性取决于受试物处理引起毒效应强度和实验误差两个因素，处理引起的毒效应强，实验误差小，则实验结果的敏感性增加，反映受试物处理的真实效应，反之亦然。
在下文所述的实验设计是要规定实验条件，严格控制可能影响毒效应的各种因素，实施质量保证，降低实验误差。
只有这样，才能保证试验结果的准确性和可重复性，不能重复的实验结果是没有任何科学价值的。
外源化学物以不同途径染毒，实验动物表现的毒性可有很大差异，这是由于因染毒部位解剖生理特点不同，外源化学物吸收进入血液的速度和量也不同，首先到达的器官和组织也不同。
因此，毒理学试验中染毒途径的选择，应尽可能模拟人接触该受试物的方式。
二、食品毒理学实验的局限性
历史上，环境污染物及某些药物所引起的中毒和死亡多次发生，引起各国的重视，推动了毒理学的发展，各国政府主管部门制订和多次修订了有关药品和各种化学品安全性评价的规范或准则，希望在啮齿类和非啮齿类的毒理学研究能为有关候选新药和各种化学品提供安全性证据，但以动物的资料预测人的毒性的预测价值尚有待于研究。
Lumley（1990）和Igarashi（1994）根据有限的临床资料报告，发现对人的毒性约一半不能由临床前（动物）毒性研究预测。
Heywood（1983）报告27个化学物（大多为药品）的靶器官毒性在大鼠和狗（或猴）之间的相符率仅20％。
Olson等（1998）报告131种化学物对动物的毒性与人的毒性相符率，啮齿类为6％，非啮齿类（狗和猴）为28％，合并达36％，所有的物种相符率可达69％。
按照目前的规范，进行毒理学安全性评价，可以在一定程度上提高新药和各种化学品的使用安全性，但仍不能完全排除对人健康危害的风险。
WHO在《临床前药物安全性实验原则》的文件中指出“虽然事先对生物活性物质进行了最仔细彻底的研究，但给人使用时总是不可避免地要冒一定的风险。
”这就是利用动物实验的局限性，即动物实验的结果外推到人的不确定性。
用实验动物的毒理学实验资料外推到人群接触的安全性时，会有很大的不确定性。
这是因为，外源化学物的毒性作用受到许多因素的影响。
首先，实验动物和人对外源化学物的反应敏感性不同，有时甚至存在着质的差别。
虽然在毒理学实验中通过用两种或两种以上的动物，并尽可能选择与人对毒物反应相似的动物，但要完全避免物种差异是不可能的。
而且，实验动物不能述说涉及主观感觉的毒效应，如疼痛、腹胀、疲乏、头晕、眼花、耳鸣等，这些毒效应就难以或不可能发现。
在动物实验中，可观察到体征（sign），而没有症状（symptom）。
第二，在毒理学实验中，为了寻求毒作用的靶器官，并能在相对少量的动物上就能得到剂量-反应或剂量-效应关系，往往选用较大的染毒剂量，这一剂量通常要比人实际接触的剂量大得多。
有些化学物在高剂量和低剂量的毒性作用规律并不一定一致，如大剂量下出现的反应有可能是由于化学物在体内超过了机体的代谢能力，这就存在高剂量向低剂量外推的不确定性。
第三，毒理学实验所用动物数量有限，那些发生率很低的毒性反应，在少量动物中难以发现。
而化学物一旦进入市场，接触人群往往会很大。
这就存在小数量实验动物到大量人群外推的不确定性。
第四，实验动物一般都是实验室培育的品系，一般选用成年健康动物，反应较单一，而接触人群可以是不同的人种、种族，而且包括年老体弱及患病的个体，在对外源化学物毒性反应的易感性上存在很大差异。
以上这些都构成了从毒理学动物实验结果向人群安全性评价外推时的不确定因素。
第二节毒理学毒性评价试验的基本目的
毒理学实验的常规部分是毒性评价或安全性评价试验。
为了对受试物的毒性进行全面的测试，增强测试结果的可靠性，权威机构规定了评价程序，以保证毒性评价研究可以达到普遍能接受的最低要求和原则。
毒理学家认为毒理学试验程序应该有一定的灵活性。
对毒理学试验的原理和设计思路的深入理解，有助于研究者对评价程序的实施，在发现新的现象或线索时，可进行一些补充实验来证实，并可进一步研究其机制。
毒性评价或安全性评价方面的基本目的包括以下几点：
1.受试物毒作用的表现和性质。
在急性和慢性毒性试验中，观察受试物对机体的有害作用，对有害作用的观察应该是对每个实验动物进行全面的逐项的观察和记录。
发现有害作用是进行剂量-反应（效应）研究的前提。
2.剂量-反应（效应）研究。
剂量-反应（效应）研究是毒性评价和安全性评价的基础。
通过对不同有害作用的剂量-反应（效应）研究，可以得到该受试物的多种毒性参数。
在急性（致死性）毒性试验中，应该得到LD50，也可以得到LD01和MTD。
在急性非致死性毒性试验中，应该得到急性可观察到有害作用的最低剂量（LOAEL）和未观察到有害作用的剂量（NOAEL）。
在亚急性、亚慢性及慢性毒性试验中，应该得到相应的LOAEL和NOAEL。
在致突变、致癌和致畸等特殊毒性试验中，剂量-反应（效应）研究将为确定受试物是否具有这些特殊毒性提供依据。
在致畸试验也可得到LOAEL和NOAEL；在致突变、致癌试验中，尽管认为是无阈值的，但也可得到表观的LOAEL和NOAEL。
3.确定毒作用的靶器官。
确定受试物有害作用的靶器官，是毒理学研究的重要目的，以阐明受试物毒作用的特点，并为进一步的机制研究和毒性防治提供线索。
4.确定损害的可逆性。
一旦确认有害作用存在，就应研究停止接触后该损害是否可逆和消失，器官和组织功能是否能恢复，还是像化学致癌作用那样停止接触后损害继续发展?
毒性的可逆性关系到对人的危害评价，如果受损的器官组织能够修复并恢复正常功能，则可能接受较高危险性的接触水平。
当然，毒理学研究还可能有其他的目的和要求，例如毒作用的敏感检测指标和生物学标志、毒作用机制研究、受试物的毒物动力学和代谢研究、中毒的解救措施等。
对这些要求，应扩展常规试验的设计以包括有关的项目，或者另外设计和进行靶器官毒理学研究及机制毒理学研究。
第三节实验动物的选择和处理
毒理学的动物实验是以实验动物作为研究对象的，为获得可靠的研究结果，先决条件是正确地选用实验动物。
一、实验动物物种的选择
外源化学物的固有毒性往往在人和不同物种实验动物之间表现不同，物种差别可以表现在量方面，引起毒性的剂量差别，即毒性大小的差别，如有报道，对人138种化学物的敏感性为大鼠的1.8～10.5倍。
物种差别也可以表现在质方面（毒性效应的差别），如除草剂百草枯（对草快）对人引起肺损伤，而对狗则未见到。
因此，需要对实验动物物种进行选择。
物种间毒性反应差别的原因，可能归纳为解剖与生理学差异，遗传与代谢的差异等。
对实验动物物种选择的基本原则是：
选择对受试物在代谢、生物化学和毒理学特征与人最接近的物种；自然寿命不太长的物种；易于饲养和实验操作的物种；经济并易于获得的物种。
在选择实验动物时存在固有的限制。
可利用的物种不多，主要原因包括经济（购买和饲养的费用）、实验动物的寿命、行为和生活能力、处置，也许最重要的是对该物种“正常”生理和病理的资料，以及对所研究的毒性的敏感性。
要利用对受试物在代谢、生物化学和毒理学特征与人最接近的物种，这就需要了解实验动物物种和人对受试化学物的吸收、生物转化等资料，但这往往并不切合实际，因为首先需要进行一系列的比较研究，而对人体的资料在动物试验之前是很难得到的。
在毒理学研究中常用的实验动物物种如下：
大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗。
其他可能用到的实验动物有地鼠、猕猴、小型猪、鸡等。
其中，大鼠、小鼠、豚鼠和地鼠为啮齿目动物。
常用实验动物生物学和生理学参数见表5-1。
以上所述毒理学实验常用的实验动物各物种中，实际上没有一种完全符合上述物种选择的原则，目前常规选择物种的方式是利用两个物种，一种是啮齿类，另一种是非啮齿类。
系统毒性研究最常用的啮齿类是大鼠和小鼠，非啮齿类是狗。
豚鼠常用于皮肤刺激试验和致敏试验，兔常用于皮肤刺激试验和眼刺激试验。
遗传毒理学试验多用小鼠，致癌试验常用大鼠和小鼠，致畸试验常用大鼠、小鼠和兔。
迟发性神经毒性试验常用母鸡。
一般假设，如以与人相同的接触方式、大致相同的剂量水平，在两个物种有毒性反应，则人有可能以相同的方式发生毒性反应。
当不同物种的毒性反应有很大的差异时，必须研究外源化学物在不同物种的代谢、动力学及毒作用机制，然后才可将实验结果外推到人。
表5-1常用实验动物生物学和生理学参数
参数
猴
狗
猫
兔
大鼠
小鼠
豚鼠
地鼠
成体体重（kg）
3.5
14.0
3.3
3.7
0.45
0.035
0.43
0.12
寿命（a）
16
15
14
6
3
1.5
31
水消耗（ml/d）
450
350
320
300
35
6
145
30
饲料消耗（成本g/d）
150
400
100
180
10
5
12
10
成体代谢（cal／kgd）
158
80
80
110
130
600
100
250
体温（℃）
38.8
38.9
38.6
39l4
38l2
37.4
38.6
38.0
呼吸频率
50
20
25
53
85
160
90
83
（次／min）
（40～60）
（10～30）
（20～30）
（40～65）
（65～110）
（80～240）
（70～100）
（35～130）
心率（次／min）
200
100
120
200
328
600
300
450
血压mmHg
159／127
148／100
155／100
110／80
130/90
120／75
77/50
108/77
（收缩／舒张）
出生体重（g）
500～700
1100～2200
125
100
5-6
1.5
75～100
2.0
断乳时体重（g）
4400
5800
3000
100～1500
40～50
10～12
250
35
开眼（d）
出生当天
8～12
8～12
10
10～12
11
出生当天
15
妊娠（d）
168
63
63
31
21
20
67
16
性周期（d）
28
22
15～28
15～16
4～5
4～5
16～19
4
动情期（d）
1～2
7～13
9～19
30
1
1
1
1
窝数量
1
3～6
1～6
1～13
6～9
1～12
1～5
1～12
断乳年龄（周）
16～24
6
6～9
8
3～4
3
2
3～4
生殖年龄（月）
54
9
10
6～7
2～3
2
3
2
生殖期（年）
10～15
5～10
4
1～3
1
1
3
1
生殖季节
任何时间
春，秋
冬季2～3个月
任何时间
任何时间
任何时间
任何时间
任何时间
所需面积（tf2）*
6
8
3
3
0.4
0.4
0.7
0.34
环境温度（℃）
18～28
18～28
18～28
18～28
19～25
19～25
19～25
19～25
血容量（ML/Kg）
75
79
60
53
65
80
75
85
凝血时间（s）
90
180
120
300
60
14
60
143
HCT（％红细胞）
42
45
40
42
46
41
42
50
Hb（g／bl）
12.5
16.0
11.8
13.6
14.8
16.0
12.4
12.0
*所需面积（ft2），及为英尺，1ft＝30.48cm．引自：
参考书7，P13
二、实验动物品系的选择
品系（strain）是实验动物学的专用名词，指用计划交配的方法，获得起源于共同祖先的一群动物。
实验动物按遗传学控制分类可分为：
①近交系：
指全同胞兄妹或亲子之间连续交配20代以上而培育的纯品系动物。
如小鼠有津白I、津白Ⅱ、615，DBA／1和DBA／2，BALB/C，C3H，C57B／6J，A和A／He等。
②杂交群动物（杂交1代，F1），指两个不同的近交系之间有目的进行交配，所产生的第一代动物。
③封闭群：
一个种群在五年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所随机交配繁殖的动物群。
如昆明种小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、F344大鼠、Wistar大鼠、SD（Sprague-Dauley）大鼠等。
根据实验动物遗传的均一性排序，近交系最高、杂交群次之、封闭群较低。
不同品系实验动物对外源化学物毒性反应有差别，所以毒理学研究要选择适宜的品系，对某种外源化学物毒理学系列研究中应固定使用同一品系动物，以求研究结果的稳定性。
遗传毒理学一般利用啮齿类动物，主要是小鼠或大鼠。
如果有合适的理由，其他物种也可接受。
有的文献报告在小鼠骨髓微核试验MS／Ae品系比ddy，CD-1或BDF品系更敏感。
但一般认为还没能证明某一品系对所有的遗传毒性物质比其他品系都敏感。
在致癌试验中对实验动物的品系有一定的要求，特别重视有关病理损害的自发发生率。
例如，某些大鼠品系垂体肿瘤发生率高，则不适用于靶器官为内分泌系统的毒性研究。
又如B6C3F1雄小鼠肝肿瘤高发生率可能有碍于肝致癌反应的检测。
三、对实验动物微生物控制的选择
按微生物控制分类，实验动物分为四级，见表5-2。
对于毒性试验及毒理学研究应尽可能使用二级（或二级以上）的动物，以保证实验结果的可靠性。
表5-2实验动物微生物等级
级别
要求
I级
Ⅱ级
Ⅲ级
IV级
普通动物，应没有传染给人的疾病
清洁动物，除I级标准外，种系清楚，没有该动物特有的疾病
无特定病原体动物（SPF），除Ⅱ级标准外，动物为剖腹产或子宫切除产、按纯系要求繁殖，
在隔离器内或层流室内饲养，可有不致病细菌丛，没有致病病原体
无菌动物，在全封闭无菌条件下饲养的纯系动物，动物体外不带有任何微生物和寄生虫（包括绝大部分病毒）
四、个体选择
实验动物对外来化学物的毒性反应还存在个体差异，应注意实验动物的个体选择。
1.性别同一物种、同一品系的实验动物雌雄两性通常对相同外源化学物毒性反应类似但雌雄两性对化学物的毒性敏感性上存在着差别。
有文献报道在149种外源化学物中雌雄敏感性比值小鼠平均为0.92，大鼠为0.88，这种差别表现在实验动物性发育成熟开始，直至老年期。
可见雌雄两性动物的性激素性质和水平是关键因素，一般讲雄性动物体内微粒体细胞色素P-450酶系活性大于雌性动物，所以经该酶系降解解毒的外源化学物对雌性动物表现的毒性大，然而经该酶活化增毒的外源化学物却相反。
如果已知不同性别的动物对受试物敏感性不同，应选择敏感的性别。
如对性别差异不清楚，则应选用雌雄两种性别。
如实验中发现存在性别差异，则应将不同性别动物的实验结果分别统计分析。
在遗传毒理学体内试验中，对性别的选择有几种意见：
（1）对单个物种应用两种性别。
（2）对单个物种应用两种性别，除非已在一个性别得到阳性反应，就不必对另一种性别进行试验。
（3）对单个物种应用两种性别，除非经毒代动力学研究证明受试物（和其代谢产物）在雄性和雌性无差别和／或如果在确定剂量的预试验证明有相等毒性。
此假定在非遗传毒性与遗传毒性之间有相关。
（4）对单个物种常规用一种性别（雄性或雌性），除非预期／证明存在性别差异。
由于历史的原因UDS体内／体外试验常规用雄性大鼠。
一般来说，对于初次试验的受试物，应该采用两种性别。
对大鼠和小鼠各一种性别进行试验可能比单个物种两种性别提供更好的危害鉴定，但这需要更多的资料来证明。
2.年龄和体重实验动物同人类一样，生命全程大体上可区分三个阶段，即幼年期（从出生到性成熟之前）、成年期和老年期。
在成年期，各种激素（包括性激素）、代谢酶都处于高峰稳定期，并对外源化学物的毒性反应差异较小，且有代表性。
在幼年期和老年期，对外源化学物的生物转运和生物转化，靶器官和受体的敏感性均与成年期不同。
如有报道外源化学物对成年动物的致死剂量（或LD50）与新生动物比较，其比值在0.002～16之间，表明有的外源化学物对新生动物毒性低，也有的毒性反应强。
毒理学试验选用实验动物的年龄取决于试验的类型。
急性试验一般选用成年动物;慢性试验因实验周期长，应选用较年幼的或初断乳的动物，以使实验周期能复盖成年期。
实验动物的年龄应由其出生日期来定，但实际工作中常以动物的体重粗略地判断动物的年龄，作为挑选适龄动物的依据。
同一试验中，组内个体间体重差异应小于10％，各组间平均体重差异不应超过5％。
3.生理状态在毒理学试验中动物如出现妊娠，则影响体重及其他指标的检测结果，并且，性激素对外源化学物代谢转化有影响，故应选用未产未孕的雌性动物。
雌雄动物应分笼饲养。
但在某些试验如显性致死试验、致畸试验及繁殖试验等，则需有计划地合笼交配。
4.健康状况实验动物的健康状态对毒理学试验结果有很大的影响，因此应选用健康动物。
对于实验动物微生物控制的选择实际上是选择健康状况的一个重要指标，健康个体的选择还包括了其他方面。
健康动物应发育正常、体形健壮，无外观畸形，被毛浓密、有光泽、顺贴而不蓬乱，行动灵活、反应敏捷，眼睛明亮有神，表皮无溃疡和结痴，天然孔道干净无分泌物等。
为确保选择健康动物，一般在实验前观察5～7天。
对于大鼠和狗的亚慢性和慢性试验，可在实验前采血进行血液学和血液生化学检查，异常的动物应剔除；对狗应常规驱除肠道寄生虫。
合理的全营养饲料对维持实验动物健康和正常的生理活动是至关重要的。
高温与低温时外源化学物的毒性一般比常温为高。
气温升高而毒性增大，这种毒性变化可能是由于温度影响了毒物动力学所致。
高温、高湿环境共存时皮肤更易于外源化学物经皮肤吸收。
人工昼夜周期，即使动物处于人工调控的12小时白昼（早6点至晚6点）及12小时黑夜（晚6点至次日早6点），以稳定其生物时间节律。
在正常、健康的动物每天24小时的生理规律不尽相同，即存在着生物时间节律，对外源化学物的毒性反应也有昼夜性时间变化，因此出现毒理学新的分支学科，称为时间毒理学（Chronotoxicology）。
由于动物存在时间节律，外源化学物在不同时间表现的毒性反应有差别，所以在毒理学实际工作中，尤其是进行亚慢性和慢性染毒时，每日的染毒时间应固定一致，以防止出现时间毒性的影响。
而且采取动物生物样品（如血、尿等）进行各种指标的化验或一些生理功能的检查（如血压、体温等）也应固定时间。
根据我国的法规和有关规定，国家实行实验动物的质量监督和质量合格证制度。
实验动物的保种、饲育、供应和应用单位，由各级医学动物管理委员会进行定期监督、监测，并颁发实验动物和实验设施的合格证书（有效期5年）。
应用的实验动物必须有完整的资料。
进行动物实验的人员应经培训，取得资格认可（上岗证）。
实验动物的饲养设施、环境条件及饲料等必须符合有关的国家标准。
第四节食品毒理学试验设计要点
一、体内毒理学试验设计
1.剂量分组在毒理学试验中，最重要的就是研究剂量-反应（效应）关系，也就是当外源化学物染毒剂量增加，实验动物的毒性反应（效应）随之而增强。
剂量-反应（效应）关系的存在是确定外
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