454测序.docx

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454测序

第二代测序技术（Next-GenerationSequencing）

NGS之基础篇

  2001年，美、英、法、德、日、中六国合作，历时十年，耗资数十亿美元的人类基因组计划（HumanGenomeProject，HGP）宣告完成。

转眼又是十年过去，在此期间，各国科学家仍在为解读基因的密码而不懈努力，这其中最大的突破，就是第二代测序技术的推出。

HGP的顺利完成证明了我们有能力对自身的遗传信息进行研究，然而，高昂的成本、漫长的时间、巨大的人力需求，无不限制着对遗传密码的进一步认识。

从HGP开始的第一天期，科学家们就在寻求更好的方法来对基因组进行研究，“鸟枪法”就是其中之一。

2006年，美国X大奖基金会（www.xprize.org）设立了奖金高达1000万美元的基因组ArchonX大奖，旨在奖励第一个在10天内以低于100万美元的成本完成100个人类基因组测序的民间团队。

而罗氏（Roche）、应用生物系统（AppliedBiosystems，ABI）、Illumina三家公司先后推出了各自的第二代高通量测序平台，成为NGS领域的领头羊。

  2005年底，454公司推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统——GenomeSequencer20System，这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件。

随后，罗氏公司以1.55亿美元收购了454公司，并在2006年推出了更新的GSFLX测序系统，该系统可在10小时的运行中获得100万条读长（reads），4~6亿个碱基信息（basepair），且准确率达到99%以上。

2008年，GSFLX系统再次升级，通量提高了5倍，读长和准确率也有所增加。

虽然454GS测序平台也许不是市场占有率最高的测序仪，但截至2011年3月，利用该系统进行研究的论文已发表超过1000余篇，而它在读长上的优势明显胜于另两套系统，因此在从头测序（denovo）和宏基因组测序（metagenome）方面有着不可替代的地位。

  2006年，Solexa公司也推出了自己的NGS系统——GenomeAnalyzer，简称GA。

这套基于DNA簇（DNAcluster）、桥式PCR（BridgePCR）和可逆阻断（Reversibleterminator）等核心技术的系统具有高通量、低错误率、低成本、应用范围广等优点。

2007年，Illumina公司以6亿美元的高价收购了Solexa，使GA得以商品化。

GA最早期的版本一次运行可获得1Gb的数据，因此也有1GbAnalyzer的含义，而最新的Hiseq2000平台则能够在10天的运行中获得300Gb以上的数据，读取的碱基长度达到150bp左右。

更有消息称，Illumina已完成了600Gb的运行测试并在部分客户中开展了前期体验，Tb（1000Gb）级的测试Run也将于年内进行。

据不完全统计，Illumina公司已售出超过600台/套GAIIx和Hiseq2000平台，2010年仅深圳华大基因研究院一家就购买了128台Hiseq2000，一举成为全球最大的基因组测序与分析中心，Illumina公司在测序领域的影响力由此可见一斑。

  在Sanger测序时代，美国应用生物系统公司（ABI）一直是该行业的龙头老大，其垄断地位无人能撼，从早期的377到全自动化的3730xl，ABI的测序仪被广泛应用在基因组学研究的各个方面。

然而在第二代测序技术迅猛发展之初，ABI起步较晚，显得有些漫不经心。

直到2005年454公司推出GS平台，ABI的领先地位受到威胁，这才开始发力，迅速收购了研发NGS的一家小公司Agencourt，并于2007年推出了它的SOLiD测序平台。

此后SOLiD不断升级，目前已到SOLiD5版本（SOLiD5500xl）。

SOLiD的全称是SequencingbyOligoLigationDetection，即寡聚物连接检测测序，其基本原理是通过荧光标记的8碱基单链DNA探针与模板配对连接，发出不同的荧光信号，从而读取目标序列的碱基排列顺序。

在该方法下，目标序列的所有碱基都被读取了两遍，因此SOLiD最大的优势就是它的高准确率。

据悉，SOLiD5平台的测序通量已达到30Gb/天，成本低于60美元/Gb，准确率高达99.99%。

并且由于SOLiD系统采用的不是PCR反应进行DNA合成与测序，因此对于高GC含量的样本，SOLiD系统具有非常大的优势。

宣传视频：

454

没找到

Solexa

http:

//www.illumina.co...ht=485&iframe

SOLiD

http:

//media.invitroge...lid-5500.html

今天继续，454测序详解。

NGS之进阶篇

454的焦磷酸测序原理，简单来说就是利用DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用，将PCR反应每一个碱基（dNTP）的延伸与一次荧光信号的释放偶联起来，通过记录荧光信号的有无和强度，达到实时测定DNA序列的目的。

在454测序仪中，A、T、G、C四种碱基是分别存储在单独的试剂瓶中的，每步反应四种碱基依次加入反应池，当碱基配对结合，就会释放出一个焦磷酸（PPi），而这个焦磷酸在酶的作用下，将荧光素氧化成氧化荧光素，并发出光信号，从而读取出这一位置的碱基信息。

454测序仪的整个实验步骤可大致概括为：

样品处理、文库制备、emPCR、反应板准备、上机测序。

样品处理主要是针对大片段的DNA分子，如基因组DNA、Fosmid或BAC质粒等，利用超声或氮气打断将这些DNA分子片段化，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化，选择500-800bp的DNA片段。

对于非编码RNA或PCR产物，则不需要这一步骤。

文库制备包括接头连接和磁珠纯化两步，454的文库接头分A、B两种，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp（TCAG）的“key”碱基构成，其中B接头的5’端带有生物素（Biotin）标记，用于磁珠纯化步骤。

经过磁珠结合与DNA变性之后，只有A+目的片段+B形式的连接产物得以富集，另两种形式（AA、BB）的产物都被去除。

emPCR是454测序的一个关键步骤，将富集到的文库与测序磁珠、各反应物混合，加入特定的矿物油和表面活性剂，再利用振荡器剧烈振荡，使反应体系形成油包水（water-in-oil）的稳定乳浊液。

在理想条件下，每一个液滴，或称微反应器（microreactor）中将只包含一个磁珠和一条单链DNA，通过控制该步骤的条件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方个理想的微反应器。

经过PCR扩增后，每一个磁珠上将形成密集的DNA簇，这些DNA序列完全相同，即可用于后续的步骤。

454测序的反应板称为PTP（PicoTiterPlate），含有350万个由光纤组成的小孔，每个孔的直径为29μm，而测序磁珠的直径为20μm，因此每个孔中仅能容纳一个磁珠。

将磁珠与测序试剂加入PTP中，使之可用于上机测序。

测序步骤如前所述，四种碱基在泵的控制下依次加入反应板，反应完成后再洗去，每延伸一个或若干个碱基，就会发出一次光信号，通过记录信号的有无和强度，即可测定DNA序列。

454测序准确度较高，当读长超过400bp时，其准确性仍能达到99%以上，主要的错误来自于同聚物，即相同碱基的连续延伸，如ATTTG这样一段序列，A和G的读取没有问题，但T只记录了一次光信号，仅信号强度与ATG序列的T有所不同，因此同聚物越长，可能产生的误差就越大。

目前，由于454测序仪在读长上的明显优势，它在大基因组从头测序（denovo）、转录组分析、基因组结构分析等领域有着广泛的应用。

以下图片：

1.454GSFLX测序仪外观；2.3（4）种连接产物的磁珠纯化；3.PTP板与测序磁珠；4.454GS测序峰图；5.上机准备实拍图。

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[Lasteditedbyholyalaon2011-4-19at12:

01]

holyala（站内联系TA）

NGS之进阶篇二：

Solexa

IlluminaSolexa高通量测序平台可以说是目前“测序界”应用最广泛的NGS平台，它在兼容性、操作性和成本方面有着较大的优势，第一个亚洲人基因组“炎黄一号”、第一个非洲人基因组、熊猫基因组、家蚕基因组甲基化图谱等等，都是在该平台的支持下完成的。

从最初的GA到GAIIx，又更新换代为现在的Hiseq2000，Solexa测序平台的通量由1Gb/run一路提升至300Gb/run，预计在年内还将实现1Tb/run的升级，测序读长也从几十bp提高到150bp。

当年的人类基因组计划用了10年时间完成了一个基因组的精细图，而现在使用Hiseq2000测序仪只需10天左右的时间，即可完成至少3个人类全基因组的测序工作，NGS测序能力的飞速发展甚至超过了IT届的摩尔定律。

与454一样，Solexa测序平台所采用的也是SBS（Sequencing-by-Synthesis，边合成边测序）的方式，并且也利用光信号收集信息。

有所不同的是，Solexa并没有采用间接反应（焦磷酸氧化荧光素）的形式激发光信号，而是直接在dNTP上连接荧光基团和阻断基团，通过“去阻断—延伸—激发荧光—切割荧光基团—去阻断”这样一个循环的方法来依次读取目的DNA上的碱基排列顺序。

如下图所示，该原理在基础篇的Solexa宣传视频中亦有提及。

由于采用了可逆阻断技术（即在dNTP上连接可剪切的阻断基团），Solexa测序的每一步只延伸一个碱基，不会出现类似于454测序的同聚物影响准确性的问题，因此其单碱基准确性较高，但随着读长的增加，荧光信号会有所衰弱，所以越“靠后”的碱基准确性会逐渐降低，这也是Solexa测序读长受限的一个主要因素。

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Solexa平台的应用范围极广，几乎囊括了目前基因组学研究的所有方面，例如基因组从头测序（denovo）、重测序（re-sequencing）、基因组结构分析、转录组测序、表达谱分析、小RNA及非编码RNA测序、表观遗传学研究等等。

然而，应用该平台的核心过程是大致相同的，这也为它的兼容性提供了很大的便利。

Solexa测序的实验流程主要包括：

样品处理、文库制备、芯片准备及上级测序。

根据实验目的和样品来源的不同，Solexa测序的样品处理也有所不同，基因组DNA需进行打断及片段选择，totalRNA需富集mRNA或小RNA，mRNA也要进行片段化处理，ChIP（染色质免疫共沉淀）、甲基化及PCR产物等都有各自的处理方式，需要实验人员根据情况进行选择。

以基因组DNA测序为例，在获得样本后，首先需要对DNA进行检测，保证样本的浓度和完整性符合实验要求，然后使用超声或氮气打断，将这些DNA分子片段化，这步与454的样品处理类似，但不需要收集特定范围的DNA片段即可用于下一步实验。

文库制备过程可分为末端修复、3’端腺苷化、接头连接、片段选择、PCR扩增以及文库纯化六个步骤。

末端修复是将片段化的DNA分子在几种酶的作用下，补齐随机打断造成的黏性末端而成为平末端。

3’腺苷化目的是在DNA双链的3’端加上dATP，以便于下一步的接头连接。

Solexa文库制备所用的接头（adapter）是一个一端互补，另一端开叉Y字形DNA片段，互补的部分5’端有一个T，可与3’腺苷化的DNA进行T-A连接，开叉的部分则是为了通过PCR扩增引入测序引物P5和P7的互补序列。

接头连接完成后，再采用采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化获得特定大小的片段（通常为目的片段大小+120bp），如构建200bp文库，则回收320±20bp的DNA。

之后再进行PCR扩增和纯化，即得到可用与上机测序的文库。

此时的文库DNA由待测序列、测序接头、引物互补序列及index标签序列（如非index文库则无），如下图所示。

[eimg]f6/ff/457557_1303294259_858.jpg[/eimg]

芯片准备与上机测序主要由机器完成，在此不做赘述，若想做进一步了解，可访问Illumina官方网站的技术支持：

http:

//www.illumina.co...chnology.ilmn。

同样，最后献上几张图片：

1.cBot芯片制备仪与Hiseq2000测序仪；2.SolexaGAII测序芯片；3.Solexa测序光信号采集直观图；4.Solexa测序流程与原理示意图。

[eimg]5c/0b/457557_1303294170_124.jpg[/eimg]

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[Lasteditedbyholyalaon2011-4-20at18:

11]

I原理简介：

    测序引物与单链PCR扩增的DNA模板相结合。

然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，以及底物APS和荧光素一起孵育。

    四种dNTP（dATP，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模扳配对（A—T，C—G），此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。

而且释放出来的Ppi的量与和模板结合的dNTP的量成正比。

      ATP硫酸化酶在腺苷酰硫酸存在的情况下催化PPi形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的萤光素向氧合萤光素的转化，氧合萤光素发出与ATP量成正比的可见光信号。

光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。

每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。

    ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。

    然后加入下一种dNTP。

最终待测序列顺序，即可从反应光强的信号峰中读出。

在此过程之中有几点值得注意的是，在体系中使用的是dATPS而非dATP，因为dATPS不是荧光素酶的底物，而且DNA聚合酶对dATPS的催化效率更高。

而且在系统之中，底物的浓度已经最佳化，使得dNTP的降解速度慢于它的掺入速度，ATP的合成速度快于水解速度，其中三磷酸腺苷双磷酸酶的特异浓度，可以保证降解完全，使系统复原。

II操作步骤：

    在使用前，保证所有溶液都达到室温；

    在PSQ96板中预先加入45μl含有0.3μM测序引物的annealingbuffer；

    使用Vertex混匀Sepharosebeads；

    将需要使用的sepharoebeads总量（每样本3μl）转移到一个Eppendorf管中；

    在sepharosebead中加入bindingbuffer，使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀；

    将以上混合物加入PCR产物（50μl反应体积）中，每样本50μl；

    将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得beads与生物素结合，对于较长片段，可适当延长混匀时间；

    在Vacuumprepworkstation中，四个样品板中依次加入180ml高纯水、70％乙醇、washingbuffer和120mlDenaturationbuffer；

    打开vacuumprepworkstation的泵，将vacuumpreptool在高纯水中清洗30秒；

    然后将vacuumpreptool移到PCR板中，抓取sepharosebeads（请在beads与PCR产物结合后三分钟内完成此操作）；

    拿起PCR板，检查是否大部分beads都被吸附在了vacuumpreptool上；

    将vacuumpreptool放入70％乙醇中5秒；

    然后移到denatureationbuffer中5秒；

    再移到washingbuffer中清洗5－10秒；

    关掉泵；

    将vacuumpreptool放入含有测序引物的板中，摇动，释放sepharosebeads（测序引物也可最后加入）

    使用高纯水清洗vacuumpreptool；

    将放有样品的PSQ96板放在ThermoPlate上加热到80℃2分钟，再冷却到室温，即可进行Pyrosequencing反应。

454测序原理与操作流程

2010-11-1522:

44:

09|  分类：

MolecularBiolog|  标签：

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（转自生物技术世界） 

2005年，在国际顶级的学术期刊《Nature》上，来美国454生命科学公司的Margulies等人发表文章介绍了一种快速简单的测序方法：

结合了DNA扩增的乳胶系统（emulsionsystem）和皮升大小焦磷酸（pyrophosphate）为基础的测序方法——焦磷酸测序（pyrosequencing）方法。

发明者宣称，这种测序方法比传统的Sanger测序的方法快100倍，假如利用这种方法来进行人类基因组的测序，那么在100多天内就可以完成。

在2005年年底，454公司的研究人员将这种崭新的测序技术转化成了商品化的仪器——GenomeSequencer20系统，并由罗氏应用科学部独家负责在全球的销售和技术服务等工作。

GenomeSequencer20系统一经推出，就受到了国际上基因组学专家的广泛关注，并在世界各大测序实验室相继成功落户。

可以说，随着GenomeSequencer20系统的不断推广应用和升级，快速基因组测序的时代已经来临，并对整个基因组学的研究将产生巨大的推动作用。

GS20高通量测序技术原理

GS20高通量测序技术是一种新的依靠生物发光进行DNA序列分析的技术,在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的，此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳，具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点，在遗传多态性分析、重要微生物的鉴定与分型研究，克隆检测和等位基因频率分析等方面具有广泛的应用。

GS20高通量测序技术操作流程

1.剪切、连接

GS20高通量测序的方法不需要进行繁琐的建库的过程，而是利用高压氮气将基因组DNA“剪切”成300－800个碱基的片断。

然后利用核酸内切酶、聚合酶和激酶的作用在DNA片断的5’端加上磷酸基团，3’端变成平端，然后和两个44个碱基长的衔接子（adaptor）A、B进行平端连接。

A、B衔接子各自含有20个碱基的PCR引物序列、20个碱基的测序引物序列和4个碱基的对照序列（TACG），除此之外，B衔接子的5’端还标记有一个生物素基团，供后续的分离合适的测序模板使用。

2.单链DNA模板的分离

在连接反应的过程中，由于是平端连接，因此连接后的产物含有“缺口”，需要对其进行“缺口修复”。

在分离步骤中，GS20高通量的测序方法选用了包被有链霉亲合素的磁珠，由于生物素可以与链霉亲合素特异结合，加入特异性的Melt洗脱溶液，温度提高到DNA的熔解温度以上，就可以选择性的将单链的AB连接产物洗脱下来，得到后续PCR扩增和测序所使用的DNA模板。

如图2。

3.emPCR（emulsionPCR）

在得到仅含有A、B衔接子单链DNA模板以后，此DNA模板和过量的DNA捕捉珠子退火结合，并被吸附到一种用于PCR反应的油-水混合物的小滴上，此油-水混合物的小滴包含了PCR反应所必须的各种试剂，因此在合适的条件下，以单链的DNA为模板进行PCR扩增，结果得到大量同一序列的DNA链。

最后，打断PCR反应过程，对结合有大量DNA链的珠子进行富集，供下一步的反应使用。

如图3。

4.测序反应

GS20高通量测序技术在进行测序反应时，使用了一种叫做“PicoTiterPlate”的设备。

整个反应体系是皮升级别的：

一片平板上面有大约160万个孔；每平方毫米面积内有480个孔，大约每个孔的体积是75皮升，平均直径为44um，只含有一个上述结合有大量DNA链的珠子。

一块平板可以得到20万个测序读长，每个测序读长平均在100个碱基左右，因此，一块PicoTiterPlate的测序读长最终可以达到2,000万个碱基。

Sanger测序方法和GS20高通量测序方法的比较

以对一个200万碱基的基因组测序为例，两种测序方法的比较如下：

从上述比较可以看出，GS20高通量测序技术具有如下方面的优势：

1.快速：

在一个4.5小时的测序反应中，可以读出2,000万个碱基

2.成本低廉：

所需的每个碱基的测序成本是Sanger测序方法的几十分之一左右

3.方法简便，高效：

不需要进行建库、克隆挑取、质粒提取等工作，一个人可以在几天内完成一个微生物物种的测序工作

4.简单、方便：

仪器易于操作，提供完整的解决方案

GS20高通量测序技术的应用

自从2005年年底GS20高通量测序仪器问世以来，已经相继在世界上各大测序实验室成功落户。

目前也已经有相应的高质量的文献发表在国际顶级的科学期刊上（具体可查询https:

//www.roche-applied-它的

主要应用领域表现在：

1.扩增产物测序

2.寻找基因组中的Sanger方法不能发现的稀有突变

3.可应用于进行开放阅读框（ORF）的鉴定，不同生物间的同源性分析，基因组结构概况分析

4.鉴定不同菌株的保守区域，突变热点和基因插入或者缺失，了解药物抗性的遗传基础

5.识别微生物产生的药物前体有关的基因或者途径，比较致病性和非致病性微生物的区别作为发展抗微生物药物的遗传学基础

6.病毒，microRNA、SAGE文库、cDNA文库和BAC文库的测序