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论文实验部分

同时测定三种氨基酸的同步荧光光谱法研究

实验步骤

1、缓冲溶液最佳pH的测定

由于同一条件下苯丙氨酸荧光强度明显低于酪氨酸和色氨酸,故取其荧光强度最大时的酸度作为待测体系的酸度是合理的。

配制苯丙氨酸的标准溶液：

1）分别称取10.0098gNaOH、34.0220gKH2PO4于250mL烧杯中，加入适量二次蒸馏水，将烧杯放在超声波清洗器中震荡溶解，溶解后转移至500mL容量瓶中，再用二次蒸馏水定容、摇匀，配制成0.5moL/L的溶液，待用。

2）用0.5moL/LNaOH和0.5moL/LKH2PO4配制pH为6.0、6.8、7.0、7.2、7.5、8.5、10的缓冲液。

3）用1mL吸量管从C2（3）中各吸取1mL苯丙氨酸的标准液分别加入到7个10mL容量瓶中，然后分别用步骤4中的7个标准缓冲溶液定容、摇匀，待测定。

4）取pH=7.0的一组进行荧光测定，寻找苯丙氨酸的激发波长和发射波长，然后测定七组苯丙氨酸在对应激发波长下的荧光强度。

5）绘制pH—Fr荧光强度曲线，确定缓冲溶液的最佳pH值。

2、三种氨基酸荧光光谱的测定

设置荧光光谱的测定参数激发和发射狭缝均为5nm，光电倍增管电压为700mV，首先在预设的荧光波长下测定激发光谱，由此获得最大荧光波长，以此波长测定激发光谱，从而获得最大激发波长，最后验证获得的最大激发波长和最大荧光发射波长是否吻合。

3、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸溶液的配制

1）色氨酸（简写Trp）

用电子天平准确称取0.05105色氨酸50mL烧杯中，加入20mL二次蒸馏水，将烧杯放在超声波清洗器中震荡溶解，溶解完全后，将溶液转移至50mL容量瓶中用二次蒸馏水定容、摇匀，作为母液A1，并置于冰箱冷藏。

用1mL吸量管从A1中移取1.0mL溶液于10mL容量瓶中，用二次蒸馏水定容、摇匀，作为标准液A2，并置于冰箱冷藏。

用1mL吸量管从A2中移取1.0mL溶液于50mL容量瓶中，用二次蒸馏水定容、摇匀，作为标准液A3，并置于冰箱冷藏。

用1mL吸量管从A3中移取1.0mL溶液于10mL容量瓶中，用pH=7.2的缓冲液定容、摇匀，作为待测溶液。

2）酪氨酸（简写Tyr）

用电子天平准确称取0.0452g酪氨酸于250mL烧杯中，加入100mL二次蒸馏水，将烧杯放在超声波清洗器中震荡溶解，溶解完全后，将溶液转移至250mL容量瓶中用二次蒸馏水定容、摇匀，作为母液B1，并置于冰箱冷藏。

用1mL吸量管从B1中移取1.0mL溶液于100mL容量瓶中，用二次蒸馏水定容、摇匀，作为标准液B2，并置于冰箱冷藏。

用1mL吸量管从B2中移取1.0mL溶液于10mL容量瓶中，用pH=7.2的缓冲液定容、摇匀，作为待测溶液。

3）苯丙氨酸（简写Phe）

用电子天平准确称取0.0434g苯丙氨酸于50mL烧杯中，加入20mL二次蒸馏水，将烧杯放在超声波清洗器中震荡溶解，溶解完全后，将溶液转移至50mL容量瓶中用二次蒸馏水定容、摇匀，作为母液C1，并置于冰箱冷藏。

用1mL吸量管从C1中移取1.0mL溶液于50mL容量瓶中，用二次蒸馏水定容、摇匀，作为标准液C2，并置于冰箱冷藏。

从C2中移取1.00mL溶液于10mL容量瓶中，用pH=7.2的缓冲液定容、摇匀，作为待测溶液。

同时用10mL移液管移取10mLpH=7.2的缓冲液至10mL容量瓶中，作为空白样。

实验结果

1、缓冲溶液最佳pH的选择

实验用苯丙氨酸作为实验分析物质，是由于同浓度的三种氨基酸溶液中，苯丙氨酸的荧光强度最弱。

实验所测pH值不同的7组数据，在整理分析数据发现，pH=6.0,6.8两组数据的结果比较反常，舍去，选择后5组数据进行分析比较，扣除空白后得Fr-pH关系图（图1），由图可见，缓冲溶液的最佳pH=7.2。

图1缓冲溶液最佳pH的选取

2、三种氨基酸的荧光光谱的测定

1）色氨酸

图2.1色氨酸的荧光光谱

1色氨酸的激发荧光光谱2色氨酸的发射荧光光谱

1’空白样的激发荧光光谱2’空白样的发射荧光光谱

2）酪氨酸

图2.2酪氨酸的荧光光谱

1酪氨酸的激发荧光光谱2酪氨酸的发射荧光光谱

1’空白样的激发荧光光谱2’空白样的发射荧光光谱

3）苯丙氨酸

图2.3苯丙氨酸的荧光光谱

1苯丙氨酸的激发荧光光谱2苯丙氨酸的发射荧光光谱

1’空白样的激发荧光光谱2’空白样的发射荧光光谱

4）三种氨基酸扣除空白后的相对荧光光谱

图2.4三种氨基酸扣除空白后的相对荧光光谱

1色氨酸的相对激发光谱1’色氨酸的相对发射光谱

2酪氨酸的相对激发光谱2’酪氨酸的相对发射光谱

3苯丙氨酸的相对激发光谱3’苯丙氨酸的相对发射光谱

3、三种氨基酸及空白样的同步荧光光谱

1）色氨酸

对色氨酸进行同步荧光扫描，λm的取值范围是230-320nm，每隔5nm测量一次。

得以下荧光光谱：

图3.1.1色氨酸的同步荧光光谱（λm=230-270nm）图3.1.2色氨酸的同步荧光光谱（λm=275-320nm）

2）酪氨酸

对酪氨酸进行同步荧光扫描，λm的取值范围是230-310nm，每隔5nm测量一次。

得以下荧光光谱：

图3.2.1酪氨酸的同步荧光光谱（λm=230-270nm）图3.2.2酪氨酸的同步荧光光谱（λm=275-310nm）

3）苯丙氨酸

对苯丙氨酸进行同步荧光扫描，λm的取值范围是230-310nm，每隔5nm测量一次。

得以下荧光光谱：

图3.3.1苯丙氨酸的同步荧光光谱（λm=230-270nm）图3.3.2苯丙氨酸的同步荧光光谱（λm=275-310nm）

4）空白样

根据对色氨酸进行同步荧光扫描，λm的取值范围是230-320nm，每隔5nm测量一次。

得以下荧光光谱：

图3.4.1空白样的同步荧光光谱（λm=230-270nm）图3.4.2空白样的同步荧光光谱（λm=275-310nm）

4、三种氨基酸的同步荧光光谱的一阶导数处理

1）实验分析初步判断，色氨酸的最佳同步波长差Δλ=55nm。

Δλ=55nm时，对三种氨基酸扣除空白后进行同步一阶处理得以下结果：

s

图4.1.1三种氨基酸扣除空白后的同步导数光谱图

（Δλ=55nm，左）（Δλ=60nm，右）

1色氨酸2酪氨酸3苯丙氨酸（下同）

图4.1.2三种氨基酸扣除空白后的同步导数光谱（Δλ=50nm）

2）通过对实验数据的整理，分析判断，酪氨酸的最佳同步波长差Δλ=75nm。

Δλ=75nm时，对三种氨基酸扣除空白后进行同步一阶处理得以下结果：

图4.2.1三种氨基酸扣除空白后的同步导数光谱

（Δλ=85nm,左）（Δλ=80nm，右）

图4.2.2三种氨基酸扣除空白后的同步导数光谱

（Δλ=90nm，左）（Δλ=75nm，右）

图4.2.3三种氨基酸扣除空白后的同步导数光谱

（Δλ=70nm，左）（Δλ=65nm，右）

3）实验分析初步判断，苯丙氨酸的最佳同步波长差Δλ=15nm。

Δλ=15nm时，对三种氨基酸扣除空白后进行同步一阶处理得以下结果：

图4.3.1三种氨基酸扣除空白后的同步导数光谱

（Δλ=25nm，左）（Δλ=15nm，右）

图4.3.2三种氨基酸扣除空白后的同步导数光谱（Δλ=20nm）

5、最佳同步波长差Δλ的选择

由4中三种氨基酸扣除空白后的同步导数光谱比较可得三种氨基酸的最佳同步波长差Δλ分别为：

色氨酸：

55nm；酪氨酸：

75nm；苯丙氨酸：

15nm。

图5三种氨基酸扣除空白后的同步荧光光谱

1色氨酸（Δλ=55nm）2酪氨酸（Δλ=75nm）3苯丙氨酸（Δλ=15nm）

6、酪氨酸对色氨酸的干扰实验

由5所得，色氨酸的最佳同步波长差Δλ=55nm。

Δλ=55nm时，从图4.1.1可以看出，此时酪氨酸对色氨酸的荧光强度的测量有一定的影响，因而，对色氨酸进行酪氨酸的干扰实验色氨酸（8×10-7mol/L）、色氨酸（8×10-7mol/L）-酪氨酸（1×10-6mol/L）混合溶液、空白缓冲溶液（pH=7.2）进行同步荧光光扫描，色氨酸以及混合溶液扣除空白后，进行同步一阶处理得以下结果：

图6色氨酸和氨基酸混合溶液扣除空白后的同步导数光谱

1色氨酸2色氨酸-酪氨酸混合溶液

7、三种氨基酸的线性范围

1）色氨酸（Trp）Δλ=55nm取从大到小浓度范围（5×10-6mol/L~1×10-8mol/L）的色氨酸溶液共11组，进行同步荧光扫描，并进行扣除空白后的微分处理，取λ=291nm处的数据整合分析发现，第10、11组数据，即浓度为1×10-8mol/L和2.5×10-8mol/L两组数据与整体数据不成线性关系，故舍去。

将其他前九组数据进行线性拟合，得以下Ir-c的线性关系图（图1.1）。

由图可见：

线性斜率B=-1.6986，相关系数R=-0.99987，R2=0.99974

缓冲体系pH=7.2

图7.1.1λ=291nm时的色氨酸的浓度与扣除空白后同步荧光强度导数关系图

2）酪氨酸的线性拟合

酪氨酸（Tyr）Δλ=75nm取从大到小浓度值的色氨酸溶液共11组，进行同步荧光扫描，并进行扣除空白后的微分处理，取λ=291nm处的数据整合分析发现，第10、11组数据，即浓度为4×10-8mol/L和8×10-8mol/L两组数据与整体数据不成线性关系，故舍去。

将其他前九组数据进行线性拟合，得以下Ir-c的线性关系图（图1.1）。

R2=0.99924

缓冲体系pH=7.2

图1.1λ=231nm时的酪氨酸的浓度与同步荧光强度导数关系图

8、检测线

1）Δλ=55nm时，对空白样进行15次重复扫描，将15组数据进行同步微分处理后，取λ=291nm处的数据进行标准偏差计算，得到标准偏差σ=0.7909，σ=0.7取利用检测限的计算公式进行计算

得，检测限为-0.82420×10-8mol/L，取8.2×10-9mol/L.

2）酪氨酸的检测线

Δλ=75nm时，对空白样进行15次重复扫描，将15组数据进行同步微分处理后，去λ=231nm处的数据进行标准偏差计算，得到标准偏差σ=0.7取利用检测限的计算公式进行计算

得，检测限为1.8×10-8mol/L.

9、精密度

1）色氨酸：

5×10-7mol/L，Δλ=55nm时，对色氨酸溶液进行15次重复扫描，将15组数据进行同步微分处理后，去λ=291nm处的数据进行标准偏差和导数平均值的计算，得到精密度S，即标准偏差S=4.81631，取S=4.0，导数平均值为-84.24，则

相对标准偏差=4.0/84.24=4.75%。

2）酪氨酸：

5×10-7mol/L，Δλ=75nm时，对酪氨酸溶液进行15次重复扫描，将15组数据进行同步微分处理后，去λ=231nm处的数据进行标准偏差和导数平均值的计算，得到精密度S，即标准偏差S=2.0，导数平均值为-41.24，则相对标准偏差=2.0/41.24=4.85%。

4、回收率

1）由色氨酸的线性拟合实验数据整理可得，线性关系最佳的色氨酸浓度为2.5×10-7mol/L，分别配制浓度为C1=2.5×10-7mol/L，C2=3.75×10-7mol/L三种色氨酸溶液和空白缓冲溶液（pH=7.2），在Δλ=55nm，即λm=275nm条件下进行同步荧光扫描，并进行同步微分处理后，对λ=291nm处的Ir，通过线性关系公式进行计算得：

X1=2.76659×10-7mol/L，X2=4.07942×10-7mol/L，