浙科版生物选修1 第2部分实验6 α淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测.docx

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浙科版生物选修1第2部分实验6α淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测

实验6

α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测

课　标　解　读

重　点　难　点

1.制备固定化α-淀粉酶。

2.进行淀粉水解的测定。

3.通过此实验探讨固定化酶的应用价值。

1.固定化酶的方法和优点。

2.固定化酶装柱后的使用。

一、酶与固定化酶

1．酶

活细胞产生的具有催化作用的一类有机物，它是生物体内各种化学反应的催化剂。

2．固定化酶

将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。

3．将酶改造成固定化酶的原因

由于酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用，所以要将酶改造成固定化酶。

4．酶固定化的方法

吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。

本实验用的是吸附法。

5．固定化酶作用的机理

将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶的作用下转变为产物。

在酶固定化的各种方法中，哪一种方法对酶的作用影响较小？

【提示】　吸附法

二、α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用检测的实验

1．实验目的

（1）制备固定化α-淀粉酶。

（2）进行淀粉水解作用的检测。

2．实验原理

将α-淀粉酶固定在石英砂上，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精。

用淀粉指示剂测试，若流出物呈红色，表明糊精生成。

3．本实验使用的酶及特性

本实验使用的酶是枯草杆菌的α-淀粉酶，其作用的最适pH为5.5～7.5，最适温度为50～75_℃。

4．实验材料及其制备

（1）α-淀粉酶的固定化：

在烧杯中将5mgα-淀粉酶溶于4mL蒸馏水中

（由于酶不纯，可能有些不溶物）

　　　↓

再加入5g石英砂，不时搅拌30min

　　　↓

30min后将上述溶液装入1支注射器中

（该注射器的下端接有气门心，并用夹子封住）

　　　↓

用10倍体积的蒸馏水洗涤此注射器，以除去未吸附的游离淀粉酶，流速为1mL/min

（2）可溶性淀粉溶液：

取50mg可溶性淀粉溶于100mL热水中，搅拌均匀。

（3）KI-I2溶液：

称取0.127g碘和0.83g碘化钾。

加蒸馏水100mL，完全溶解后装入滴瓶中。

5．实验步骤

（1）淀粉溶液流经固定化酶柱

将灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上，用滴管滴加淀粉溶液，使该溶液以0.3mL/min的流速过柱。

（2）接取流出物

待从固定化酶柱中流出5mL淀粉溶液后，接收0.5mL流出液。

（3）流出物鉴定

在流出物中加入KI-I2溶液，观察颜色。

用水稀释1倍后再观察颜色。

（4）洗涤、保存固定化酶柱

实验后，用10倍柱体积的蒸馏水洗涤此柱。

放置在4℃冰箱中保存。

（5）几天后取出冰箱中该固定化酶柱，重复实验，观察结果。

固定化酶柱为什么放在4℃的冰箱中保存？

【提示】　高温会破坏酶的结构，低温不破坏酶的结构。

酶的固定化

1.固定化酶的概念

酶是生物体内各种化学反应的催化剂，具高度专一性和高效性，但酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。

固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质（如石英砂、毛玻璃、琼脂糖、明胶、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等）上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。

2．酶的常用固定化方法

酶的固定化可分为酶分子固定化及细胞固定化。

细胞固定化与直接固定酶相比，成本更低，操作也更容易。

常用方法如下：

（1）物理吸附法

物理吸附法是指将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂多为活性炭、多孔玻璃、石英砂等。

（2）化学结合法（包括交联法及共价偶联法等）

化学结合法是指将酶分子相互结合，或将其结合到纤维素、琼脂糖、离子交换树脂等载体上的固定方式。

工艺简便及条件温和是其显著特点，其载体选择范围很大，涉及天然或合成的无机、有机高分子材料。

化学结合法中常见的有交联法、共价结合法、离子结合法等。

（3）包埋法

包埋法是指将酶包裹在多孔的载体中，如将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中，或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中。

包埋法又分为凝胶包埋法和微囊化法，前者包埋成格子型，后者包埋成微胶囊型。

固定酶的方法

3．直接使用酶和固定化酶的比较

直接使用酶

固定化酶

酶的种数

一种或几种

一种

常用载体

－

石英砂、高岭土、皂土、硅胶、凝胶

制作方法

－

化学结合法固定化、物理吸附法固定化

催化反应

单一或多种

单一

反应底物

各种物质（大分子、小分子）

各种物质（大分子、小分子）

缺点

①对环境条件非常敏感，易失活；②难回收，成本高，影响产品质量

不利于催化一系列的酶促反应

优点

催化效率高、耗能低、污染低

①既能与反应物接触，又能与产物分离；②可以反复利用

4.固定化酶的优点

（1）可循环反复使用酶制剂。

在某些情况下可使用上千次，极大地降低了生产成本。

（2）在生产中，可通过离心法或过滤法把酶与反应液相互分开，在大规模的生产中所需工艺设备比较简单易行。

（3）稳定性能好。

　下列与固定化酶相关的叙述中正确的是（　　）

A．固定化酶是将水不溶性酶固定于某种介质上，使之成为易溶于水，而又具酶活性的制剂

B．将固定化酶装柱，当酶流过该柱时，可催化柱内底物转变为产物

C．酶固定的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等

D．固定化酶的缺点是酶在水溶液中很不稳定，且易与产物混在一起不易分离

【思路点拨】　固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学方法固定在某种介质上。

使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。

与普通酶相比，固定化酶易与产物分离，且固定化酶反应柱中酶已被固定，不能从柱内流出；酶的固定化方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。

【答案】　C

关于固定化酶和一般酶制剂在应用效果上的说法错误的是（　　）

A．固定化酶生物活性强，可长久使用

B．一般酶制剂应用后和产物混在一起，产物的纯度不高

C．一般酶制剂参加反应后不能重复利用

D．固定化酶可以反复利用，降低生产成本，提高产量和质量

【解析】　固定化酶是将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用，降低成本，产物中也不含酶，提高了产品的纯度，固定化酶虽可以多次利用，但不可长久使用。

【答案】　A

固定化酶的应用

1.用固定化酶技术生产高果糖浆

（1）高果糖浆生产中面临的问题：

高果糖浆的生产需要使用葡萄糖异构酶，它能将葡萄糖转化成果糖。

这种酶的稳定性好，可以持续发挥作用。

但是，酶溶解于葡萄糖溶液后，就无法从糖浆中回收，造成很大的浪费。

（2）固定化酶反应柱——将酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些颗粒装在反应柱内，反应柱底端装上分布着许多小孔的筛板，酶颗粒无法通过小孔，而反应溶液却能出入。

（3）使用固定化酶技术生产高果糖浆。

生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。

（如图所示）

（4）相关技术优势：

上述反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。

目前，用固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆的规模已经超过了每年1000万吨。

2．α-淀粉酶的固定化

（1）固定方法——用吸附法将α-淀粉酶固定在石英砂上。

在烧杯中将5mgα-淀粉酶溶于4mL蒸馏水中，再加入5g石英砂，不时搅拌，30min后，装入1支下端接有气门心并用夹子封住的注射器中（石英砂体积约4mL）。

用10倍体积的蒸馏水洗涤注射器以除去未吸附的游离淀粉酶。

（2）固定化α-淀粉酶功能检测

①原理：

淀粉

糊精

（遇碘显蓝色）　（遇碘显红色）

麦芽糖

葡萄糖

（遇碘不显色）

②检测：

用吸附法将α-淀粉酶固定在石英砂上制成反应柱后，将反应柱（注射器）放在注射器架上，用滴管滴加淀粉溶液，当一定浓度的淀粉溶液流经反应柱时，柱内的α-淀粉酶可使淀粉水解成糊精——用淀粉指示剂（KI-I2溶液）测试，流出物呈“红色”——表明有淀粉水解产物糊精的生成（未水解时，淀粉遇其指示剂应显示蓝色）。

固定化酶在消除污染、保护环境方面的应用：

固定化酶和固定化细胞在清除污染、保护环境方面也大有作为，是当代环境保护的出色“卫士”，其主要作用是进行环境监测和处理三废。

①环境监测：

固定化酶也可以用于测定有毒物质的含量，进行环境监测，如用固定化多酚氧化酶检测水中的酚类物质；利用固定化酶还可以检测有机磷、有机氯农药等环境污染物（如过氯酸盐、氧化物和尿素等）

②处理三废：

应用固定化酶或固定化细胞可以组成快速、高效、连续运行的污水处理系统，如用固定化分解氰化物的细菌除去废水中的氰化物；用固定化α-淀粉酶处理造纸厂的废水，用水解农药的细菌固定化制剂处理农药废水等。

　下图为固定化酶的反应柱示意图，请据图回答：

（1）请在横线上填出各标号名称。

①________，②________，③________。

（2）与一般酶制剂相比，固定化酶的突出优点是______________________

____________________________________________________________。

（3）③的作用是_______________________________________________。

（4）制作固定化葡萄糖异构酶所用的方法有________或________。

（5）据图说出反应柱的作用原理：

__________________________________

____________________________________________________________。

【思路点拨】　

（1）固定化酶反应柱是将酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些颗粒装在反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板，酶颗粒无法通过小孔，而反应液却可出入，图示中①为反应柱，②为固定化酶，③为具有小孔的筛板。

（2）固定化酶的突出优点是既能与反应物接触，又能与产物分离。

（3）多孔筛板的作用在于阻止酶颗粒通过，但却让反应液自由出入。

（4）固定化酶可采用吸附法、交联法等方法。

（5）反应柱的作用原理在于反应物溶液从反应柱上端注入后，使反应物流过反应柱与固定化酶接触，参与催化化学反应所形成的产物则从柱的底端流出。

【答案】　

（1）反应柱　固定化酶　分布着小孔的筛板

（2）既能与反应物接触，又能与产物分离，能连续性生产

（3）酶颗粒无法通过③，反应溶液却可自由出入

（4）吸附法　交联法

（5）反应物溶液从反应柱上端注入，使反应物溶液流过反应柱，与固定化酶接触，得到的产物从反应柱下端流出。

【互动探究】

若上述（例2）反应柱中，所固定的酶为α-淀粉酶，注入的溶液为一定浓度的淀粉溶液，请回答：

（1）注入淀粉溶液后，反应柱底端流出物中主要成分是什么？

你如何检测淀粉是否被水解？

现象如何？

（2）该流出物溶液中是否具有α-淀粉酶？

为什么？

如何通过简单实验，验证你的结论？

【提示】　

（1）流出物主要成分是糊精，可用淀粉指示剂检测淀粉是否被水解，其现象是：

水解前溶液呈蓝色，水解后溶液呈红色。

（2）流出物溶液中无α-淀粉酶，因为反应柱底端的多孔筛板只允许反应物溶液自由出入。

而酶分子不能通过。

为证明上述结论，可在装入反应物溶液前，先向柱内加入蒸馏水，收集柱底端流出物溶液进行淀粉水解实验——加入蒸馏水后的流出物溶液不能将淀粉水解，表明其内无淀粉酶。

1．下列不属于酶固定化的方法的是（　　）

A．吸附法B．共价法

C．交联法D．包埋法

【解析】　本题考查酶固定化的方法。

酶固定化的方法比较多，其中包括吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法等。

本题四个选项中B项的方法描述不准确。

【答案】　B

2．固定化酶的优点是（　　）

A．有利于增加酶的活性B．有利于产物的纯化

C．有利于提高反应速度D．有利于酶发挥作用

【答案】　B

3．将固定化酶装柱后，当底物经过该柱时，底物发生的变化是（　　）

A．底物被稀释了

B．底物被浓缩了

C．底物的结构变得更加稳定了

D．底物被酶水解成产物了

【解析】　固定化酶装柱后，当底物经过该柱时，底物被酶水解成产物了。

所以只有D选项是正确的。

【答案】　D

4．淀粉在各种酶的作用下会依次水解，不同阶段的水解产物遇到指示剂会出现不同的显色反应，下列选项中属于本实验中的反应物质和显色现象的是（　　）

A．淀粉遇碘显蓝色

B．糊精遇KI-I2溶液显红色

C．麦芽糖遇碘不显色

D．葡萄糖遇斐林试剂显砖红色

【解析】　本题考查本实验步骤中物质的鉴定过程。

该过程所依据的原理是淀粉流经α-淀粉酶固定化酶柱时，淀粉被酶水解成了糊精，而糊精遇到KI-I2溶液显红色。

所以A、C、D选项中的反应物质都是错误的，不是淀粉、麦芽糖、葡萄糖，而是糊精。

只有选项B正确。

【答案】　B

5．回答下列有关固定化酶技术的问题。

（1）酶是生物体中生化反应的催化剂，在工业生产和食品加工中的应用日益广泛。

为提高酶的利用率以及提高产品的纯度，一般需要对酶进行固定化处理：

即将酶用物理或化学方法固定在______________介质上，具体方法有：

吸附法、共价偶联法、________法和交联法。

（2）下图为装有固定化酶a的实验装置。

其中b是反应柱，c是催化底物。

若装置中的固定化酶为α-淀粉酶，则通常是利用吸附法进行固定的，介质一般为________。

利用该装置进行淀粉水解实验时，在漏斗中加入反应液后的操作是______________________，以保证反应充分。

对流出的液体用________检测，若呈现________色，说明淀粉被水解成糊精。

若a是固定化酵母，要想得到较多的酒精，加入反应液后的操作是________，装置中的长导管起的作用是______________________________________________________________

____________________________________________________________。

（3）研究认为，用固定化酶处理污染物是很有前途的，如将从大肠杆菌得到的磷酸三酯酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，与用微生物降解相比，其作用不需要适宜的________________________。

A．温度B．水分　　C．pH　　D．营养

【解析】　

（1）固定酶的介质应为非水溶性物质。

（2）固定α-淀粉酶的方法为石英砂吸附法。

α-淀粉酶装柱后进行淀粉水解实验时，应打开活塞1和活塞2，并控制流速，保证α-淀粉酶的催化作用。

检测淀粉是否被分解为糊精应用KI-I2溶液。

如果反应柱中加入的是固定化的酵母细胞，利用酵母细胞生产酒精时，应在无氧条件下进行。

弯曲的长导气管既可以排出无氧呼吸产生的CO2，也可以防止杂菌进入反应柱。

（3）固定化酶降解有机磷农药不需要营养。

【答案】　

（1）非水溶性　包埋　

（2）石英砂　打开活塞1和2，并控制流速　KI-I2溶液　红　关闭活塞1和2　排放气体CO2，防止杂菌进入反应柱　（3）D