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遗传变异分类标准与指南完整版

遗传变异分类标准与指南（完整版）

摘要

美国医学遗传学与基因组学学会（TheAmericanCollegeofMedicalGeneticsandGenomics,ACMG）曾制定过序列变异解读指南.在过去的十年中,随着新一代高通量测序的出现,测序技术有了快速发展.利用新一代测序技术,临床实验室检测遗传性疾病的产品种类不断增加,包括基因分型、单基因、基因包、外显子组、基因组、转录组和表观遗传学检测.随着技术的复杂性日益增加,基因检测在序列解读方面不断面临着新的挑战.因此ACMG在2013年成立了一个工作组来重新审视和修订序列变异解读的标准和指南,工作组包括ACMG、分子病理协会（theAssociationforMolecularPathology,AMP）和美国病理学家协会（theCollegeofAmericanPathologists,CAP）的代表.该工作组由临床实验室主任和临床医生组成.本报告代表了工作组中来自ACMG,AMP和CAP的专家意见.本报告提出的建议可应用于临床实验室的各种基因检测方法,包括基因分型、单基因、基因包、外显子组和基因组.本报告建议使用特定标准术语来描述孟德尔疾病相关的基因变异——“致病的”、“可能致病的”、“意义不明确的”、“可能良性的”和“良性的”.此外,本报告描述了基于典型的数据类型（如人群数据,计算数据,功能数据,共分离数据）对变异进行五级分类的标准过程.由于临床基因检测分析和解读中不断增加的复杂性,ACMG强烈建议临床分子基因检测应在符合临床实验室改进修正案（CLIA）认证的实验室中进行,其检测结果应由通过职业认证的临床分子遗传学家或分子遗传病理学家或相同职能的专业人员解读.

介绍：

随着遗传病患者样本中所检测基因数目的快速增加,临床分子实验室检测到越来越多的新的序列变异.某些表型仅与单个基因相关,而多数表型与多个基因相关.对某个给定序列变异的临床意义进行分级解读,从某个变异几乎可以肯定是某种疾病的致病性变异到几乎可以肯定是良性变异.虽然ACMG之前的建议提供了序列变异的解读分类及解读的算法,但并没有提供明确的术语或详细的变异分类指导.本研究依据专家意见及经验数据,阐述了最新的序列变异分类标准和指南.

1.方法

2013年,ACMG,AMP和CAP的成员,代表临床实验室主任和临床医生成立了一个工作组,该工作组依据专家建议、工作组共识和公众反馈开发了一种可以对现有的证据进行加权的系统,并应用此系统对序列变异进行标准分类.为了评估临床实验室的观点,对列入GeneTests.org上位于美国和加拿大的超过100家的测序实验室进行了调研,要求各实验室填写参考术语及变异分类的评估证据.这些实验室有检测包括罕见病、药物基因组学和癌症体细胞突变的经验.第一次调研于2013年2月开展,该调研旨在评估参考术语的偏好,调研结果公布在同年ACMG年会公开论坛上,该年会有超过75个与会者参加.调研结果代表超过45个位于北美的实验室.调研和公开论坛的结果表明:

（i）五级术语系统“致病的”、“可能致病的”、“意义不明确的”、“可能良性的”和“良性的”是优选认可的,且已在多数实验室使用;（ii）工作组的首要重点应着重于孟德尔疾病和线粒体变异.

在第一次调研中,参与的实验室被要求提供他们的变异评估方法,最终有11个实验室提供并分享了他们的变异评估方法.通过分析所有提交的方法,工作组制定了一组准则,包括变异证据评估的加权标准体系和应用这个标准将变异归类为五类的分类准则.在今后的几周时间里,工作组成员通过在自己实验室或其他机构已进行分类的变异来验证这个方案.另外,还将典型变异的常见证据进行分类,来测试工作组成员达成一致的现有方法是否可以对这些变异进行分类.2013年8月,第二次调研在GeneTests.org上的相同实验室以及AMP清单上的约2000个单位中进行,同时给各单位提供了分类方案和详细的方案补充说明,要求各实验室使用该分类方案并对以下内容进行反馈,包括各标准的适宜性和每个标准的相对权重、分类体系的易用性以及他们是否会在自己的实验室采用这样的体系.来自超过33个实验室的答复表明多数实验室支持所推荐的分类方案,同时,他们的反馈进一步地指导了标准和指南的完善.

2013年11月,工作组在AMP会议期间举行了超过50人参加的研讨会,提出了修订后的分类标准和两个评分体系.一个体系与这里介绍的方法是一致的,另一个体系则是一个分数体系,每一项标准都有一个分数,正分数为致病标准,负分数为良性标准,根据总分数进行变异分类.参与者使用此系统并进行反馈,回答在评估变异证据过程中他们如何权衡各个标准（如强、中度或支持、或不使用）.参与者的反馈结果再次综合到这里介绍的分类体系中.但要指出的是,虽然大多数回复更倾向于分数评价体系,但本工作组认为,每个标准中具体分数的设置量化了对每个标准的理解,但是这一量化指标目前缺乏科学依据,并且没有考虑遗传证据解读时的复杂性.

工作组还评估了文献中推荐的其他专业协会和工作组在乳腺癌、结肠癌和囊性纤维化中已制定的变异分类指南,以及在特定疾病中应用统计分析来进行变异定量评估的方法[2~5].这些变异分析指南在特定条件下是有效的,但很难将他们推荐的标准应用于所有基因变异及不同的实验室条件.本文描述的变异分类方法适用于所有孟德尔基因变异,包括单基因、多基因包、外显子组和基因组测序发现的变异.期望这种变异分类方法会随着技术和知识水平的提高而与时俱进.由于不同基因和不同疾病中的应用和加权评估的标准可能不同,特定疾病组的工作应继续,以制定更有针对性的具体基因的变异分类指南.

2.总论

2.1术语

突变是指核苷酸序列的永久性改变,而多态性是指频率超过1%的变异.虽然术语“突变”和“多态性”已被广泛使用,但由于这两个术语已经错误地与致病性和良性结果关联了起来,所以往往会造成混淆.因此,建议使用“变异”加以下修饰词替代上述两个术语:

致病性的、可能致病性的、意义不明确的、可能良性的或良性的.虽然这些修饰词不可能适用所有的人类表型,但是正如本指南提出的它包含了孟德尔疾病相关的变异分类五级系统.建议所有致病性（包括可能致病）的结论需要注明疾病及相应的遗传模式（如c.1521_1523delCTT（p.Phe508del）,致病性,囊性纤维化,常染色体隐性遗传）.

应当注意的是,一些实验室可能选择其他等级（如意义不明确的变异的子分类,特别是内部使用时）,这种做法不被认为与指南不一致.还应当指出的是,某种程度上本指南推荐的术语与细胞遗传学基因芯片检测的拷贝数变异分类不同.虽然拷贝数变异分类系统也包括五级分类标准,但是它使用“临床意义不明确-可能致病的”和“临床意义不明确-可能良性的”.由于本指南提出的“可能的”变异分类标准比拷贝数变异分类指南中用到的“可能的”包含更强的证据,合并这两个“可能的”分类会使医务工作者和临床报告接收者产生混淆,因此大多数工作组成员不支持使用“意义不明确的”来修饰“可能致病的”或“可能良性的”.然而,有人认为“可能的”一词的使用应限于有数据支持其致病性或良性可能性很大的变异.虽然对“可能的”一词没有量化的定义,但是在某些变异分类系统中已有指导性意见.然而,ACMG开放论坛的一项调查建议“可能的”这一术语具有更广泛的适用性.认识到这一点,建议术语“可能致病的”和“可能良性的”用来说明一个具有大于90%可能引起致病或者可能良性的变异,尽管是人为的界定,但还是给实验室提供了一种共同的定义.类似地,国际癌症机构指南支持致病性的确定水平为95%,但是工作组（通过ACMG公开论坛期间的反馈确认）认为,临床医生和患者愿意容忍略高的错误机会,从而做出确定为90%的决定.还应当指出的是,考虑到多数疾病具有异质性,目前大多数变异没有数据能将它们量化性地归于上述五个变异类别之一.希望随着时间的推移,能够建立实验和统计方法来客观地赋予变异的致病可信度,并且采用更严格的方法来定义临床专业人员所期望达到的可信度,从而能更完整地诠释这些术语及可能性.

新术语的使用可能需要专业培训,鼓励专业团队对所有实验室和医务工作者进行这些术语的培训,也鼓励实验室直接对其开具检测报告单的医生进行培训教育.

2.2命名

建议通过一套规范的标准对变异进行统一命名来确保变异的明确定义,并实现基因组信息的有效共享和下游使用.标准的基因变异命名由人类基因组变异协会（theHumanGenomeVariationSociety,HGVS）维护和版本化（https:

//www.hgvs.org/mutnomen）,除非另有说明,一般推荐该命名法作为确定变异命名的首要准则.实验室应该注意他们在实验方法中所使用的版本.当描述变异时,可利用这些工具提供正确的HGVS命名（http:

//mutalyzer.nl）[7].临床报告应该包含参考序列以确保该变异在DNA水平上的明确命名,并提供编码和蛋白质命名法来协助功能注释（如“g”为基因组序列,“c”为编码DNA序列,“p”为蛋白质,“m”为线粒体）.

编码命名应该使用翻译起始密码子ATG中的“A”作为位置编号1来描述.在传统命名已被使用的地方,当今命名应该对传统命名进行额外注释.参考序列应该是完整的,并来源于具有版本号的美国生物技术信息参考序列数据库（http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/Refseq/）或LRG数据库（http:

//www.lrg-sequence.org）.基因组坐标应根据标准基因组版本（如hg19）或覆盖整个基因（包括5'和3'非翻译区以及启动子）的基因组参考序列来界定.当描述编码变异时,应该在报告中使用和提供每个基因的一个参考转录本.该转录本应该是最长的已知转录本或者是最具临床相关性的转录本.协会支持的参考转录本通常可以通过LRG数据库（http:

//www.lrg-sequence.org）、CDS共识数据库（https:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi）、人类基因突变数据库（http:

//www.hgmd.cf.ac.uk）、ClinVar（http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar）或特异基因座数据库来确定.然而,当这些区域发生临床可解释的已知变异时,实验室应该评估该变异对所有临床相关的转录本的影响,包括含有其他外显子或非翻译区延伸的可变剪切转录本.

HGVS（https:

//www.hgvs.org/mutnomen）并未覆盖所有类型的变异（如复杂变异）,但是复杂变异的可能描述已被报道[8].此外,ACMG支持HGVS命名规则之外的三种特殊例外:

（i）除了当今HGVS推荐的“*”和“Ter”,“X”仍然被认为用于报告无义变异;（ii）建议根据指定变异选择的参考转录本对外显子进行编号;（iii）通常因为临床解释直接评估致病性,所以推荐使用术语“致病性”而不是“影响功能”.

2.3文献及数据库使用

目前人类基因组中大量变异不断被发现,且已被许多数据库广泛收录.当临床实验室需要对某一变异进行分类并出具报告时,可在已有的数据库及发表的文献中寻找到有价值的参考信息.如上文提及,序列数据库还可用于确定合适的参考序列.数据库有助于信息收集,但需谨慎使用.

人群数据库（表1）适用于获取某变异在大规模人群中发生频率的相关信息.需要注意的是,人群数据库中的信息不仅来源于健康个体,也包含致病性的变异.另外,人群数据库并不包含变异的功能效应及可能关联的表型等相关信息.在使用人群数据库时,须明确数据库收录的是健康群体的信息还是患病群体的信息;（如能确认）数据库是否收录了同一家庭多名成员的信息以及数据库收录的受试者的年龄范围.

疾病数据库（表1）主要包含病患中发现的变异以及对其致病性的评估.疾病数据库和特定基因的数据库常包含一些分类错误的变异,这些变异在已发表的同行评审的文献中被错误判定,而多数数据库在收录变异相关信息时并未对证据进行基本的审核.因此,在使用疾病数据库时,考虑患者是如何被确诊的尤为重要,如下所述:

当使用数据库时,临床实验室应做到:

（i）确定数据库的更新频率,确定数据库收录相关数据时是否进行了校勘,以及采用什么方法进行数据校勘;（ii）确认采用HGVS命名体系,并确定描述变异的基因组版本和转录本参考序列;（iii）确定数据分析准确度的验证程度（如变异是源自于低覆盖的新一代测序,还是通过了Sanger测序验证）,并分析用于评估数据准确度的各种指标,要获得这些信息可能需要阅读相关的文献;（iv）确定收录对象的来源及其唯一性.

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变异解读也需要检索科学和医学文献.在参考一些采用旧的命名和分类系统或基于单一观察结果的文献时需要慎重.在参考携带某一变异并伴有相关表型的个体和家系的信息时,考虑患者是如何被确诊尤为重要.在评估这些文献的数据时需要谨慎客观,这是由于受累患者及相关个体在基于不同背景和规模的研究中常常被多次重复报道.重复报道的发生可能是由于作者重叠、实验室间合作或先证者及其家庭成员同时被不同临床系统随访.而这些重复报道可能会导致受累个体被错误地重复计数,进而使变异频率假性增高.作者或其研究机构互相重叠是发现数据集重复的第一线索.

临床实验室应建立一个内部系统对已报告的基因序列变异及临床诊断进行记录.这对于分析基因型-表型之间的相关性,以及该变异在患者和正常人群中的发生频率尤为重要.临床实验室也应该积极提交变异数据到相关数据库,如ClinVar数据库,包含提交临床评估信息以及用于变异分类的证据,以帮助人们不断加深对人类遗传变异所产生的效应的理解.在任何时候,提供临床数据应遵循“健康保险携带和责任法案（HIPAA）”对个人隐私保护的规定.临床实验室应与临床医生合作,以获得临床信息,从而更好地理解基因型是如何影响临床表型的,并解决不同实验室对遗传变异解读存在差异的问题.临床变异数据库极大地促进临床实验室工作的开展,因此需对其进行扩展并标准化.标准化便于临床实验室获取数据库的最新信息,同时有助于提交更新的信息.例如,ClinVar数据库允许变异连同临床表型和诊断相关信息一并提交,同时追踪提交变异的审核状态,以便对校勘质量的水平提供一个更加透明的概貌.

2.4生物信息学计算预测程序

各种公共和商业化计算机工具可以辅助解读序列变异.每种工具使用的算法可能有差异,但都会包含序列变异在核苷酸及氨基酸水平上作用影响的判断,包括变异对主要转录本,可变转录本,其他基因组元件影响作用的确认,也包括对蛋白质潜在影响作用的判定.这些工具主要分为两类:

一类可以预测错义变异是否会破坏蛋白质的功能或结构;另一种可以预测是否影响剪接（表2）.新的工具已可以处理额外的非编码序列.

错义改变的影响作用是由不同的条件决定的,例如一个氨基酸或核苷酸的进化保守性、其在蛋白质序列中的位置及其上下游序列,以及氨基酸置换导致的生化结果等.对各种计算机算法中的一个或几个条件进行评测可以进一步评估错义改变带来的影响.已经有一些工作在评估预测软件的预测性能,是通过对这些预测软件之间的相互比较评估他们预测已知致病突变的能力来实现的.一般情况下,多数算法预测已知致病的错义突变的准确率能达到65%~80%.但是大多数工具的特异性较低,导致有些错义改变被过度预测为有害突变,而且对于影响较小的错义变异的预测也不可靠.目前临床实验室常用的错义变异解读工具有PolyPhen2,SIFT[16]和MutationTaster.用于预测错义变异的生物信息分析工具见表2.

目前已开发出许多用于预测剪接的软件,这是基于内含子或外显子水平上剪接位点的丢失或产生原理基础上而完成的.一般情况下,相对于特异性（60%~80%）,预测工具在预测剪接位点异常方面具有较高的敏感性（~90%~100%）[19,20].一些常用的剪接位点预测分析计算工具见表2.

虽然许多不同的分析软件程序使用不同的算法进行预测,但其基本原理是相似的;因此,在序列解读中,不同软件工具组合的预测结果被视为单一证据而不是相互独立的证据.因为每个软件工具基于他们使用的算法都各有优缺点,所以仍然建议使用多种软件进行序列变异解读;很多情况下,预测性可能因为基因和蛋白质序列的不同而有差异.无论如何,这些软件分析结果只是预测,他们在序列变异解读中的应用应该慎重,不建议仅使用这些预测结果作为唯一证据来源进行临床判断.

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3.序列变异解读的拟定标准

以下评估变异证据的方法是用了解释在临床诊断实验室中具有疑似遗传（主要指孟德尔遗传）疾病患者的变异.并不适用于解读体细胞变异、药物基因组（PGx）变异、或者是多基因非孟德尔复杂疾病相关的基因变异.在外显子组或基因组研究中,对候选基因（意义不明确的基因（GUS））应用这些准则时应当谨慎（见下面注意事项）,因为本指南目的不是满足鉴定新致病基因的研究需求.

虽然这些方法可用于评估在健康个体中发现的变异或与测试指征不相关的变异,但是正如在指南的几个部分中所述,对于与指征无关的有较低先验致病性的变异时需更加谨慎.尽管期望本指南适用于变异分类,无论其是通过分析单基因、基因包、外显子组、基因组或者转录组而鉴定的,重要的是要关注与疾病有关的致病变异和虽然预测为对蛋白有破坏/损伤但却与疾病无充分关联的变异之间的区别.这些规则旨在确定在孟德尔遗传病中有明确作用的基因的变异是否对该遗传疾病是致病的.针对具体的病人,致病性判定应该独立于对疾病病因的解读.例如,某变异在一个案例中被评估为“致病的”,而在另一个案例中,由于不能解释该疾病,就对这个位点不给出“致病的”评价,这样的情况是绝对不允许的.确定致病性需要将全部的证据汇集在一起,包括所有的案例分析,最终得出一个结论.

此指南的分类方法可能比目前实验室应用的标准更为严格.这将导致很大一部分的变异被归类为“意义不明确的”.希望这种方法可以大量减少那些没有足够分类证据支持而报告为致病原因的变异.需要注意的是,当临床实验室报告一个变异为“致病的”时,医疗单位很可能把其当作“可指导临床作为的（actionable）”,基于这个判断,从而会改变对患者的治疗、监测,或去除对基因型为阴性的家庭成员的治疗、监测（参见下面的医务工作者应该如何使用这些指南和建议）.

本指南提供了两套标准:

一是用于对致病或可能致病的变异进行分类（表3）,另一是用于对良性或可能良性的变异进行分类（表4）.致病变异标准可分为非常强（verystrong,PVS1）,强（strong,PS1~4）;中等（moderate,PM1~6）,或辅助证据（supporting,PP1~5）.良性变异证据可分为独立（stand-alone,BA1）,强（strong,BS1~4）,或辅助证据（BP1~6）.其中,数字只是作为有助于参考的分类标注,不具有任何意义.每个类别中的数字不表示分类的任何差异,仅用来标记以帮助指代不同的规则.对于一个给定的变异,用户基于观察到的证据来选择标准.根据表5的评分规则把标准组合起来进而从5级系统中选择一个分类.这些规则适用于变异上的所有可用数据,无论是基于调查现有案例获得的数据,还是来源于先前公布的数据.未发表的数据也可以通过公共数据库（如ClinVar或位点特异数据库）和实验室自有数据库获得.为了对变异分类具有较好灵活性,基于收集的证据和专业判断,可以把某些依据用到不同的证据水平上去.例如,如果一个变异多次和已知致病性变异处于反式位置（位于另一染色体上）,PM3可以上调到强（进一步指导见PM3BP2顺/反式检测）.相反,在数据并不像描述的那么强的情况下,可以改判变异到一个较低的水平（见表3注2PS4）.如果一个变异不符合分类标准（致病的或良性的）,或良性和致病的证据是相互矛盾的,则默认该变异为“意义不确定的”.程度判断评价标准如表6所示.请注意,当考虑所有依据以解读变异证据强度的差异时,需专家介入进行判断.

下面更详细的变异分类标准（表3和4）中提及了某些概念的解释,并提供实际使用中的实例和/或误区或易犯错误的地方.这部分应该与表3及4一同阅读.

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3.1PVS1极强致病性变异

某些特定类型的变异（如无义突变、移码突变、经典剪接位点±1或2点突变、起始密码子变异、单个或多个外显子缺失）被认为因无转录产物或由无义突变引起的转录子降解,导致基因产物完全缺失而破坏基因功能.当将这类变异归类为致病性时,从业人员需谨慎考虑以下原则:

（i）当将该类变异归类为致病性时,需确认无功能变异（nullvariants）是已知的致病机理,且与该疾病的遗传模式相一致.例如,有些基因（如许多肥厚性心肌病基因）只有杂合错义突变时才致病,而杂合无功能变异却是良性的.仅基于这一项证据来看,对显性肥厚性心肌病来说,MYH7基因上出现一个新的杂合无义突变不一定是致病的,而CFTR基因上出现一个新的杂合无义突变则有可能是一个隐性致病变异.

（ii）当文献中将3′远端下游截短变异注释成致病突变时,要特别小心.特别是当所预测的终止密码子出现在最后一个外显子,或者出现在倒数第二个外显子的最后50个碱基对时,这种无义突变介导的转录降解可能不会发生,这个蛋白很可能会表达.据此所预测的截短蛋白的长度也是致病性评估的因素,但这些变异未经功能分析是无法进行判定的.

（iii）就剪接位点变异而言,因外显子剪切位点的供体/受体位点改变或产生了新的剪切位点,从而可能导致外显子丢失、缩短,也可能会使内含子序列变成外显子部分.虽然剪切位点变异可能被预测为无功能变异,然而该变异类型造成的影响需要通过RNA或蛋白质功能分析确认.还必须考虑可读框内缺失/插入的可能性,其长度变化较小（PM4）,可以保留蛋白质的关键结构域,因此导致轻微或中性效应,或功能获得效应.

（iv）基因会有不同的转录本,哪一种转录本与生物学功能相关,在哪些组织会表达哪些转录本,这些都是需要进行重点考虑的.如果一个截短变异只限于一个或并非所有转录本,则必须谨慎考虑到可能存在其他同功型蛋白质,防止过度解释.

（v）如果发现一个无功能变异位于某个外显子上,而该外显子先前无致病变异报道,那么该外显子可能被选择性剪切了,此时需要谨慎考虑该变异的致病性.当预测的截短变异是偶然发现时（与检测指征无关）则应特别小心,在这种情况下该位点致病的可能性非常低.

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3.2PS1突变为同一氨基酸

多数情况下,尤其是当致病机制是蛋白质功能发生改变时,如已确定某一错义变异是致病变异,应考虑到与其位于同一变异位点的不同形式的碱基改变也可能产生相同的错义突变结果——氨基酸改变相同（如c.34G>C（p.Val12Leu）和c.34G>T（p.Val12Leu））,那么,这些变异也应是致病突变.此外,还应考虑到,变异可能不是通过改变氨基酸的