温室气体生物捕捉器的重要发觉桔色藻的碳汇.docx

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温室气体生物捕捉器的重要发觉桔色藻的碳汇

肿瘤靶向和ATP敏感的金纳米棒抗癌研究

学校：

华中师范大学第一附属中学

年级：

高中一年级

学生姓名：

张嘉扬

指导教师：

王维佳

地址：

湖北省武汉市东湖高新技术

开发区汤逊湖北路特1号

摘要…………………………………………………………………1

前言………………………………………………………………3

1、材料与方式………………………………………………………5

2、结果与讨论………………………………………………………9

3、结论………………………………………………………………16

致谢………………………………………………………………16

参考文献…………………………………………………………16

肿瘤靶向和ATP灵敏的金纳米棒抗癌研究

张嘉扬高一年级

（华中师范大学第一附属中学湖北武汉430223）

摘要：

当前恶性肿瘤（通常被称为癌症）是危害人类健康的头号杀手，常规的化疗药物因为无法在肿瘤区域实现良好的富集而带来一些列的毒副作用。

具有肿瘤靶向能力，并且能够针对肿瘤细胞进行按时、定量给药的药物传递系统对于提高癌症医治成效和降低化疗药物的毒副作用起着相当重要的作用。

相较传统抗体和小分子有机靶向基团而言，生命大分子DNA适配子无免疫原性、稳固性好，对靶标具有更高的亲和力和特异性，且能够通过自组装形成具有多种生理功能的纳米组装体。

基于此，在本研究中我将具有肿瘤靶向功能和ATP灵敏的DNA适配子用作纳米阀门用于封堵介孔二氧化硅包覆的金纳米棒的孔道避免载入其中的化疗药物泄漏，以实现化疗药物的靶向性智能传递。

肿瘤细胞内含有丰硕的ATP，能够与ATP灵敏的DNA适配子杂交，致使DNA适配子从介孔二氧化硅包覆的金纳米棒表面脱落，触发化疗药物的释放。

另外，在近红外光照射下，金纳米棒吸收光能转化为热能，引发局部温度迅速升高，高温破坏DNA适配子的双螺旋结构也能加速药物释放。

定量药物释放研究说明，在ATP的作用下，60%药物在12小时内被释放；在近红外光照射下，80%药物在12小时内被释放；在二者一起作用下，化疗药物的释放速度变得更快，96%药物在12小时内被释放。

体外细胞实验和体内动物实验结果说明该纳米复合物能够特异性地靶向肿瘤细胞，且在ATP和近红外光双重刺激作用下，能够快速将化疗药物按需释放于肿瘤细胞内，进而杀死肿瘤细胞抑制肿瘤生长，且在相同的条件下，正常细胞的存活率高于85%。

总之，该多功能纳米复合物能够靶向性地杀死肿瘤细胞并降低化疗药物对正常细胞的毒副作用，有效地提高了癌症医治成效，为癌症患者带来新的希望。

本项目组合肿瘤靶向和ATP灵敏的双重功能的DNA适配子实现肿瘤细胞按时、定量给药，经科技查询，未见类似。

关键词：

DNA适配子，肿瘤靶向，操纵释放，刺激响应，癌症医治

Tumor-targetedandATP-sensitivegoldnanorodsforcancertherapy

ZhangJiayangSeniorgradeone

（MiddleSchoolattachedtoCentralChinaNormalUniversityWuhan430223）

Abstract:

Inordertoenhancethetherapeuticoutcomeofanticancerdrugs,enormousresearcheffortshavebeenmadetodeveloptheintelligentdrugdeliverysystemfortumor-targeteddrugdeliveryandreleasingthedrugintumorcellsspatiotemporally.Comparedtotraditionalantibodiesandsmallorganictumortargetinggroups,DNAaptamerwithmultiplefunctionsarenon-immunogenic,goodstability,andhaveahighaffinityandspecificitytothetarget,whicharepopulartouseastumor-targetedsegment.Therefore,thetumor-targeted（AS1411aptamer）andATP-sensitiveDNAaptamer（ATPaptamer）isusedasnano-gatekeeperandcappedonthesurfaceofmesoporoussilica-coatedgoldnanorodtopreventthedrugleakageandrealizethetargeteddrugdelivery.ATP,whichismarkedlyconcentratedinthecytoplasmicoftumorcells,wouldexclusivelycompeteagainstanchor-DNAandhybridizewithATPaptamertounlockthepores,triggeringtheexpeditiousdrugrelease.Undernear-infrared（NIR）lightirradiation（808nm,1W/cm2）,thegoldnanorodsconverttheNIRlightintoheat,andtherapidlyincreasedtemperaturetodestroythedoublehelixstructureofDNAtopromotedrugrelease.TherapidreleaseofdrugisobservedwiththepresenceofATPorNIRlight,andtheamountsofaccumulatedreleasewereapproximately60%and80%,respectively.Invitroandinvivoexperimentsdemonstratedthatthedesignednanocompositecanspecificallytargettotumorcellsandon-demandreleasethechemotherapeuticdrugsintumorcellsuponthestimulationwithATPandnear-infraredlight（NIR）,thusresultinginselectivekillingtumorcellsandinhibitingtumorgrowth,whilethecellviabilityofnormalcellsis>85%.Insummary,themultifunctionalnanocompositecouldeliminatetumorcellsspecificallywhileleavingnormalcellsuntouched,holdinggreatpromisingforcancertherapy.

Keywords:

DNAaptamer,tumor-targeted,controlledrelease,stimuli-responsive,cancertherapy

前言

众所周知，癌症已经成为要挟人类生命健康的头号杀手。

在众多医治手腕中，化疗是利用最普遍和最普遍的手腕。

可是传统的化疗药物普遍存在因无法在肿瘤区域富集（无靶向性）而致使的毒副作用大、生物利费用低等缺点，医治成效往往不佳且容易给患者带来极大的痛楚。

随着分子生物技术的快速进展，人们慢慢加深了对肿瘤组织微环境和肿瘤细胞微环境的熟悉与明白得。

对肿瘤医治而言，科研工作者发觉了很多新的医治靶点，提出了很多新的肿瘤医治理念。

很多具有特殊生理功能的生命大分子被接踵发觉和运用。

例如，很多DNA生命大分子能够特异性地靶向肿瘤细胞和响应如热、光、酶、离子、pH和ATP等生理刺激来改变自身结构和功能。

【1】其中专门值得一提的是ATP灵敏的DNA适配子，其能够特异性的与ATP结合；同时因ATP在细胞外的浓度低于mM，但在细胞质浓度却高达10mM，这为精准操纵细胞内的药物释放提供新的机缘。

【2】

最近几年来，金纳米棒（GNR），由于其表面优越的等离子体共振效应，能够快速吸收光能并转化为热能，已经被证明是一种高效光热医治（PTT）制剂。

【3】GNR已被普遍地用做造影剂、光热操纵药物释放和局部光热医治等领域。

但是，由于制备GNR利用的表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）具有专门大的细胞毒性和其本身相对较低的载药效率都严峻地限制其在医用领域的应用。

但是，由于介孔二氧化硅（Mesoporoussilica,MS）具有良好的生物相容性、比表面积大、孔径和孔容能够调剂且孔道均匀、表面易于修饰等优势，在载药和药物控释方面成为新的研究热点。

【4】二氧化硅涂层包覆已经成为提高金纳米棒运用价值最有效的方式。

通常介孔二氧化硅包覆的金纳米棒（MSGNR）具有以下优势：

1）较大的表面积便于修饰各类功能基团；2）可调的孔径和孔体积，能够有效负载药物分子；3）良好的生物相容性。

基于此，本论文拟制备双重智能响应的介孔二氧化硅涂层包覆的金纳米棒并用于肿瘤靶向医治。

由AS1411和ATP灵敏的适配子组成的多功能生命大分子DNA（AS1411/ATP）被用作纳米阀门。

其中，AS1411适配子能够特异性地与肿瘤细胞过度表达的核仁素（Nucleolin）结合，实现肿瘤靶向功能，且它形成的G-四链体结构（nm）能够用来封堵介孔硅的孔道，避免化疗药物泄漏。

【5】如图1所示，通过ATP灵敏的适配子和锚定在介孔硅孔道上的碱基配对，形成的DNA双螺旋链能够将AS1411/ATP固定在多功能二氧化硅包覆的金纳米棒表面，并避免化疗药物阿霉素的泄漏。

由于AS1411的主动靶向功能，该纳米复合物能够特异性被肿瘤细胞摄取。

且进入肿瘤细胞后，细胞质中高浓度的ATP将竞争性与ATP灵敏的适配子结合，使AS1411/ATP从孔道脱除，触发药物迅速释放。

另外，在近红外光的刺激下，金纳米棒将吸收光子能量并转换为热能，从而致使局部温度升高。

近红外光诱导的局部升温不仅可用于光热医治，同时高温也能诱导DNA双螺旋链解螺旋促使AS1411/ATP离去，致使介孔硅孔道打开，增进药物释放。

通过精心的设计，该多功能纳米复合物有机地结合了化疗和光热医治，能够高效杀死肿瘤细胞，提高癌症医治成效。

图1.用于癌症靶向医治的双重智能响应的DNA功能化的介孔二氧化硅包覆的金纳米棒。

锚定DNA序列：

COOH-TTTACCTTCCTCCGC

AS1411/ATP适配子序列：

GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG/ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT

1材料与方式

试剂和药品

四氯金酸三水合物（HAuCl4•3H2O），硼氢化钠（NaBH4），硝酸银和抗坏血酸（AA）均购于Sigma-Aldrich公司。

正硅酸四乙酯（TEOS），十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），和1-（3-二甲氨基丙基（-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC•HCl）购于国药集团（上海）化学试剂公司并直接利用。

锚定的DNA和AS1411/ATP适配子委托生工生物工程（上海）股分合成。

N,N-二甲基甲酰胺（DMF），二甲亚砜（DMSO），甲醇（MeOH），和三乙胺（TEA）购自国药集团（上海）化学试剂公司并蒸馏后利用。

盐酸阿霉素（Doxorubicinhydrochloride，DOX•HCl）购于浙江海正药业公司。

胎牛血清（FBS），胰蛋白酶（trypsin），青霉素链霉素，噻唑蓝（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT），磷酸盐缓冲液干粉（PBS），和细胞核染料（Hoechst33342）购于美国Invitrogen公司，直接利用。

介孔二氧化硅包覆的金纳米棒（MSGNR）的制备

第一用种子生长法制备金纳米棒。

【6】将mLHAuCl4（mM）与mLCTAB溶液（M）混合，匀速搅拌下加入mL冰的NaBH4（M），反映溶液当即变成棕黄色。

持续猛烈搅拌反映2min，然后将种子溶液保存在25oC（注意：

在3h之内利用）。

金纳米棒的生长液制备如下：

将200mLCTAB（M），mLAgNO3（4mM），13mLHAuCl4（23mM），190mL超纯水混合均匀后匀速搅拌，然后缓慢滴加5mLAA（M），溶液由棕黄色变成无色。

最后向生长液中加入mL种子溶液，室温持续搅拌反映12h，取得的金纳米棒用大量的超纯水洗涤，离心（11000rpm，25min）以除去过量的CTAB。

然后，将取得的沉淀物分散在100ml超纯水中，随后加入1mLNaOH（M）溶液。

随后，每隔30min向反映液中加入100µL的TEOS/甲醇（20％，V/V）的混合液，共3次。

温和搅拌反映6h后即取得MSGNR，并用水洗涤两次以除去未反映物质。

氨基化的MSGNR（MSGNR-NH2）的制备

3mLAPTES加入到分散有MSGNR（200mg）的50mL无水MeOH溶液中，并在室温下持续搅拌5h。

以后，将所得的纳米颗粒在HCl/MeOH（1%，V/V）溶液中回流6h以除去CTAB。

然后用大量的MeOH充分洗涤，离心，真空干燥即取得MSGNR-NH2。

锚定DNA修饰的MSGNR（MSGNR-DNA）的制备

将锚定DNA（150µL，mmol）,NHS（200µL，10mg/mL），和mgEDC•HCl（200µL，10mg/mL）溶解于1mL超纯水中并在室温下搅拌反映1h活化锚定DNA上的羧基。

然后加入1mgMSGNR-NH2到上述混合溶液中继续反映6h。

离心并用PBS洗涤数次，即取得MSGNR-DNA。

纳米阀AS1411/ATP适配子修饰的MSGNR（MSGNR-AS1411/ATP）的制备

第一将AS1411/ATP适配子（200µL，mmol）溶解在PBS缓冲溶液中，并在室温下震荡2h形成稳固的G-四链体结构。

然后加入锚定DNA修饰的MSGNR并继续震荡。

6h后，AS1411/ATP适配子和锚定DNA形成杂化结构，封堵在MSGNR-DNA表面取得MSGNR-AS1411/ATP纳米复合物。

离心并用PBS洗涤数次，即取得MSGNR-AS1411/ATP。

化疗药物阿霉素（DOX）的封装

称取mgMSGNR-DNA并将其分散在1mg/mL的DOX的PBS缓冲溶液中（pH，10mM），室温震荡留宿。

然后依照的方式将AS1411/ATP适配子修饰在该纳米载体上，即取得装载了DOX的MSGNR-AS1411/ATP（DOX@MSGNR-AS1411/ATP）。

DOX的载药量通过已成立的荧光标准曲线来确信。

介孔二氧化硅包覆的金纳米棒的表征

金纳米棒和介孔二氧化硅包覆的金纳米棒材料的形貌与粒径散布用透射电子显微镜（TEM，JEM-2100）表征；其孔径散布情形、比表面积和孔容积等用孔隙度分析仪（BET，BJH，ASAP2020，Micromeritics）表征；Zeta电位仪（Nano-ZSZEM3600，MalvernInstruments）用来测量不同纳米粒子的表面电势。

不同纳米材料的吸收光谱用紫外可见分光光度计（LAMBDABio40，Perkin-Elmer）来测量。

采纳808nm的近红外激光器进行光热性能转换和光热医治研究。

通过FLIRAx5近红外照相机（FLIRSystemsAB，Sweden）检测光热转换和近红外成像。

体外药物操纵释放性能的研究

称取1mgDOX@MSGNR-AS1411/ATP分散于4mLPBS缓冲溶液中，然后平均分成四份并别离装入透析袋中（MWCO：

3500Da），以后在四种不同的条件下进行释药：

1）不作任何处置；2）利用808nm的激光照射10min，功率（1W/cm2）；3）加入20mMATP；4）加入20mMATP同时利用808nm的激光照射10min，功率（1W/cm2）。

在特定的时刻距离掏出透析液，并用荧光分光光度计（RF5301PCspectrofluorophotometer）测定其DOX释放量。

体外细胞共培育

多功能纳米复合物DOX@MSGNR-AS1411/ATP与细胞的共培育实验以SCC-7细胞和COS7细胞作为对象细胞进行。

第一将SCC-7细胞和COS7细胞别离以1×105个/孔的密度接种于6孔细胞培育板中，每孔加入1mL含有10%FBS和1%抗生素的DMEM培育基，然后在含5%CO2的培育箱中于37oC下培育24h。

以后，别离将200µg纳米复合物材料分散于2mL含有10%FBS和1%抗生素的DMEM培育基中，将此溶液平均分成两份，别离加入到细胞培育板中于37oC下共培育4h。

另外，为了研究近红外光加速药物释放的行为，与纳米复合物共培育的细胞用808nm的激光照射5min，功率为1W/cm2。

然后再弃去孔中的培育基并用1mLPBS清洗3次。

用Hoechst33258将细胞核染色，然后用4%的多聚甲醛溶液固定细胞，以后用激光共聚焦显微镜（CLSM，NikonC1-si，BDLaser）观看，DOX的荧光荣用波长为488nm的激光器激发，Hochest33258的荧光荣用波长为405nm的激光器激发。

体外细胞毒性的测定

在本研究中通过MTT法测定了多功能纳米复合物DOX@MSGNR-AS1411/ATP对SCC-7细胞和COS7细胞的体外细胞毒性。

简而言之，CC-7细胞和COS7细胞别离接种于96孔细胞培育板，每孔细胞6000个。

然后加入100µL用DMEM培育基分散的DOX@MSGNR-AS1411/ATP与之共培育。

4h后，吸取材料换成新鲜的培育基。

对光热医治而言，细胞用808nm的激光（1W/cm2）照射5min。

未经任何处置的细胞用作空白对照。

44h后，将20µL的MTT溶液（5mg/mL）加入每一个孔中并进一步孵育4h。

在这以后，去除培育基，加入200µL的DMSO，混匀并用酶标仪（MultiskanGO，ThermoFisher）记录每一个孔在570nm的吸光值。

细胞的相对存活率（%）=（OD570（samples）/OD570（control））×100%，其中OD570（control）是没有加入材料的吸光值，OD570（samples）是加入材料的吸光值。

OD值的测定是基于4个独立平行样取平均值，结果表示为平均值±标准误差（SD）。

体内抗肿瘤研究

用于动物实验的BALB/c裸鼠（雌性，5-6周龄）购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

本文中的所有动物实验操作符合国家相关规章制度。

皮下肿瘤模型通过在每只裸鼠于皮下接种1×107个SCC-7肿瘤细胞来构建。

当肿瘤生长至体积约100mm3时，荷瘤小鼠被随机分成四组，每组5只裸鼠，并别离同意以下医治：

1）单纯的PBS；2）自由阿霉素，其中阿霉素的剂量为2毫克每千克老鼠体重；3）DOX@MSGNR-AS1411/ATP，其中阿霉素的剂量为2毫克每千克老鼠体重；4）DOX@MSGNR-AS1411/ATP，其中阿霉素的剂量为2毫克每千克老鼠体重并用808纳米（3分钟，1瓦每平方厘米）的激光照射。

小鼠的体重用天平测量，肿瘤的大小用游标卡尺进行测量，其中肿瘤体积由以下公式进行计算V=W2×L/2，其中W和L别离代表肿瘤的最短和最长的直径。

医治到12天时，由于PBS对照组的小鼠肿瘤过大，处死所有小鼠，终止实验。

2结果与讨论

多功能纳米复合材料DOX@MSGNR-AS1411/ATP的制备与表征

在本文中，金纳米棒通过采纳种子生长法制备。

从图2A的透射电镜图片能够看出，GNR的平均长度和宽度别离约为±nm和±nm，其长径比为，这种长径比的金纳米棒具有良好的近红外光光热转换效率，有利于实现光热医治。

随后，通过以CTAB有机分子为模板剂采纳溶胶凝胶法在金纳米棒表面修饰介孔二氧化硅壳层以制备MSGNR。

如图2B的透射电镜图片所示，衬度较低的GNR表面包覆着大约12nm厚度的二氧化硅外壳。

紫外可见光吸收光谱扫描显示（图2C），GNR被介孔二氧化硅包裹后，MSGNR的纵向等离子共振峰蓝移了33nm，落至791nm左右处，但吸收强度大体没有发生转变，说明MSGNR吸收近红外光能力不受二氧化硅包裹的阻碍，从而也不阻碍其光热转换成效。

横向等离子共振峰没有发生明显位移，仍维持在520nm左右处。

纵向等离子共振峰蓝移要紧是因为介孔二氧化硅壳层对近红外光产生轻微的折射,造成吸收峰位移。

N2吸附脱附等温分析能够看出MSGNR的比表面积为439m2/g（图2D），孔径约为nm（图2E）。

在MSGNR与APTES反映并用盐酸/甲醇混合溶液处置除去表面活性剂CTAB以后，取得MSGNR-NH2纳米粒子。

从表1能够看出，原始MSGNR的Zeta电位为mV，在氨基化以后其电势转变为+mV。

随后，锚定DNA通过酯化反映被修饰在MSGNR-NH2表面。

键接锚定DNA后，MSGNR-DNA的电势急剧下降至mV。

以后，通过DNA杂交原理，AS1411/ATP适配子被修饰在MSGNR-DNA表面形成多功能纳米复合物MSGNR-AS1411/ATP。

一方面，AS1411适配子的能够自组装形成G-四链体结构（nm）能够用来封堵介孔二氧化硅的孔道，避免化疗药物泄漏；另一方面，AS1411适配子能够特异性与肿瘤细胞过度表达的核仁素相结合实现肿瘤靶向给药。

通过DOX的荧光标准曲线，计算得出阿霉素在纳米复合材料DOX@MSGNR-AS1411/ATP中质量百分比为%。

表1.不同纳米粒子的Zeta电势

样品

Zeta电势（mV）

MSGNR

MSGNR-NH2

MSGNR-DNA

MSGNR-AS1411/ATP

DOX@MSGNR-AS1411/ATP

图2.A）GNR的透射电镜图片；B）MSGNR的透射电镜图片；C）GNR和MSGNR的紫外可见光吸收光谱；D）MSGNR的N2吸附脱附等温分析测试结果；E）MSGNR的孔径散布。

纳米复合物DOX@MSGNR-AS1411/ATP的光热转换性能和智能可控释药的研究

为了研究纳米复合物DOX@MSGNR-AS1411/ATP的光热转换性能，808nm的近红外激光被用来照射DOX@MSGNR-AS1411/ATP溶液并通过FLIRAx5近红外照相机记录其温度的转变。

如图3A和3B所示，在近红外激光的照射下，纳米复合材料溶液的温度在短时刻内慢慢上升，且温度上升速度与该纳米复合的浓度和激光功率成正比。

例如，当DOX@MSGNR-AS1411/ATP的