微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价片双黄连片质量标准研究.docx
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微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价片双黄连片质量标准研究
微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价的片、双黄连片的质量标准研究
陕西中医学院
硕士学位论文
微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价的片、双黄连片的质量标
准的研究
姓名：
王光建
申请学位级别：
硕士
专业：
中药学
指导教师：
张恩户
2011-04
摘要
目的：
设计不同的方法分别对牛黄上清片、芩连片和双黄连片进行提取，考
察所得到的提取物对六种不同标准菌株的药物敏感性，筛选出合适的实验药物和
敏感菌株。
采用微孔浊度法研究得出牛黄上清片的适用剂量范围，建立量效标准
曲线，并且根据量效标准曲线测定牛黄上清片的效价、不同厂家和不同剂型牛黄
上清的效价，从而制定牛黄上清片的质量标准草案。
方法：
采用正交实验设计得到三种药物的不同提取物，通过菌敏实验考察三
种药物不同提取物对六种标准菌株（大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌
ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853、枯草芽胞杆菌CMCCB63501、短
小芽孢杆菌CMCCB63202、白色念珠菌CMCCF98001）的敏感程度。
根据
不同药物提取物的抑菌结果，选出三种药物中最适合应用生物检定法控制质量的
一个和敏感菌株。
参照并运用中国药典（2010版）二部抗生素效价测定的方法
和血清药理学，建立量效标准曲线，进行稳定性、重复性、回收率等方法学考察。
根据量效标准曲线测定牛黄上清片的效价、不同厂家和不同剂型的牛黄上清的效
价。
结果：
牛黄上清片、芩连片和双黄连片的不同提取物对六种标准菌株均显现
出了抑菌效果，但是以牛黄上清片加10倍量的水煎煮1.5h，加50%乙醇沉淀后
的提取液对金黄色葡萄球菌的抑杀最为明显，选它为供试品、金黄色葡萄球菌为
实验菌株。
当黄芩苷和栀子苷以5：
2混合后，浓度在0.016～0.080g/mL范围内
时,两种成分混合的浓度对数剂量和效应呈线性关系，且相关性良好（r0.9893）；
根据混合物的量效曲线测定三个不同厂家的牛黄上清片的效价按从大到小顺序
分别：
丙厂lgR1448.28U/g、甲厂lgR1431.03U/g、乙厂lgR1396.55U/g；牛黄
上清片不同剂型的效价按从大到小顺序分别：
丸剂lgR1633.33U/g、胶囊剂
lgR1416.67U/g、片剂lgR1383.33U/g。
结论：
微孔浊度法建立的牛黄上清片质量标准，结果可靠。
在线性范围内，
采用一剂量法，以中成药中所含主要成分的适当配比制成的混合物做为对照品，
对此中成药进行生物检定，方法可行。
关键词：
牛黄上清片芩连片双黄连片微生物检定法微孔浊度法
2
NiuhuangshangqingTabletofbezoarsupernatantturbidity
microporousfilmofantibacterialpotency
ABSTRACT
Objective:
DesignedtoextractNiuhuangshangqingTablet,QinlianTablet,
ShuanghuanglianTablet,studyextractsroleinsixdifferent
bacteriostasisofthesensitivity,selectedappropriateexperimental
drugsandsusceptiblestrains.Withporousbacteriostasisobtainedby
turbidimetryofthedoserangeofapplicationoftestmethodstoestablish
thestandarddose-responsecurve,andthedeterminationof
NiuhuangshangqingTabletbasedondose-responsecurves,
NiuhuangshangqingTabletmadebydifferentmanufacturersandfrom
differentformulationsofPotency,todevelopqualitystandardsof
NiuhuangshangqingTablet.
Method:
ThreeDrugsofdifferentextractsbybacteriasensitive
experimentalstudyofthreedrugsofdifferentextractsonthesix
bacteriostasisEscherichiacoliATCC25922,StaphylococcusaureusATCC
25923,PseudomonasaeruginosaATCC27853,BacillussubtilisCMCCB
63501,BacilluspumilusCMCCB63202,CandidaalbicansCMCCF98001
antimicrobialactivity.Selectedthebestexperimentaldrugsand
experimentalbacteriostasisbytheresults.Toestablishdose-effect
curvesaccordingtothebioassaymethodofantibioticeffectextentas
describedinPharmacopoeiaofthePeole’sRepublicofChina2010and
plasmapharmacology,tocheckthestability,repeatability,recoveryand
othertests.Accordingtothestandardcurvemeasuredof
NiuhuangshangqingTabletdifferentmanufacturersanddifferentdosage
forms.
Results:
NiuhuangshangqingTabletwith10timestheamountofwater
boiling1.5h,plus50%ethanolextractafterprecipitationasthetest
drug,Staphylococcusaureusasthetestbacteriostasis,Whenbaicalinand
geniposideto5:
2mixtureconcentration0.016~0.080g/mLrange,the
concentrationoftwoingredientsmixedeffectonthenumberofdoseand
3
responseislinear,andagoodcorrelationR0.9893;basedonamixture
ofthreedifferentdose-responsecurvemeasuredNiuhuangshangqingby
descendingorderofpotencywere:
BingchanglgR1448.28U/g,Jiachang
lgR1431.03U/g,YichanglgR1396.55U/g;bezoarsupernatantpotency
ofdifferentpreparationsoffilmsbydescendingorderwere:
pillslgR
1633.33U/g,capsuleslgR1416.67U/g,tabletlgR1383.33U/g.
Conclusion:
Microbiologicaltestmethodbasedonestablishedquality
standardofNiuhuangshangqingTablet,resultsarereliabl.Inacertain
concentrationrange,tomedicineinthemajorcomponentmadeofamixture
oftheappropriateratioasstandard,thisproprietarybiologicaltesting,
themethodisfeasible.
;
KeyWordsNiuhuangshangqingTabletQinlianTablet;Shuanghuanglian
Tablet;Microbiologicaltest;Microporousturbidimetry
Author:
Wangguangjian
Tutor:
Zhangenhu
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陕西中医学院学位论文独创性声明及使用授权声明
学位论文独创性声明
本人郑重声明：
所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研
究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。
除文中已经特别加以注明引用的内容
外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。
对本文的研
究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。
本人完全意
识到本声明的法律结果并由本人所承担的法律责任。
学位论文作者签名＿＿＿＿＿
日期：
年月日
关于学位论文使用授权的声明
陕西中医学院有权保留使用本人学位论文，同意学院按规定向国家有关部门
机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。
本人授权陕西中医学院可
以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩
印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。
可以公布（包括刊登）论文的全部或
部分内容。
（保密论文在解密后应遵守此规定）
论文作者签名＿＿＿＿＿日期：
年月日
论文导师签名＿＿＿＿＿日期：
年月日
1
微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价的研究
引言
一、研究背景和选题依据
中药多来源于自然界中植物的各个生长部位、动物器官及特殊产物和矿物，它们
都有着所含有效成分多而复杂的特点，要想弄清楚哪些成分在起药效作用是十分困难
的。
所以如何能够更好的对中药的质量进行全面的控制，一直是中医药研究和生产的
热点和难点问题，这一问题也一直制约着中药向现代化和国际化发展。
中药本身的有
效成分复杂且大多数结构不清楚，因而与化学合成药物由单一成分或几个特定成分组
成相比有显著的区别。
加之中药的品种、采收时间、产地、贮藏、加工方法等诸多因
素都会在一定程度上影响中药成分，造成作用成分有很大可变性，这样在中药的质量
控制上，仅仅像控制化学合成药物一样测定少数几种有效成分或指标成分，不足以确
保中药或制剂质量。
况且在服用中药和制剂的过程中，在体内酶或者酸碱条件下也可
能发生很多代谢反应，这样就导致其成分有很大的改变。
因此，建立中药质量控制新
[1]
标准具有非常重要的意义。
随着科技的进步，我们通过更多的检测手段和工具来控制中药质量，例如中药指
纹图谱技术，生物芯片技术等，但是这些技术有其先进性，也有不足的方面。
他们多
是通过测定一个或几个中药成分来控制中药质量，即多是从一个局部去反应整体。
但
是往往一种药材含有的某一单独成分不可能完全代表它的功能和主治，且这一成分含
量的多少也不能和它的药效产生直接联系，如测定小檗碱不能区分是黄连还是黄柏，
单独依靠它们含量的多少也不能准确地反映质量的优劣；以绿原酸作为忍冬藤、金银
花及菊花质量评价的指标不能充分体现三者的临床功效特点[2]。
因此，通过测定1-2
个指标成分的方法较难全面科学地评价药材或其制剂的质量[3]。
目前，在进行中药质量控制时，被广泛应用的中药指纹图谱技术存在一定的局限
[4]
性。
主要反映在以下几个方面：
（1）已建立的中药定性鉴别方法有些难以找到特征
成分或标准对照药材，使得很多鉴别缺乏专属性和统一性。
（2）所选择的指标性成分
是否与中药整体的药效相关？
所选的成分能否真正代表中药的药效？
如冬虫夏草测
定腺苷的含量，板蓝根检测告依春的存在，而腺苷和告依春既不是其有效成分，也不
是专属性成分，检测它们来对中药质量进行控制有没有实际意义[5、6]，这些问题都值
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陕西中医学院2011届硕士学位论文
得商榷。
（3）中药指纹图谱的重现性、耐受性、专属性、量效关系以及谱效关系等方
面的内容还需更深层次的研究。
某些中药即使检测的是有效成分，但往往量效关系不
明确，也难以实现对其质量的有效控制和评价。
如人参的主要有效成分为人参总皂苷，
人参主根一般为2%，人参须约含5%，人参叶竟高达10%，但这样并不能说明人参
叶和人参须的药效优于人参主根[7]，同时也说明通过这种方法检测的成分含量多少，
不能与药效成正比关系。
一味中药可能含有几种或十几种化学成分，有些以至于含有
几十种化学成分，它们能否代表中药的功效，这还需要验证。
况且，中药制剂在服用
过程中可能产生其他新的成分，这样用这种细分法无疑南辕北辙，难以体现中医药的
整体观念，难以客观的评价中药质量和药效。
因此，中药指纹图谱技术在一定程度上
忽略了中药成分与药效的关系。
中药的应用在我国有着悠久的历史，早在夏、商时期，人们就开始通过吃草药来
治疗一些疾病。
中药能够延续至今仍在使用，也说明它有很高的治疗疾病的价值。
我
们长期使用中药治病的过程，其实就是一个临床试验的过程，虽然目前我们还不能完
全弄清楚每味中药治疗疾病的具体成分或物质基础，但是他却清楚的表现出来了临床
疗效。
近年我们一直在努力实现中药的现代化，让中药清晰化，得到国际认可，但是
结果并不理想。
中药之所以称作“中药”可能就是因为中药是中医传统理论和经验信息
的载体，如果剥除了它承载的中医传统的信息，将和其他任何国家的草药没有区别，
[8]
只能沦为筛选单体活性成分的资源，传统的功能和主治必丧失殆尽。
因此，对于中
药的研究还是要从整体上入手，而不是将它分解成几个小的部分。
我国中医药工作者把大部分工作放在中药化学成分的研究中，致使化学成分与生
物活性研究的脱节，但至今大部分中药的有效成分仍未得以很好阐明。
据统计，《中
国药典》2005年版（一部）共收载中药材（含饮片和提取物）572种，其中只有60%
有过化学成分研究报道，约20%进行过较系统的化学成分研究，至于已阐明其有效成
分的品种更是不到5%。
即使明确了有效成分的中药，也存在量效关系不明确，或者
本身就没什么量效关系等问题。
基于现行中药质量控制的不足，我们初步提出了用生物检定法来对中药质量进行
控制和评价。
当今社会所用的药物大体可以划分为三大类，即中药、化学合成药和生
物制剂。
目前，我国的中药基本上是“套用”的化学合成药的质量控制模式，就是象化
学合成药一样，研究单一或几个成分。
但从中药与生物制剂和化学合成药的物质内涵、
生产工艺与质量控制特点等方面分析，中药应“接轨”于生物制剂的主要以活性检测为
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微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价的研究
主的质量控制模式，而不应“迎合”化学合成药的以有效成分定量为主的质量控制模式
[9]。
三类药物在各方面的比较主要表现在以下三个方面：
（1）中药特别是有效部位制
剂与众多的生物制剂有很大的相似性，即二者一般不是由单一化合物组成，而是由一
种甚至多种化合物组成，而化学合成药几乎都是由单一成分或几个特定成分组成。
（2）
化学合成药的物质内涵和质量标准是唯一的，与制备工艺流程和条件无关；而生物制
剂和中药制剂的物质内涵和质量标准与制备工艺流程和条件关联密切，制备工艺流程
或条件不同，生物制剂和中药制剂的物质内涵就不同。
（3）化学合成药主要采取化学
成分测定的方式，成分量与药效有直接关系；生物制剂主要采取生物效价检测的方式，
也有测定蛋白或氨基酸量，但其量的测定只作为纯度考察的参考指标，对生物制剂的
质量控制不具有决定性意义；中药制剂采取的是化学定性鉴别和指标成分定量的方
式，一般没有生物活性或生物效价检测项[10]。
对于中药产品，从某种意义上讲，生物
活性或生物效价测定与化学成分测定相比，具有更大的实用价值和优势，不仅可以鉴
定品种和质量，而且可以评价药效，甚至观察不良反应，适合于中药质量控制与评价
[11、12]。
中药是天然物质，化学成分复杂，与上述的生物制剂有许多相似之处，甚至
在某种程度上中药可视为天然环境条件中产生的生物制品。
因此采用生物检定法控制
中药质量从理论上是可行的[13]。
二、国内外研究现状和发展动态
结合现在多数国家用生物检定法控制抗生素和成分复杂的生物制剂的质量，大部
分中药来源于动植物，成分有很多不确定性，中药效价的生物检定法符合中医的整体
观，动物模型和体外试验方法又为此法奠定了基础，这些都为应用生物检定法控制中
药质量提供了参考。
它的优势主要表现在以下几个方面：
（1）直接考察中药的有效性
和安全性。
（2）有确切的量效关系，可为临床用药剂量提供参考。
（3）不用顾虑中药
具体的物质组成，不受物质基础研究进程的限制，符合中药物质基础研究现状及中医
理论。
（4）生物检定法不仅可量化中药的效价值，生物效应谱还可为中药品种、品质
定性鉴别提供重要依据[14、15]。
我国学者楼之岑早在1950年就利用小鼠服植物性泻剂
后排出湿便这一原理，建立了植物性泻剂的生物检定方法[16]。
这也为说明我们用生物
检定法来控制中药质量有一定可行性。
生物检定法（Bioassay）是指包括整体动物、离体组织、器官、细胞和微生物等
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陕西中医学院2011届硕士学位论文
评估药物生物活性的一种方法。
它以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运
用特定的实验设计在一定条件下比较供试品和相当的标准品或对照品所产生的特定
反应。
通过等反应剂量比的运算或限值剂量引起的生物反应程度，从而测定供试品的
效价、生物活性或杂质引起的毒性。
它属于定量药理学范畴[17]，主要用于药物效价
的测定、建立检验方法、比较药物作用强度、微量生理活性物质的测定、残留农药的
测定等[18]，另外，特别适用于成分复杂、具有多种功能相似的已知和未知活性成分药
品的定量或半定量测定。
但是，中药的生物检定法又不等同于一般的药理学实验方法，
须具备定量药理学和药检分析的双重属性和要求[19]。
因为大部分中药有效成分不明，
或者有效成分多而复杂；药材和制剂的含量测定限量缺乏有效剂量的概念；按传统医
学的观点分析，绝大多数的中药的性味、归经是清楚的，功效是具体明确的。
这无疑
为生物检定法作为中药的质控指标加大了筹码。
生物检定法一直是测量抗生素的抗菌效价经典成熟的方法，而且成本不高，有相
当一部分抗生素药品采用此法测定含量。
目前国际上通用的测定方法有管碟法和浊度
法。
各国药典均有采用，我国药典亦收载了管碟法和浊度法。
管碟法是利用药物在培养基内的扩散作用，比较标准品和供试品两者对接种的试
验菌产生抑菌圈的大小，以测量供试品效价的一种方法。
它的特点为结果较稳定，基
本操作和设计适用比较广泛，并适用于多批样品的测定。
但它也存在一些问题，首先，
由于其原理是以扩散为基础，所以只要是能影响扩散的因素，就能影响测定结果的准
确性。
由于抑菌圈的大小受扩散系数、扩散时间、药物的总量、培养基的厚度及最低
抑菌浓度等因素的影响，所以这些因素的不稳定性都会影响到实验结果的可靠性。
其
次，该测定方法又是以药物浓度与抑菌圈直径呈直线关系的平行线原理而设计的，因
此对影响直线的斜率、截距及直线平行的诸因素，也必须加以控制，方可保证检验结
果的准确可靠。
最后，它要求样品和对照品基本相同，并且试验过程长第2天才能
得到结果，且是手工操作，可能产生的误差会更大[20]。
所以要想得到精确的实验结
果必须很好的控制这些可能影响到实验结果的因素。
比浊法是利用药物在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细
菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价。
比浊法与管碟法相比具有快速、准确、灵敏、精确度高的优点，在国际上这两种方法
是并存的，但在国内，基于测量仪器的限制，比浊法应用较少。
《中国药典》2000年
版收载有24个品种采用管碟法，从2005年版药典开始收载采用比浊法。
且随着比
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微孔浊度法测定牛黄上清片抗菌效价的研究
浊法测定的自动仪器的研制，采用在线测定吸光度的方法，进一步简化了本法的操作
过程，减小试验误差，有利于比浊法的推广和普及，其替代管碟法成为必然的发展趋
势[21]。
基于本实验前已经对黄连、金银花、连翘、苦参、穿心莲、丹皮、板兰根、鱼腥
草等常见的清热解毒药用生物检定法做了质量评价，后来还研究了黄连上清丸复方，
实验结果表明黄连、连翘、穿心莲等可以采用生物检定法进行质量控制[22-28]。
但是上
述实验均用的管碟法测定的药物效价，经过前期的研究，发现管碟法测定中药的效价
有标准曲线斜率太小，灵敏度不够的缺点，我们旨在用类似于比浊法的微孔浊度法做
进一步的实验。
我们选取以下三种复方作为目标复方进行筛选。
牛黄上清片的组成包括人工牛黄2g、薄荷30g、菊花40g、荆芥穗16g、白芷
16g、川芎16g、栀子50g、黄连16g、黄柏10g、黄芩50g、大黄80g、连翘50g、
赤芍16g、当归50g、地黄64g、桔梗16g、甘草10g、石膏80g、冰片10g。
主
要功效为清热泻火，散风止痛。
用于热毒内盛、风火上攻所致的头痛眩晕、目
赤耳鸣、咽喉肿痛、口舌生疮、牙龈肿痛、大便燥结[29]。
芩连片的组成包括黄芩213g、连翘213g、黄连85g、黄柏340g、赤芍213g、甘
草85g。
主要用于清热解毒，消肿止痛。
用于脏腑蕴热，头痛目赤，口鼻生疮，热痢
[30]
腹痛，湿热带下，疮疖肿痛。
双黄连片的组成包括金银花1875g、黄芩1875g、连翘3750g。
主要用于疏风解
表，清热解毒。
用于外感风热所致的感冒，症见发热、咳嗽、咽痛[31]
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