影响微生物生长之因子.docx

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影响微生物生长之因子

微生物分離技術

劃碟法、塗碟法、倒碟法

【外加米酒製作】

1.前言

微生物的培養方法有兩種：

（1）混合培養

（2）純種培養

混合培養:

使用一種以上的微生物（混合菌種）來培養，來產生群體生存的特性。

純種培養:

則使用單一的微生物菌種及其衍生細胞來進行。

因混合培養需針對每一種微生物的型態及特性來進行單一的分析和鑑別，才能針對微生物相互間的影響來加以探究。

而純種培養則是微生物實驗裡既基礎且常見的步驟，又分為兩類

（1）增殖

（2）分離培養兩種程序。

2.目的

這次的實驗只要以微生物分離來進行，因微生物可經由增殖步驟將要研究的菌種在選擇性培養基大量繁殖，仍有一些其他菌種存於其中，無法完成純化，需進一步使用分離技術，使微生物分離為獨立的菌落，來達到純種培養，此方法主要讓菌數次數漸次減少，最後達到單獨分離，最常使用有:

（1）倒碟法

（2）塗碟法

（3）劃碟法

（3）液體分離培養法

此次實驗採用前3種方法來進行使用。

3.步驟:

【塗碟法】

（1）將菌液先行稀釋（連續10倍稀釋）10-1，10-2，10-3，10-4，10-5

再取0.1mL（固定量），滴於已準備好培養皿中央

（2）三角彎棒浸於酒精容易中，取出再以燃燒法將酒精燃盡，降溫後才可塗碟

（3）塗碟時，用三角彎棒將菌液均勻塗抹在培養基上

（4）放在37℃培養箱培養，觀察及計算菌數一般以30~300個菌為主

（5）將菌數回推原液菌/mL，必要時取平均值±標準偏差

【倒碟法】

（1）紀錄菌種來源，將菌液進行10倍稀釋10-1，10-2，10-3，10-4，10-5

再取0.1mL固定量菌液

（2）配置適量豐富培養基（每個培養基25mL）共5個培養皿，總共125mL，推算

適量之豐富培養基與二段水混合均勻後，放置於高溫高壓滅菌釜，待其冷卻

（3）培養基冷卻時，要注意不能讓培養基凝固，待培養基大約45℃~50℃時，

將稀釋好之菌液加入，充分混合，在倒入空的滅菌過之培養皿

（4）放於37℃培養箱培養，隔天觀察並計算菌數，推回原液菌數

（5）與塗碟法結果做比較

【劃碟法】

（1）取5個含豐富培養基之培養皿，將接種環以火焰燃燒法考至通紅，

將接種還伸入菌液取樣

（2）在凝固之培養基上開始劃碟，注意路徑不要重複，完成第1次劃碟

（3）完成第一次劃碟後，將接種環再以火焰法滅菌，要先讓接種還在培養基

空白處降溫再以部分第一次劃碟區為菌來源，劃第二次碟

（4）如此重複直至完成剩餘的4次劃碟

【米酒製造】

（1）先拿5公升桶，內裝2公升冷水備用。

（2）再精秤冰糖1公斤，並將其與1公升熱水溶解之。

（3）全部溶解後，倒入桶內，與冷水混合均勻。

（4）再把1公斤小米與5克酒麴加入桶內，蓋上瓶蓋，即完成。

（5）每天混合攪拌一次，並鬆開瓶蓋透氣一次

（6）米心熟透後。

酒麴液體至茶水色，無氣泡冒出時，即停止實驗，準備蒸餾。

（7）剛蒸餾完之米酒，最好放置一段時間，使其熟成，再使用。

設備:

【微生物分離器材】

培養皿*5

含培養基培養皿*10

三角彎棒

酒精燈

安全吸球

接種環

隔熱手套

燒杯

錐形瓶

玻璃瓶

試管架

定量玻璃吸管

取藥杓

秤藥紙

【微生物分離儀器】

電子天平

高溫高壓滅菌釜

恆溫培養箱

【微生物分離藥品及採樣來源】

豐富培養基

汙水（實驗室前水池）

二段水

【米酒製作材料與器材】

5000CC桶子

攪拌棒

小米（1公斤）

酒麴（5公克）

水（2公升冷水+1公升熱水）

糖（1公斤）

3.結果:

【倒碟法】

10-1菌落數為19

原菌液體:

19*10*10=1.9*103/mL

10-2菌落數為16

原菌液體:

16*102*10=1.6*104/mL

10-3菌落數為13

原菌液體:

13*103*10=1.3*105/mL

10-4菌落數為8

原菌液體:

8*104*10=8*105/mL

10-5菌落數為6

原菌液體:

6*105*10=6*106/mL

平均值:

Xbar=（1.9*103+1.6*104+1.3*105+8*105+6*106）/5=13.9*105

標準差:

σ=[{（1.9*103-13.9*105）2+（1.6*104-13.9*105）2+（1.3*105-13.9*105）2+（8*105-13.9*105）2+（6*106-13.9*105）2}/5]1/2=23.2*105

【塗碟法】

10-1菌落數為113

原菌液體:

113*10*10=1.13*104/mL

10-2菌落數為63

原菌液體:

63*102*10=6.3*103/mL

10-3菌落數為42

原菌液體:

42*103*10=4.2*105/mL

10-4菌落數為25

原菌液體:

25*104*10=2.5*106/mL

10-5菌落數為15

原菌液體:

15*105*10=1.5*107/mL

平均值:

Xbar=（1.13*104+6.3*103+4.2*105+2.5*106+1.5*107）/5=35.9*105

標準差:

σ=[{（1.13*104-35.9*105）2+（6.3*103-35.9*105）2+（4.2*105-35.9*105）2+（2.5*106-35.9*105）2+（1.5*107-35.9*105）2}/5]1/2=57.8*105

【劃碟法】

10-1菌落數為12

10-2菌落數為13

10-3菌落數為14

10-4菌落數為16

10-5菌落數為16

4.問題:

Q1：

討論你們這組以三種分離技術（劃碟法、塗碟法與倒碟法）所得之實驗結果是否成功地分離微生物，即在培養基上形成單一菌落?

若無單一菌落，說明實驗可能失敗的原因。

Ans:

有，大多是單一菌落，不過有一些仍無法形成單一菌落，原因可能稀釋的倍率不夠高、定量玻璃吸管沒有洗乾淨或混合不均勻都有可能會造成無法產生單一的菌落，造成結果失敗。

Q2：

試述劃碟法、塗碟法與倒碟法的實驗原理、步驟與其實驗中應注意事項?

Ans:

（1）倒碟法：

又稱混合稀釋法，步驟是將樣品試液1ml放入9ml的二段水中，充分混合成為10-1倍稀釋菌液，依此步驟稀釋10-2和10-3倍連續吸試之菌液，在連同從高溫高壓滅菌釜出來的尚未形成固體的培養基（40。

~50。

），一同放入滅菌之培養皿中，搖晃均勻等其凝固後放置培養箱中進行培養，就可得分離之菌體。

這個方法可以獲得極佳的分離效果並可使用微生物的計數。

（2）劃碟法：

利用接種環將待要分離的液體養品均勻劃於固體的培養基上，可以將混合生長的的菌落分離為單一菌落來產生純種培養的目的，但這方法需要技巧才能把菌體分開。

（3）塗碟法：

滴入稀釋完成的菌液於培養皿上，利用三角彎棒，塗抹菌易讓其均勻分布於固體培養基的表面，這方法常用於菌體計算。

實驗應注意要點:

（1）倒碟法時，需特別注意從高溫高壓滅菌釜出來的培養基不可使其凝固，

造成實驗失敗。

（2）劃碟法使用接種環時需要小心不可太過於出力造成培養基破損。

（3）使用塗碟法時塗抹必須均勻，否則造成菌體無法計算。

Q3：

為何實驗要有對照組，其目的為何？

若對照組上有微生物生長代表什麼意義？

Ans:

（1）對照組通常是有著最原始的基本條件，目的是要跟實驗組互相比對，因為實驗組和對照組所有的基礎都是相是相同的，只有差在控制變因的不同而已，而這個因數就是實驗的目的。

（2）對照組原本不應該產生微生物生長的，如果產生了成長可能代表著培養皿可能汙染了其他的微生物，可能在實驗過程中遭到了污染，所以實驗組也就有極大的可能會產生誤差，實驗的結果可能因此錯誤，造成失敗。

圖表：

塗碟法

劃碟法

倒碟法

討論：

這次實驗不算太難，還有米酒製作手法簡單但很耗時，先講分離的實驗，整個過程幾乎沒什麼太大的障礙，唯一的有幾點小問題，首先倒碟法菌數好像太少了一點，我們小組在猜是不是培養基倒入碟子時溫度還太高燙死了細菌，再來是劃碟法，接種環拿的角度問題也是一大學問，而且菌液還要相互連接而且面積不能太大，要不然劃到最後中間會沒位置可以劃。

感想:

凃俊郁4970N089

本次的實驗感覺還不難做，而且這次搭配米酒的製作所以人力有點分散，而讓我感到比較麻煩的是培養機的製作，原料配好了菌也滅了，但又是時間的等待，等待培養基的冷卻而且這次還沒有隔水降溫所以時間更久了，並且還要注意到培養基的凝固和溫度，因為溫度太高會燙死水樣中的菌，而溫度太低則培養基會凝固，此外實驗數據好像有誤差，倒碟稀釋10-1倍，菌數好像少了點

關宇峰4970N032

這個實驗要用的東西，有些複雜，塗碟做過格外順手，倒碟簡單，難在劃碟的技巧，超怕手殘的說，還好洋菜凍很給我面子，接種環拿的角度，決定是否會破壞掉成品的關鍵，而米酒就很簡單，手很黏很討厭，時間都浪費在上面比較多。

黃俊哲4970N078

這次實驗是採用塗碟倒碟劃碟法這三種，我覺得倒碟和劃碟相對比較難做，倒碟是溫度不易控制，一不小心就可能會讓豐富培養基凝固掉，而劃碟法則用接種環的時候，較容易劃破固體的培養基，而塗碟法可能因為前幾次實驗都做過就比較熟悉。

王建智4970N090

菌種分離，這次實驗裡塗碟在前幾次實驗中都有在做，所以這一次實驗做起來覺得比較熟練一點，而倒碟的溫度掌控好像很難哪捏的準要不凝固又不能太高溫。

最後的劃碟在做起來手拿的太高好像都會把培養基劃破。