第四章香菇种质资源的ISSR分析.docx
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第四章香菇种质资源的ISSR分析
第四章：
香菇种质资源的ISSR分析
1材料与方法
1.1供试菌株
为本实验室保存菌种,香菇品种名录见第二章表2.1。
1.2培养基
1.2.1试管斜面培养基
PDA培养基200g马铃薯、20g葡萄糖、20g琼脂、1000mL水。
1.2.2液体PDA培养基
PDA培养基200g马铃薯、20g葡萄糖、1000mL水。
1.3试剂仪器
ISSR引物,如下图表4.2;MgCl2和脱氧核苷三磷酸（dNTP，2.5mMeach）、TaqDNA聚合酶（5U/μl）为TaKaRa产品。
紫外可见分光光度计：
PharmaciaBiotechultrospec®2000
电泳仪：
D-YY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂）
凝胶成像系统：
TANON-2008
冷冻离心机:
Sigma3K30
PCR扩增仪:
EppendorfAG22331Hamburg
冷冻离心机:
Sigma3K30
掌型离心机：
江苏海门市麒麟医用仪器厂Lx-100手掌型离心机
1.4菌丝培养
将40个香菇冰箱保种菌种接于试管斜面培养基，转管活化7－10天，用接种耙耙碎后，接入250ml三角瓶液体培养基中，每个菌株各接3瓶，于25℃摇床上120rpm培养10天，用400目铜网过滤，蒸馏水冲洗，滤纸吸干，保存于－20℃备用。
1.5DNA提取方法
同第二章1.5.2CTAB法
1.6香菇基因组DNA电泳检测
取5μlDNA加1μl6×溴酚蓝，在0.8％琼脂糖凝胶（含0.5μg/mlEB）上电泳，4V/cm电压电泳约1.5h，在凝胶成像仪上照相。
1.7ISSR扩增反应条件优化
为探索出适于香菇ISSR扩增反应的最优体系，对扩增反应25μL体系的各因子设置了如下梯度（表4.1），再进行PCR扩增分析，各反应物变化量见表4.1。
表4.1ISSR反应体系优化设计
Tab.1DesignofoptimalISSRreactionsystem
项目
反应参数
退火温度Annealtemperature（℃）
模板DNATemplateDNA（ng）
引物Primer（μmol/L）
4种脱氧核糖核酸4×dNTPs（μmol/L）
Mg2+（mmol/L）
TaqDNA聚合酶TaqDNApolymerase（U）
41.343.145.448.050.753.556.0
10203040506070
0.240.480.720.961.201.441.681.92
50100150200250300350400
1.52.02.53.03.54.0
0.51.01.52.02.53.0
扩增反应的基本体系包括1μL模板,2.5μL10Хbuffer缓冲液，1μLMg2+（25mmol/L），2.5μLdNTP（each2.5mmol/L），1μLPrimer（30μmol/L），0.3μLTaqDNAPolymerase（5U／μL）最后用无菌ddH2o将总体积补至25μL。
ISSR-PCR反应程序：
94℃预变性5min；94℃变性1min，退火1min，72℃延伸2min,35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
在整个反应过程中，除对上述比较因素进行梯度设置而变动外，其余参数和反应条件不变，而且每个优化好了的因素将用到下一个优化因素的反应体系中,并相应地调整ddH2O量以保持反应体系为25μL。
1.8PCR产物的检测
PCR结束后，在PCR管中加入5μl6×溴酚蓝上样缓冲液，混匀，取8μl混合液上样于1.0％琼脂糖凝胶（0.5×TBE，含5μg／mlEB）上进行电泳，电压为4.5V/cm，电泳1.5h,于紫外凝胶成像系统上拍照。
对于优化结果的评判以电泳结果为标准，背景低、谱带清晰、数目适中、稳定可重复的组成为最佳反应条件。
1.9ISSR反应引物筛选
1～6号筛选引物的确定是参考孙立夫等[92]的论文；7～20号筛选引物的确定是通过统计包括动植物在内的9篇论文得出基于哥伦比亚大学801～900＃标准引物的9组出现频率较高多态性较好的引物[93]。
由于目前已发现植物基因组中最多的SRS是（AT）n、（TA）n、（GA）n、（CT）n等二核苷酸重复序列[94]，因此所用的引物以加锚二核苷酸重复序列为主，寡聚三核苷酸、四核苷酸引物较少。
引物的筛选是进行ISSR分析的一个关键环节,因为不同的物种SSR相差很大。
用来筛选引物的模板尽可能采用两个亲缘关系较远或二个具有一定遗传距离的材料，这样筛选出的引物才具有代表性，ISSRP-PCR扩增出的结果多态性较高且可能每份供试材料都扩增出丰富的多态性位点。
应用本实验室的20个引物扩增三个香菇菌株的DNA，共筛选出7个多态性好的引物。
1.10ISSR一PCR数据分析
电泳获得基因组扩增图中的每一条带（DNA片段）均代表了模板DNA上与引物互补的一对结合位点，同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为属于同一位点，其产物按扩增阳性“1”（强带和可分辨、稳定性、重复性好的弱带均赋值为1）和扩增阴性“0”记录电泳带谱，形成ISSR表型数矩阵使用SPSS13进一步统计分析。
采用非加权平均法（UPGMA）聚类。
计算Jaccard相似性系数公式为：
Sij＝Xij/（Xij+Xi+Xj）[85]
公式中Sij是菌株i和j的Jaccard相似性系数，Xi表示X菌株所独有的带数，Xj表示Y菌株所独有的带数，Xij表示X，Y菌株所共有的带数。
Sij的范围为0~1，当Sij越接近于1时，表示两菌株间的相似性程度越高，当Sij越接近0时，表示两者的相似性程度越低。
2结果与分析
2.1.ISSR扩增条件的优化
2.1.1退火温度对ISSR扩增的影响
PCR是在离体状态下反复进行变性、退火及延伸过程，用少量的DNA把特定部位的碱基序列以几何级数扩增．在这个过程中退火温度是决定PCR的灵敏性和特异性的最主要的因素[95]。
在PCR扩增仪上自动生成7个温度（最小41.3℃，最大56℃），PCR产物进行电泳检测，结果（见图1）表明：
退火温度太低，有谱带模糊不清或扩增效率下降的趋势；而退火温度太高，使引物与模板结合差，PCR产物丰度低．一般情况下根据引物的A／T及G／C含量计算各种引物的适合温度，其中最常用方法是用公式Tm（℃）=4（G+C）+2（A+T）计算近似值。
根据本实验的结果，可以认为适合的退火温度设定为53.5℃为好．
2.1.2模板DNA浓度对ISSR扩增的影响
模板DNA浓度是影响PCR扩增反应的一个重要因子，模板DNA浓度低，引物与之结合的机率就低，扩增产物不稳定减少；而模板DNA浓度太高，模板DNA分子之间结合的机率也在增大，同样减少了引物与之结合的机率[96]。
本实验在6种不同的模板DNA浓度下进行ISSR扩增，结果（见图2）表明：
当DNA为20ng时，条带数目较多，也最清晰；当DNA为10ng、50ng、60ng时，条带不明显，数目也较少；当DNA为30ng和40ng时，条带相对较淡。
通过比较，本研究选用20ng为最佳模板量。
2.1.3引物浓度对ISSR扩增的影响
引物浓度显著影响PCR带型，浓度过低没有条带或条带较弱，浓度太高又会产生非特异条带[97]。
由图3可知，当引物用量在0.24μmol/L时，弱带颜色相对较浅、数目少；当引物用量在0.48μmol/L时，弱条带颜色相对较浅；当引物用量在0.72-1.68μmol/L时，强、弱带都较清晰、稳定。
综合考虑实验成本等因素，本研究最终选用0.72μmol/L为最优引物浓度。
2.1.4dNTPs浓度对ISSR扩增的影响
反应所需要的dNTP的量对循环数扩增产物的量有较大的影响，从而对反应的特异性扩增也有一定的影响。
浓度过低，偶然性大，反应速度下降，会导致无扩增产物或扩增产物不稳定或扩增出来的条带模糊不清；如果浓度过高则容易拖尾，甚至什么都没有，原因可能是Mg2+被dNTP全部结合了[98]。
由图4可知，当dNTP浓度为50-150μmol／L时，带型淡而且较模糊，还有带缺失现象；当dNTP为浓度为200-350μmol／L时，带型清晰、稳定;当dNTP浓度为400μmol／L时,大小为2kb的两条带消失。
由此说明dNTP浓度过高、过低都不利于扩增，dNTP浓度过低不能提供足够量的底物，过高又与TaqDNA聚合酶竞争Mg2+，造成TaqDNA聚合酶活性降低[99]。
试验确定dNTP使用浓度为200μmol／L．
2.1.5Mg2+浓度对ISSR扩增的影响
TagDNA聚合酶是一种镁离子依赖性酶，对镁离子非常敏感，所以镁离子的浓度对ISSR分析的特异性和扩增效果有显著的影响。
适当的镁离子浓度可提高反应的特异性，但浓度过高会使特异性下降，引物错配频率增加[100]。
本实验设计了1.5、2.0、2.5、3.0、3.4、4.0mmol/L6个梯度。
结果（见图5）表明：
2.0mmol/L的扩增效果最好。
2.1.6Taq酶浓度对ISSR扩增的影响
Taq酶浓度是影响PCR反应的重要因素。
由于酶的活耐热性不同直接影响扩增结果。
增加Taq酶量会导致反应特异性下降，且成本提高，造成浪费。
若酶量过低则会导致合成速率下降[101]。
本实验（见图6）在TaqDNA聚合酶浓度0.5-1.5U时，扩增条带模糊，有带缺失现象；在2.0-3.0U时，条带清晰，扩增结果稳定。
综合考虑成本因素，本实验适合香菇ISSR扩增的最适浓度为2.0U。
2.1.7ISSR扩增体系的优化
在保证扩增产量和特异性的基础上，为节约药品，通过单因素多水平试验，综合以上结果确定了适合于香菇SRAP扩增的反应体系：
总反应体积25μL，其中含10xPCRbuffer2．5μL，Mg2+2.0mmol／L，dNTPs200μmol/L，TaqDNA聚合酶2U，引物0.72μmol／L，模板DNA20ng。
取扩增产物10μL在1.5％琼脂糖凝胶（0.5×TBE）上进行电泳分析,电压4～5V／cm条件下电泳，凝胶成像分析系统拍照保存。
图4.2：
模板DNA浓度对ISSR扩增的影响
注:
M是Maker:
1-9分别为10、20、30、40、50、60、70ngDNA/25μL
Figure1TheeffectsofDNAconcentrationsonISSRproducts
Note:
M:
Marker,1-7:
10、20、30、40、50、60、70ngDNA/25μL，respectively
图4.1：
退火温度对ISSR扩增的影响
注:
M是Maker:
1-7分别为41.3、43.1、45.4、48.0、
50.7、53.5、56.0℃的退火温度
Figure1TheeffectsofAnnealtempleature
onISSRproducts
Note:
M:
Marker,1-7:
41.3、43.1、45.4、48.0、
50.7、53.5、56.0Annealtempleature（℃）
图4.4:
dNTP浓度对ISSR扩增的影响
注:
M是Maker:
1-8分别为50、100、150、200
250、300、350、400μmol/L
Figure4TheeffectsofdNTPconcentrations
onISSRproducts
Note:
M:
Marker,1-8：
50、100、150、200、250、
300、350、400μmol/L，respectively
图4.3:
引物浓度对ISSR扩增的影响
注:
M是Maker:
1-7分别为0.24、0.48、0.72、0.96、
1.20、1.44、1.68、1.90μmol/L
Figure3Theeffectsofprimerconcentrations
onISSRproducts
Note:
M:
Marker,1-7:
0.24、0.48、0.72、0.96、
1.20、1.44、1.68、1.90μmol/L,respectively
图4.6:
Taqase浓度对ISSR扩增的影响
注:
M是Maker:
1-6分别为0.5、1.0、
1.5、2.0、2.5、3.0UTaqase/25μl
Figure6TheeffectsofTaqaseconcentrations
onISSRproducts
Note:
M:
Marker,1-6：
0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0U，respectively
图4.5:
Mg2+浓度对ISSR扩增的影响
注:
M是Maker:
1-6Mg2+分1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mmol/L
Figure5TheeffectsofMg2+concentrations
onISSRproducts
Note:
M:
Marker,1-6:
1.5、2.0、2.5、3.0、
3.5、4.0mmol/L，respectively
2.2引物筛选结果
应用本实验室的20个引物（表4.2）扩增三个香菇菌株的DNA，1、2、4、5、6、12、13、17、18能扩增出4个以上的条带；8、10、11、15、16只能扩增出1-3条带；3、7、9、14、19、20没有扩增出条带。
3核苷酸重复序列产生的条带多，多态性好；（AG）n、（GT）n产生4个以上的条带；4核苷酸重复序列和其它的2核苷酸重复序列中，最多的只能扩增出一条带。
由此说明香菇基因组中含有丰富3核苷酸重复序列和AG、GT重复序列。
表4.2筛选后所园月ISSR引物的编号及序列
Table4.2ListofISSRprimersandtheirsequenceinthisstudy
编号
引物序列
退火温度
（℃）
编号
引物序列
退火温度
（℃）
1
CTCCTCCTCCTCSC
48
11
CATACATACATACATAC
44
2
BDBACAACAACAACAACA
46.8
12
AGAGAGAGAGAGAGAGT
50
3
CACACACACACACACAWG
52.1
13
GAGAGAGAGAGAGAGAC
52
4
CACCACCACCACSC
48
14
CTCTCTCTCTCTCTCTG
52
5
VDHTCGTCGTCGTCGTCG
57.4
15
CACACACACACACACAG
52
6
DHBCGACGACGACGACGA
57.4
16
CTCTCTCTCTCTCTCTRC
53
7
ATGTATGTATGTATGA
42
17
TGTGTGTGTGTGTGTGRC
53.2
8
CATACATACATACATAG
44
18
VHVGTGTGTGTGTGTGTGT
54.2
9
CATACATACATACATAA
42
19
NNNNNNNNNNNNNNN
45
10
TATGTATGTATGTATGC
44
20
GATCAAGCTTNNNNNNATGTGG
56.3
SINGLELETTERABBREVIATIONSFORMIXEDBASEPOSITIONS
N=（A,G,C,T）R=（A,G）Y=（C,T）B=（C,G,T）D=（A,G,T）H=（A,C,T）V=（A,C,G）K=（G,T）M=（A,C）S=（G,C）W=（A,T）
2.3香菇ISSR-PCR遗传多样性分析
2.3.1ISSR多态性
多态性（Polymorphism）是对遗传变异的一种计量，是指群体内多态性基因座的比
例（率）。
公式为[86].
P=k/n（100%）
式中:
P为多态位点百分率，k为多态性位点的位点数，n为测定的位点总数。
7个引物在所供试的40个菌株都获得了基因组DNA指纹图谱，片段大小在0.1-3．kb之间，在所扩增的片段中，大部分片段是共有的，很少的是各菌株特有的,很多菌株拥有完全一致的DNA指纹图谱。
共扩增出71个位点，各个引物扩增的位点数为7-13，平均位点数为10.14；多态性条带总共为46，在3-9之间，多态比率在42.86-100%,平均为64.79%,平均每个引物产生个6.57个多态性条带（表4.3）。
表4.37个引物对40种香菇的扩增结果
引物编号核苷酸序列条带数多态条带多态性比率
PrimercodeNucleotidesequenceTotalbandsPolymorphicbandsratio（%）
112866.67
38787.5
413753.85
57342.86
613646.15
1299100
189666.67
下面是这5个引物对40个供试菌株扩增的ISSR图谱:
图4.7用引物1扩增得到的40个香菇菌种的DNA谱带
图4.8用引物2扩增得到的40个香菇菌种的DNA谱带
图4.9用引物4扩增得到的40个香菇菌种的DNA谱带
图4.10用引物5扩增得到的40个香菇菌种的DNA谱
图4.11用引物6扩增得到的40个香菇菌种的DNA谱带
图4.12用引物12扩增得到的40个香菇菌种的DNA谱带
图4.12用引物18扩增得到的40个香菇菌种的DNA谱带
2.3.2香菇ISSR标记的遗传多样性分析
用ISSR标记的20个多态性位点，利用供试菌株的两两间的相似性系数，采用系统聚类法中的平均法进行聚类分析。
由相似性系数矩阵（附表2）可以看出，供试的40个香菇菌株两两间的相似性系数范围是0.13~1，说明它们在遗传上相似程度不同，存在一定的亲缘关系的差异。
利用供试菌株的两两间的相似性系数，采用系统聚类法中的平均法进行聚类分析，其相似性系数聚类图如图4.13。
7号（Cr62）、30号（Cr66）、31号（Cr33）、32号（Cr04）以7917和L-21（江西资溪野生菌株）为亲本杂交选育的菌株，由附表2可知，7号（Cr62）和30号（Cr66）相似性系数为1，31号（Cr33）和32号（Cr04）相似性系数为0.7，由相似性系数聚类图,可以把它们聚为一类。
图4.13供试香菇菌株相似性系数聚类图
3.讨论
ISSR技术在生物学中最主要的应用是分析和评估种群的遗传多样性。
由于ISSR技术能提供较大数目的DNA片段,可以扫描基因组内的多态位点，因而也是一种用于分析物种、种群、不同品系、甚至是个体间遗传差异的理想方法[102,103]。
ISSR技术可以比RFLP、SSR、RAPD等技术更多地揭示基因组中的多态性，是一种很好的DNA指纹标记，因此，该技术在种质资源鉴定方面显示出比其他方法更高的优越性[104]，目前涉及到的植物包括玉米[105]、小麦[106]、马铃薯[107]、柑橘[108]、羽扇豆[109]、水稻[110]、葡萄[102等，在马铃薯中，甚至4个引物即可对34个品种进行鉴别，其中有2个引物单独使用即可区分出所有品种，4个引物中任何2个引物组合，扩增结果也呈现出品种特异性，并且全部检测工作可以在9h[107]内完成，因此，ISSR技术是一种快速、准确、可以产生足够多态位点的方法，可用于大规模DNA指纹分析。
除了张瑞颖[111]对香菇的ISSR聚类分析报道外，还没有其它关于香菇ISSR分析报道的文献。
张瑞颖用两个引物对供试菌株进行PCR扩增，共计扩增出32条DNA条带，其中多态性条带3l条，占总带数的96%，扩增出的DNA片段的大小在0.3-5kb之间。
而在柑橘中每个引物可获得56个位点[112]，Zietkiewicz等用ISSR引物扩增多种脊椎动物和植物.包括14种灵长类和4种啮齿类，以检测ISSTR技术的可行性。
结果发现ISSR扩增产生的条带分子量变异在200～2000bp之间.一般在每种动物个体之间扩增出40～60条可区分的条带。
Kostia等[113]使用3个TSSR引物对6种哺乳动物（牛、羊、驼鹿、白唇鹿、驯鹿和猪）进行扩增，以评估ISSR方法在系统发育比较中的应用，3个1SSR引物在每个物种中平均产生26，28和36条条带，在牛个体中扩增的多态性条带高于其它物种，约7%的条带为多态性条带。
Huang等[114]用ISSR和4个叶绿体DNA非编码区的限制性位点变异来研究40个苷薯属（Ipomoea）样品的遗传多样性和种内关系，测试的15个ISSR引物在所有的样品中共产生了2071个片段,平均每个样品扩增出了52条条带。
本实验7个ISSR引物共扩增出71个位点，各个引物扩增的位点数为7-13，平均位点数为10.14；多态性条带总共为46，在3-9之间，多态比率在42.86-100%,平均为64.79%,平均每个引物组合产生个6.57个多态性条带，这些说明每个引物的平均位点数可能因种而异。
植物基因组中最多的SSR是（AT）n、（TA）n、（GA）n、（CT）n等二核苷酸重复序列[102]，因此，ISSR技术中所用的引物以与上面序列互补的加锚二核苷酸重复序列为主，寡聚三核苷酸、四核苷酸引物用得较少。
用本实验室的20个引物扩增香菇DNA，多为3核苷酸重复序列产生的条带多，多态性好，由引可以说明香菇基因组中含有许多3核苷酸重复序列。
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