哈蟆油质量控制方法.docx

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哈蟆油质量控制方法

哈蟆油质量控制方法

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【摘要】　　根据历史文献和现代哈蟆油研究的成果，进行整理、分析、总结，阐述了哈蟆油质量控制现状和方法，从传统的基源鉴别发展到性状鉴别、显微鉴别、色谱法、光谱法以及生物鉴定法，尤其是现代发展较好的气相色谱、高效液相色谱、电泳色谱、PCR技术以及指纹图谱技术的应用使哈蟆油的研究进入了一个更高的科学领域。

对哈蟆油的鉴定手段不断的完善，为提高哈蟆油质量控制和鉴别真伪提供了依据。

【关键词】中药；哈蟆油；质量控制方法

　　药材的真伪鉴别和品质评价是临床应用、成药制备、中药科研不可缺少的前提条件。

我国药材品种繁多，据统计约有一万二千多种，由于地大物博，南北差异，同名异物、同物异名的混淆品种极多，疗效各不相同。

而且中药的有效成分和环境、产地、采收季节等因素也有很大关系；加之近年来，假冒伪劣中药充斥市场，为控制中药质量、保证临床用药安全和有效，中药鉴定技术由传统的性状鉴别，如眼观、鼻闻、口尝、手摸升华、水火试等，对药物的形状、大小、轻重、颜色、表面特征、折断面纹理、气味、黏性、酸碱性等进行正确鉴别和描述，到现代的色谱法、光谱法、X射线分析法、热分析法、分子生物学技术等。

哈蟆油（OviductusRanae）为蛙科动物中国林蛙RanatemporariachensinensisDavid雌蛙的输卵管，经采制干燥而得。

据《中国药典》（2005年版）Ⅰ部收载，具有补肾益精，润肺养阴的功效，用于阴虚体弱，神疲乏力，心悸失眠，盗汗不止，痨嗽咳血［1］等症状。

随着中药现代化技术的发展，哈蟆油的质量控制技术也在不断的提高。

　　1基源鉴定法

基源鉴定法就是应用植物、动物或矿物形态和分类学等方面的知识，对中药的来源进行鉴定。

中国林蛙的形态特征［2］为：

体长5～7cm；头长等于或大于宽，口内锄骨齿位于肉鼻孔后方，排列成两短行；两侧耳无后腺；背面黄褐色，较平滑；腹面黄白色，胸骨平坦，下肢部两侧稍膨大；后肢长为躯体的1.5倍。

几种蛙类的检索：

　　1.膝不互交…………………………………………………………2

　　1.两膝互交…………………………………………………………3

　　2.大腿后面不具白色纵纹…………………………………青蛙

　　2.大腿后面具有一条明显的白色环纹…………………金钱蛙

　　3.体平扁而稍小;胫跗关节不达眼部,雄性无声囊……………………………………………………………黑龙江林蛙

　　3.体略扁而稍大;胫跗关节前达眼部,雄性有声囊………………………………………………………………中国林蛙

　　2性状鉴别法

哈蟆油呈不规则的块状，弯曲而重叠，长1.5～2cm，厚1.5～5mm，表面黄白色，呈脂肪样光泽，偶有带灰白色薄膜状干皮。

摸之有滑腻感，在温水中浸泡体积可膨胀10～15倍［3］。

气腥，味微甘，嚼之有黏滑感［1］。

　　3显微鉴别法

董万超等［4］报道了林蛙油的显微特征如下：

加碘酊染色后，在显微镜下观察，呈金黄色。

腺体细胞肥大，呈长椭圆形，排列整齐，细胞壁明显，靠腺体内腔一端较窄，细胞壁凸起，细胞核椭圆形，位于细胞中间稍偏向腺体内腔一面，腺体底部较宽，上端较狭，呈圆锥形。

腺体内开口呈心脏形，内凹，整个腺体布满细小纹理。

为鉴别哈蟆油与中华大蟾蜍输卵管、明太鱼精巢、琼脂蛋白加工品、马铃薯甘薯的伪制品提供了依据。

　　4理化鉴别法

　　4.1荧光检查刘秀峰等［5］

　　报道了哈蟆油干品在365nm下呈黄色的荧光；乙醇浸出物在254nm下呈蓝白色荧光［4］。

　　4.2化学定性分析据报道［4］蛤蟆油水浸液双缩脲反应为深紫红色；加茚三酮试剂，反应为深蓝紫色。

为鉴别真伪提供了依据。

　　4.3化学定量分析1991年，刘永镇等［6］利用哈蟆油与Fehling试剂生成沉淀的反应，定量的鉴别了哈蟆油与其伪品蟾蜍输卵管。

钱笈缔等［7］采用蛋白质自动分析仪测定冰糖哈蟆油中蛋白质的含量，探索了动物药制剂的指控方法。

王秋雨等［8］采用半微量的凯氏定氮法测定了哈蟆油和青蛙油中蛋白质的含量分别为72.8％和73.8％。

　　4.4光谱分析法

　　4.4.1可见分光光度法卫功庆等［9］用美国产DU650分光光度计，在553nm下测定了哈蟆油和青蛙油中胆固醇的含量，分别为2.12，4.92mg/kg，由此确定哈蟆油比较适合中老年人服用。

　　4.4.2紫外光谱法李明刚等［10］在0～360nm下对哈蟆油和中华大蟾蜍输卵管95％乙醇浸出物进行了紫外检测，结果哈蟆油9个吸收峰分别位于4，114，129，252，256，275，311，312，314nm；中华大蟾蜍输卵管8个吸收峰分别位于4，113，131，216，245，275，298，315nm；王丽兰等［11］紫外光谱法测定了哈蟆油中总核酸的含量为2.69%，DNA为（0.13±0.01）%，RNA为（2.56±0.05）%。

2006年，作者报道了采用紫外谱线组法，对不同产地和不同溶剂提取的哈蟆油正品和伪品的紫外及其一阶导数光谱进行了检测，为哈蟆油的质量控制和真伪鉴别提供了依据［12，13］。

　　4.4.3红外光谱法对哈蟆油的红外光谱的报道较少，丘泽雨等［14］对不同产地的珍珠、蟾蜍、哈蟆油、冬虫夏草、五灵脂的同种药材进行了对比研究，并用红外光谱法进行了药材真伪优劣鉴别。

　　4.4.4原子吸收光谱法和发射光谱法王秋雨等［8］用原子分光光度计（VARIANAa220）和等离子发射光谱仪（日立Z-8200）测定了哈蟆油与青蛙油中微量元素和重金属的含量，结果哈蟆油与青蛙油均含有人体必需的常用微量元素,但青蛙油中重金属Pb及Hg含量超标。

李媛媛等［15］采用等离子体发射光谱法对国产和俄罗斯产哈蟆油无机元素的含量进行了分析。

　　4.5色谱分析法

　　4.5.1薄层色谱法刘永镇等［15］研究证实,用丙酮提取物乙醚萃取后的残留物,在石油醚∶醋酸乙酯（4∶1）展开的薄层层析中,其Rf值为0.4，用展开剂苯∶乙醚∶甲醇（10∶5∶0.8），显色剂（茴香醛∶冰乙酸∶浓硫酸1∶100∶2）测定,效果良好。

李明刚等［10］采用苯∶乙醚∶甲醇（10∶5∶0.8）为展开剂，茴香醛∶冰乙酸∶浓硫酸（1∶100∶2）为显色剂，对哈蟆油和中华大蟾蜍输卵管进行了鉴别。

赵文英等［16］用丙酮连续回流提取法，以石油醚：

醋酸乙酯（4∶1）为展开剂，36％的乙酸∶浓硫酸（1∶1）为显色剂，展距20cm，分别在自然光及紫外光（365nm）下，对不同来源的哈蟆油正品以及不同种类的伪品进行了鉴别。

目前，作者正在对哈蟆油进行系统的薄层色谱研究，比较不同极性的溶剂和提取方法下哈蟆油的薄层效果从而建立哈蟆油系统的薄层色谱条件，建立哈蟆油专属性鉴别方法。

　　4.5.2高效液相色谱法李成义等［17］应用HPLC测定了哈蟆油中磷脂的含量；多年来，作者对哈蟆油的有效成分进行了较深入地研究，已分离出了多个化合物［18］，其中，十六烷酸胆甾醇酯为首次从哈蟆油中提取纯化出来的，作者以十六烷酸胆甾醇酯为化学对照品，利用HPLC法对哈蟆油进行了含量测定及其方法学的研究，为建立一个完整、科学的哈蟆油质量评价方法提供依据［19］。

李津明等［20］采用了反相高效液相色谱技术，对10批不同来源的林蛙油药材建立了高效液相色谱指纹图谱，从而提高了哈蟆油的质量控制技术。

　　4.5.3气相色谱-质谱法赵文英等［21］利用气相色谱-质谱法（GC-MS），对哈蟆油石油醚提取物分离出的脂肪酸进行分析，发现哈蟆油不饱和脂肪酸含量约占脂肪酸含量的40%；卢立明等［22］利用GC-MS对哈蟆油脂溶性部分的化学成分进行了研究，结果表明哈蟆油中含有多种不饱和脂肪酸和奇数碳原子脂肪酸。

李成义等［17］利用GC-MS法，从吉林产哈蟆油中检定出9种酸。

其中亚油酸的相对百分含量为36.05%,花生四烯酸的相对百分含量为1.63%。

刘玉翠等［23］利用GC-MS法对哈蟆油的一组脂溶性成分进行分析,共分离鉴定了5种酯类化合物。

季怡萍［24］用气相色谱（GC）与气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术对哈士蟆油中的脂肪酸组成进行了定性与定量分析,共鉴定出10种脂肪酸并用气相色谱法作了定量。

王秋雨等［8］利用气相色谱-质谱（GC-MS）测定哈蟆油与青蛙油脂类物质含量基本一致，约为6%，其中不饱和脂肪酸含量分别占其脂肪酸的77.26%和64.67%。

　　4.6电泳分析法赵华英［25］采用PA-GE技术,对哈士蟆油及其伪品:

黑斑蛙（习称青蛙）、中华大蟾蜍的输卵管进行酯酶同工酶和可溶性蛋白质的电泳分析。

结果酯酶同工酶图谱可见：

哈士蟆油共有2条谱带，A区1条三级带，B区1条一级带。

黑斑蛙有7条谱带，分布在B区和C区。

中华大蟾蜍有2条谱带，分布在B区和C区。

可溶性蛋白质电泳图谱。

可见哈士蟆油在C区有C2和C62条一级带可与伪品鉴别。

因为黑斑蛙只有C3一级带，而中华大蟾蜍C区无一级带。

曾明［26］、石俊英等［27］采用凝胶电泳法测得哈蟆油一级带三条，二级带两条，三级带一条，为鉴别哈蟆油与其易混品种鸡内金、蟾酥等提供了依据。

　　5生物鉴定法

　　5.1放射性免疫分析法林纪娴等［28］采用放射性免疫分析法对中国林蛙和中华大蟾蜍输卵管中睾酮的含量进行了分析；李成义［17］、白云等［29］先后采用了放射性免疫分析法测定了哈蟆油中激素的含量。

　　5.2多聚酶链式反应（PCR）技术杨学干等［30］从中国林蛙（Ranachensinensis）、中华大蟾蜍（Bufogargarizans）以及鳕鱼（Gadusmacrocephalus）等组织材料中提取DNA，扩增出约340bp的12SrRNA基因片段，测定其序列，并参考有关序列，设计一对哈蟆油的鉴别引物HsmL1，HsmH1，用该鉴别引物扩增蛙类原动物的模板DNA时，只有中国林蛙和黑龙江林蛙的模板能得到阳性扩增，其余样品为阴性。

因此该对引物能用于哈蟆油药材来源的鉴别，对购自5个不同药材商店的哈蟆油PCR鉴定结果表明，现市售商品哈蟆油有不同的材料来源，主要因为哈蟆油是由中国林蛙输卵管干制而成，这种以组织器官制成的药材鉴定难度大，易用其它动物相似的器官组织冒充,如黑斑侧褶蛙、中华大蟾蜍、鳕鱼等的输卵管或精巢等加工品。

该研究得到的鉴别引物能准确地对该药材的来源加以区别。

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