反相HPLC法测定阿奇霉素软胶囊的含量.docx

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反相HPLC法测定阿奇霉素软胶囊的含量

反相HPLC法测定阿奇霉素软胶囊的含量

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【摘要】目的采用反相高效液相色谱法测定阿奇霉素软胶囊中阿奇霉素的含量。

方法用耐碱性的十八烷基硅烷键合硅胶柱为固定相，以水∶0.01mol/L磷酸氢二钠溶液（用氢氧化钠试液调节pH值至10.3）∶乙腈（16.7∶23.3∶60）为流动相，流速1.5ml/min，柱温40℃，检测波长210nm。

结果阿奇霉素主成分峰与相邻杂质峰分离状况良好；空白辅料植物油不干扰阿奇霉素主成分的分离检测。

阿奇霉素在0.2052～1.9207μg/ml的浓度范围内质量与峰面积呈良好的线性关系；在添加了空白油辅料的体系中在0.1995～2.0147μg/ml的浓度范围内质量与峰面积呈良好的线性关系。

在添加了空白油辅料的体系中阿奇霉素的最低检测浓度为1.0483～2.0966μg/ml，最低定量浓度为4.1932～10.483μg/ml。

准确性试验的平均回收率为101.4%，RSD为0.2%（n=9）；重复性试验的平均含量为98.0%，RSD为1.0%（n=9）。

结论方法专属性强，精密、准确、耐用，可替代抗生素微生物检定法作为阿奇霉素软胶囊的含量测定方法。

【关键词】高效液相色谱法；阿奇霉素；软胶囊；含量测定ABSTRACTObjectiveToestablishedahighperformanceliquidchromatographymethodfordeterminationofazithromycinsoftcapsules.MethodsAhighpHstabilitycolumn（AgilentZorbaxExtend-C18,4.6mm×150mm,5μm）wasused;themobilephaseconsistedofwater∶0.01mol/Ldibasicsodiumphosphatebuffersolution（thepHvaluewasadjustedto10.3bysodiumhydroxideT.S.）∶acetonitrile（16.7∶23.3∶60）;theflowratewas1.5ml/min;andtheUVdetectionwavelengthwasat210nm.ResultsThegoodresolutionbetweenpeaksofazithromycinandoftheadjacentpuritywasobtained.Theblankexcipientsoybeanoildidnotinterferewiththedetectionofazithromycin.Thelinearrangeforazithromycinwas0.2052～1.9207μg/ml,andtheactuallinearrangeforazithromycininsimulatedsamplesspikedwithsoybeanoilexcipientwas0.1995～2.0147μg/ml.TheLODofazithromycininsimulatedsamplesspikedwithsoybeanoilexcipientwas1.0483～2.0966μg/ml,andtheLOQwas4.1932～10.483μg/ml.Theaveragerecovery101.4%wasobtainedwithaRSDof0.2%;andtheaveragecontent98.0%wasobtainedfromtheprecisiontest;andtheRSDwas1.0%（n=9）.ConclusionThemethodisspecific,precise,accurateandrobust.It′ssuitableforthecontentdeterminationofazithromycinsoftcapsules.KEYWORDSHPLC;Azithromycin;Softcapsules;Contentdetermination阿奇霉素是一种15元环含氮大环内酯类抗生素，其抗菌谱广，临床疗效显著。

阿奇霉素软胶囊是目前国内较为流行的新颖药物剂型，与其他口服制剂相比，具有吸收快、生物利用度高、密封性和防潮性更好，服用方便等优点。

对阿奇霉素及制剂的质量分析，日抗基和中国药典2005年版二部均采用微生物检定法测定其含量，USP23版起则收载了HPLC法，但采用电化学检测器，色谱柱也是选用以氧化铝为基质的键合柱，以应对高pH值的色谱体系。

这些限制直接导致该法难以普及应用，也不能获得常规反相色谱系统通常所能达到的色谱性能。

近10年来，国内药学分析领域的色谱工作者为了开发适用的阿奇霉素色谱分析方法，已作了不懈的努力，诸多成果已见报道［1～16］。

但从中国药典2005年版二部增修订品种阿奇霉素系列质量标准草案的起草和复核过程来看，尚难选定一种合适耐用的HPLC分析方法可以胜任国家标准方法制订之要求。

本文以新颖而成分相对复杂的剂型阿奇霉素软胶囊为研究对象，着手开发了常规而具特色的HPLC法，选用耐碱性但又常用的Agilent公司Extend系列十八烷基硅烷键合硅胶柱测定阿奇霉素的含量，获得了满意的研究结果。

1仪器与试药Agilent1100型组合式全自动高效液相色谱仪，配备AgilentG1314AVWD检测器、AgilentG1313AALS自动进样器及AgilentChemstation化学工作站；电子分析天平为SartoriusBP211D型。

阿奇霉素软胶囊三批，规格为125mg，批号为20050901、20050902、20050903，由浙江维康药业有限公司研制生产。

阿奇霉素对照品为美国USP对照品，批号为H0C212，标签含量为943μg/mg。

乙腈为色谱纯；磷酸氢二钠、氢氧化钠均为分析纯；水为重蒸水。

2方法与结果2.1色谱条件与测定方法色谱柱为Agilent公司Extend-C18柱（4.6mm×250mm，5.0μm，pH耐受范围为2～12）。

流动相为水∶0.01mol/L磷酸氢二钠溶液（用氢氧化钠试液调节pH值至10.3）∶乙腈（16.7∶23.3∶60）；柱温40℃；流速1.5ml/min，检测波长210nm。

取装量差异项下的内容物，混合均匀，精密称取适量（约相当于阿奇霉素250mg），置250ml量瓶中，加甲醇125ml，在微温水浴中放置并不时强力振摇使阿奇霉素充分溶出，取出，稍放冷，加流动相稀释至近刻度，再置超声波浴中强力超声8～10min，取出，放冷至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，用滤膜缓缓推注滤过，精密量取续滤液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

另取阿奇霉素标准品约50mg，置50ml量瓶中，加甲醇25ml，振摇使样品溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl，同法测定。

按外标法以阿奇霉素主成分峰面积计算供试品中阿奇霉素的含量。

2.2测定方法的建立

（1）检测波长、溶解介质及试验浓度的确定本品所含主药阿奇霉素无特征性紫外吸收，故以末端吸收波长210nm进行检测。

本品为油性软胶囊，内容物为植物油基质混悬液，需选择合适的溶剂提取主药阿奇霉素。

为避免使用强溶剂可能显现的溶剂效应，针对阿奇霉素的溶解特性进行反复摸索尝试，最后确定用甲醇提取加流动相稀释制备供试品溶液。

回收率试验结果证实该方案提取效果好。

考虑到本法用于含量测定，对主色谱峰面积的准确计量至关重要，故应选择合适的供试品溶液的浓度，力求减小阿奇霉素次组分、杂质和或降解物对主成分的干扰。

本品剂型特殊，主药阿奇霉素被混悬包裹于药用辅料植物油基质中，不易提取，若将供试品溶液浓度定得过高，易导致主药提取不完全，过高浓度的辅料并可能对主药检测构成干扰，势必影响测定结果的准确性。

若将供试品溶液浓度定得过低，因阿奇霉素紫外响应不强，主色谱峰面积过小，也会影响积分结果的准确性，导致方法的精密度下降。

若保持溶液浓度为1mg/ml，进样体积增加至50μl，进样测试，发现主成分峰理论板数有一定程度下降。

上述研究表明，将供试品溶液浓度定为1.0mg/ml，进样体积定为20μl最合适。

（2）系统适用性试验阿奇霉素是多组分并存的红霉素族衍生物，结构上均以大环内酯为母体，通过羟基以苷键和1～3个糖分子相连，因此在分子结构上与红霉素有一定的相似性，故本法要求对两者的分离状况进行考察，并规定分离度应不低于10，以确保色谱系统达到最低适用性要求。

取红霉素标准品5mg与阿奇霉素标准品50mg，加甲醇和流动相各25ml制成混合对照品溶液，取20μl进样测试，结果红霉素A峰（前）与阿奇霉素主峰（后）良好分离，分离度R达到21.5。

色谱图见Fig.1。

另取空白油辅料加空白介质制成阴性对照溶液，取20μl进样测试，结果未现干扰峰（图略）。

（3）柱温对色谱柱分离效能的影响由于大环内酯类抗生素药物的性质所致，其色谱行为普遍性喜高1:

ErythromycinA（RT=5.34min）;2:

Azithromycin（RT=16.5min）Fig.1Thechromatogramofsystemsuitablitytest柱温，故以相同的色谱参数进行了三个柱温设置点（35℃→40℃→50℃）的比较试验，结果发现柱温由35℃逐步上升至50℃时，主峰与其他次组分或杂质峰的保留时间均相应有所延迟，各峰的分离度更为改善，主峰阿奇霉素峰的理论板数也有所增加。

但考虑到过高的柱温对色谱柱保养不利，故在保证色谱性能的前提下将柱温设置为40℃。

（4）色谱记录时间的确定从色谱图可以发现，阿奇霉素主峰被洗脱后，在其相对保留时间1.5倍后没有发现明显的杂质或降解物峰检出，故为提高分析效率计，将色谱运行与记录时间规定为主峰保留时间的1.5倍，在方法项下不再赘述。

（5）溶液的稳定性待色谱系统充分平衡后，称取软胶囊的内容物适量，依法制备供试品溶液，用滤膜缓缓滤过后，立即量取续滤液20μl进样测试，并每隔20min取室温（约22℃）下放置的供试品溶液进样测试，考察各时间点阿奇霉素主成分峰保留时间和峰面积的变化，对供试品在溶液状态下的稳定性进行评估。

结果在为期9h的测试过程中阿奇霉素保留时间的RSD为1.05%（n=27），峰面积的RSD为1.24%（n=27），表明主药阿奇霉素在方法规定的溶解介质中比较稳定，这对HPLC含量分析结果的精度和准确度是有利的。

（6）线性关系研究分别精密称取阿奇霉素对照品适量，加50%甲醇和50%流动相溶解制成每1ml中约含阿奇霉素0.2～2.0（0.2052、0.3828、0.5906、1.0371、1.1957、1.3853、1.5233、1.6628及1.9207）mg/ml的梯度试验溶液，分别精密量取20μl进样测试，对HPLC分析阿奇霉素含量的一般线性关系及范围进行研究。

以峰面积A和浓度C进行回归分析，得线性方程：

A=1295.58C-12.3618r=0.9999（n=9）

（1）表明本法在0.2052～1.9207mg/ml的浓度范围内，进样20μl，阿奇霉素浓度与相应的主峰面积呈良好的线性关系。

考虑到本品剂型特殊，主药阿奇霉素被混悬包裹于药用辅料植物油基质中，主药与植物油分子间的相互作用比较复杂，故有必要重新考察本法在植物油基质存在时阿奇霉素含量测定的线性关系及范围。

分别精密称取阿奇霉素对照品适量，按处方比例分别加入植物油适量，涡旋使混匀，加甲醇和流动相依法制成试验溶液，滤膜滤过，续滤液即为每1ml中约含阿奇霉素0.2～2.0（0.1995、0.3995、0.6580、0.8321、1.1279、1.1630、1.4489、1.6371、1.8444及2.0147）mg/ml的梯度试验溶液，分别精密量取20μl进样测试，对特定条件下HPLC分析阿奇霉素软胶囊含量的线性关系及范围进行研究。

A和浓度C进行回归分析，得线性方程：

A=1470.88C+5.88751r=0.9998（n=10）

（2）表明本法在植物油基质存在的情况下，在0.1995～2.0147mg/ml的范围内进样20μl，阿奇霉素浓度与相应的主峰面积呈良好的线性关系。

（7）灵敏度试验精密称取阿奇霉素对照品约20mg，置100ml量瓶中，按处方比例滴加空白油辅料约80mg，涡旋使混匀，加甲醇和流动相依法制成对照品贮备溶液，滤膜滤过，精密量取续滤液适量，加50%甲醇50%流动相逐级稀释制成浓度分别为20.966、10.483、4.1932、2.0966、1.0483及0.4193μg/ml的梯度试验溶液，分别精密量取20μl进样测试，以信噪比为3～5时确定阿奇霉素的最低检测限（LOD），以信噪比为10～20时确定最低定量限（LOQ）。

结果加有空白油辅料时阿奇霉素的LOD浓度为1.0483μg/ml（S/N=2.6）至2.0966μg/ml（S/N=5.0）；继续进样测试，结果LOQ浓度为4.1932μg/ml（S/N=10.8）至10.483μg/ml（S/N=20.1）。

（8）准确性试验根据本品主药的标示量，分别按80%、100%和120%的投料比精密称取阿奇霉素工作对照品各适量，各加入正常处方量的空白油辅料，涡旋使混匀，即成模拟的阿奇霉素软胶囊的内容物，依法测定并计算。

结果3组9份供试品的平均回收率为101.4%，RSD为0.2%（n=9），表明以本法测定阿奇霉素软胶囊的含量具有较好的准确性。

（9）重复性试验取任意一批软胶囊样品（批号20050903），分别精密量取9份，依法测定样品中所含阿奇霉素的含量，对方法的重复性进行考察。

结果平均含量为98.0%，RSD为1.0%（n=9），表明以本法测定阿奇霉素软胶囊的含量具有较好的重复性。

（10）样品测定取阿奇霉素软胶囊样品三批各10粒软胶囊，取内容物混合均匀，精密称取适量，依法制备供试品溶液，滤膜滤过，精密量取续滤液20μl进样测试，另取阿奇霉素对照品，同法测定，按外标法计算含量。

另取上述三批样品的内容物，按经典的抗生素微生物检定法平行测定阿奇霉素的含量，进行数据比对。

结果见Tab.1。

试验结果表明，两种方法测得的阿奇霉素含量基本一致，经统计分析，两组数据无显著性差异，两者都是阿奇霉素软胶囊含量测定的适用方法，但与抗生素微生物检定法相比，HPLC对照品法具有专属性强，分析速度快，方便快捷，工作量与实验强度大幅降低，重复性更好，结果更准确等的多种优点，具有微生物检定法无可比拟的优越性。

3讨论与其他已经见诸报道的阿奇霉素HPLC分析方法相比，本法的特点是流动相组成中缓冲溶液的离子强度非常低，仅为0.01mol/L，显著降低了高pH值条件对色谱柱的损害，同时缩短了色谱柱的冲洗时间，加快了分析周期。

Agilent公司开发的Extend系列十八烷基硅烷键合硅胶柱对高pH值的耐受性十分出色，在流动相的pH值为10.3时，即可获得较高的色谱性能。

作者利用该柱以建立的色谱方法对阿奇霉素原料药及其常见剂型进行了为期一年半近百批次样品的含量分析，色谱性能未见明显下降，主色谱峰理论板数至今保持在11000以上；与结构相似物红霉素A的分离度通常可达15以上。

该柱的另一优点是常见、容易购得，售价也不是特别贵，国内一般实验室都可以配备，这就拓展了本法的应用空间。

阿奇霉素软胶囊剂型特殊，考虑到植物油的特点，本法经反复摸索尝试后选择了两性溶剂甲醇进行提取，在微温水浴中保持并时时振摇，直至将大颗沉积在容器底部的油状液团摇匀分散为混悬的小油滴并至部分消失后，再加流动相稀释至近刻度，旋转混匀，体系即显奶白色乳浊液态，再置超声波浴中强力超声助溶8～10min后，取出，放冷至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，上述过程即可将主药阿奇霉素提取完全。

进样前再以0.45μm非水性微孔滤膜缓缓推注滤过，即可获得澄清稳定的供试品溶液。

方法学验证的回收率试验结果印证了上述预处理过程的合理性。

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