白茶提取物抗鸭乙型肝炎病毒的实验研究.docx

白茶提取物抗鸭乙型肝炎病毒的实验研究.docx

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白茶提取物抗鸭乙型肝炎病毒的实验研究

目录

摘要1

Abstract1

1引言2

1.1病毒性乙型肝炎的治疗药物研究进展2

1.1.1核苷及核苷类似物3

1.1.2细胞因子类3

1.1.3中药3

1.2茶抗病毒功效及增强机体免疫力研究进展4

1.2.1茶多酚抗乙型肝炎病毒及提高机体免疫力作用4

1.2.2茶方治疗病毒性肝炎高胆红素血症5

1.2.3茶多糖对机体免疫力功能的影响5

1.2.4茶生物碱对机体免疫力功能的影响5

1.2.5茶氨酸对机体免疫功能的影响6

1.3乙肝病毒模型的研究进展6

1.3.1灵长类乙肝动物模型6

1.3.2鼠类乙肝动物模型6

1.3.3禽类乙肝动物模型7

1.3.4体外动物细胞株模型7

1.4实时荧光定量PCR技术在临床上的应用研究7

1.4.1实时荧光定量PCR技术的基本原理7

1.4.2实时荧光定量PCR技术在临床中的应用8

1.5本试验的立论依据及意义9

2材料与方法10

2.1材料10

2.1.1实验动物10

2.1.2药品10

2.1.3主要试剂10

2.1.4引物及探针10

2.1.5主要仪器11

2.2方法11

2.2.1荧光定量PCR反应体系的建立及优化11

2.2.2动物造模与动物分组12

2.2.3药物干预13

2.2.4荧光定量PCR检测各血清中DHBVDNA的数量13

2.2.5鸭IFN-γ检测14

2.2.6数据处理15

3结果与分析16

3.1DHBVDNA阳性标准品的FQ-PCR的标准曲线16

3.2荧光定量PCR体系优化的正交实验结果16

3.3WTE用药前后麻鸭血清中DHBVDNA水平比较17

3.4各组用药后对血清中DHBVDNA的抑制率19

3.5WTE对鸭血清中IFN-γ表达的影响19

4讨论22

4.1白茶提取物（WTE）的抗病毒性乙型肝炎（DHBV）作用22

4.2白茶提取物（WTE）的提高鸭IFN-γ含量分泌作用22

4.3白茶提取物（WTE）增强机体免疫力及抗病毒的作用机理初探22

参考文献24

附录26

致谢27

白茶提取物抗鸭乙型肝炎病毒的实验研究

***

摘要：

白茶作为中国六大茶类之一，由于其特殊的加工工序，相较于其他茶类，保留了大量的茶多酚、茶氨酸、咖啡碱等营养成分。

白茶具有消炎、杀菌、抗病毒及抗氧化、抗突变等功效。

本试验通过建立福州麻鸭乙型肝炎病毒感染动物模型，不同药物作用前后均取静脉血，用实时荧光定量PCR法检测血清DHBVDNA含量及ELISA法检测鸭γ-干扰素（IFN-γ）的浓度变化。

结果表明，WTE对DHBV的抑制率最高可达73.7%（拉米夫定对照组最高抑制率为88.9%），在一定范围内给药剂量越大抑制率越高，且其停药后反弹效果较拉米夫定不明显。

ELISA检测发现，WTE处理组鸭体内的IFN-γ含量相对于空白对照组显著上升（P<0.01），说明其可能通过促进机体内的干扰素分泌来抑制肝炎病毒。

关键词：

白茶提取物鸭乙型肝炎病毒干扰素DHBVDNA荧光定量PCR

Thestudyofanti-HBVeffectofwhiteteaextract

***

Abstract:

Whitetea,asoneofsixtea,retainsalargenumberofpolyphenols,theanine,caffeineandothernutrientscomparedtootherteasbecauseofitsuniqueprocessingprocedures.Whiteteahasbactericidal,anti-inflammatory,anti-virusanti-oxidationandanti-mutationeffect.ThisstudysetaninfectedanimalmodelofFuzhouDHBV,drewvenousbloodbeforeandafterdifferentdrugeffectstomeasuretheDHBVDNAserumbythereal-timequantitativePCRmethod,anddetectedthedynamicchangesoftheduck’sIFN-γbyELISAassay.TheresultsshowthatthehighestinhibitionratiobyWTEreached73.7%,whilethehighestinhibitionratiobylamivudinegroupreachedto88.9%,anditsinhibitoryeffectsweredose-dependentandtime-dependent.Inaddition,virusreplicationdidn’treboundevidently,whilelamivudinegroupreboundedmoresignificantly.BytheELISAassay,wefoundthatWTEcouldmoresignificantlyincreasethecontentoftheIFN-γinduckvivocomparedtothelargestnon-cellulotoxicconcentrationcontrol（P<0.01）,whichexplainedthatWTEmaybelikelytoinhibitDHBV-DNAreplicationbybeinginoculatedthecontentoftheIFN-γinvivo.

Keywords:

WTEDHBVInterferonDHBVDNAFQPCR

1引言

乙型肝炎病毒（HBV）已成为威胁人类健康的重大问题，世界卫生组织已将HBV感染列为全球十大死因之一。

越来越多的乙肝病毒携带者死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。

目前对乙型肝炎病毒患者的治疗药物主要有干扰素和核苷类药物等，但效果都不太理想。

近年来，国内外很多研究发现，中草药和茶对病毒性乙型肝炎有辅助治疗作用，中草药和茶叶中的各种成分具有抑菌、抗病毒、抗癌、抗氧化等多种功效。

因此为研究治疗乙型肝炎病毒的药物提供可行的方向。

白茶是我国六大茶类之一，茶叶中含有生物碱、茶多糖、茶多酚、茶氨酸、维生素类、矿物质类等多种成分。

茶叶中的各种成分具有不同的药理作用，生物碱有助于嗜酸性粒细胞（Eos）数量以及白介素-5（IL-5）的分泌；茶多糖具有降血糖、增强免疫力等作用；茶多酚具有降血脂、消炎抑菌、防辐射、抗癌、抗突变等多种功效；茶氨酸能降低血氨，治疗肝昏迷，蛋氨酸能调整脂肪代谢等作用；维生素类是一种抗氧化剂，具有抗衰老的效应，可促进肝脏合成凝血素；矿质元素类具有防骨质疏松、抗癌等功效［1］。

2003年第8期《茶叶信息》杂志摘译了美国权威科学杂志《美国科学院学报》的报道，美国科学家哈佛大学医学院的布科夫斯基博士发现，喝白茶能使人体血液免疫细胞的干扰素分泌量增加5倍。

随着对病毒性乙型肝炎的深入研究，研究的技术更加先进，手段更加丰富。

到目前为止，科研人员已经建立了多种乙肝动物模型和体外细胞株模型用于病毒性乙型肝炎的研究。

乙肝动物模型主要有灵长类乙肝动物模型、鼠类乙肝动物模型、禽类乙肝动物模型等，体外细胞株模型主要有HepG2215细胞株、PLC/PRF/5细胞株模型和肝细胞原代培养等。

虽然在乙肝动物模型的建立方面有着重要的突破，但不同的模型都有其各自的优点和缺点。

所以，当前迫切需要建立符合人类乙肝发病过程，且稳定可靠、价廉易得的理想的乙肝动物模型。

面对乙型肝炎病毒席卷全球，人们正在不断寻求更好的方法预防乙肝、检测乙肝和治疗乙肝。

目前，乙肝病毒的检测技术主要有ELISA技术、B超技术、FQ-PCR技术等。

随着相关技术的发展，PCR已从单纯的定性发展到定量水平，实时荧光定量PCR（FQ-PCR）已被广泛应用于医学临床的检测。

1.1病毒性乙型肝炎的治疗药物研究进展

病毒性乙型肝炎是由多种肝炎病毒引起的，以损害肝脏为主的全身性疾病。

因此，要达到有效治疗乙肝应从以下三方面着手：

护肝、调节免疫系统增强免疫力、抗病毒治疗。

目前治疗病毒性乙型肝炎的药物主要有核苷类似物、细胞因子类、免疫调节剂等［2］。

中草药及茶方制剂对治疗病毒性乙型肝炎有辅助治疗作用。

1.1.1核苷及核苷类似物

核苷类似物抗乙肝病毒的作用机制为在体内磷酸化生成三磷酸核苷类似物，其具有较强的抑制乙肝病毒DNA聚合酶的作用，进而可以终止DNA链的延伸及合成，从而起到抑制病毒复制的作用。

核苷及核苷类似物的典型代表是拉米夫定，它通过抑制HBV-DNA逆转录酶和DNA多聚酶的活性从而起到抗乙型肝炎病毒的作用。

目前，核苷类似物中除了拉米夫定，阿德福韦和恩替卡韦等也被广泛应用于病毒性乙型肝炎的治疗［3］。

恩替卡韦具有很强的抗HBV作用，对HBV-DNA复制的起始、逆转录和DNA正链合成等3个阶段均起抑制作用，恩替卡韦的作用靶点是HBV的DNA聚合酶和反转病酶，通过抑制这些酶，从而抑制前基因RNA逆转录复制HBV的DNA负链，进而抑制正链的合成，从而阻断HBV-DNA链的延伸和装配［4,5］。

这些药物的作用机制有所不同但目的是一样的，其共同目的就是抑制肝炎病毒的复制，减少血液中肝炎病毒的数量，从而达到治疗的目的。

但肝炎病毒具有很高的变异性，在抗病毒治疗中，肝炎病毒容易发生耐药性［6］。

1.1.2细胞因子类

干扰素是细胞因子类的典型代表，目前临床中用于抗HBV的主要是IFN-α和IFN-γ。

干扰素是机体感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答产生的一组结构类似、功能相近的低分子糖蛋白。

干扰素的主要生物学功能体现在广谱的抗病毒活性和免疫调节功能，它既能抑制病毒的复制，又能调节宿主免疫功能。

干扰素抗病毒机制包括：

诱导产生抗病毒蛋白而抑制HBV复制，主要作用是降解感染细胞内的HBV的mRNA，并同时抑制病毒蛋白的转译；通过增强免疫细胞功能，加强了特异性细胞毒性T细胞应答、自然杀伤（NK）细胞活性和干扰素等细胞因子的作用，从而清除HBV；使乙肝病毒e抗原（HBeAg）和HBVDNA转阴；近年来还发现干扰素有抗肝纤维化作用［7,8］。

目前治疗乙肝使用的细胞类因子除了干扰素还有胸腺素，胸腺素是一种多肽类激素，能增强机体细胞的免疫功能，增强宿主对抗原的生物调节作用，从而达到清除乙型肝炎病毒的作用。

细胞因子类药物的缺点是不良反应的发生率较高，主要包括过敏、发热、失眠、抑郁等［9］。

1.1.3中药

目前国内外已发现多种中草药对乙型肝炎病毒具有一定的疗效作用。

中草药虽然不能作为治疗病毒性肝炎的主攻药物，但其对治疗病毒性肝炎有很好的辅助治疗作用。

中草药的治疗机制主要有抗病毒作用、调整免疫作用及保护肝细胞作用三个方面。

已有报道许多中药制剂具有降低鸭机体血液中DHBV-DNA含量、促进转氨酶和细胞因子分泌、降低ALT、IL-2、IL-6、TNF-α分泌等作用［10］。

目前用于辅助治疗病毒性乙型肝炎的中草药种类繁多，比较常见的报道主要有苦参素、叶下珠、猪苓多糖、小柴胡冲剂等。

有关研究表明苦参素不仅具有抗病毒作用，还具有抑制胶原活动度、防止肝纤维化、阻断肝细胞凋亡、稳定细胞膜、调节免疫功能等作用［11］。

叶下珠作为药用植物已有数千年历史，对HBVDNA的复制有很强的抑制作用，并能有效降低ALT［12］。

猪苓多糖具有减轻肝损伤，促进肝功能恢复，提高机体免疫功能并抑制病毒的免疫耐受状态。

小柴胡冲剂有保护肝细胞及促肝细胞再生、抗炎、免疫调控、诱导体内干扰素产生和增强腹腔巨噬细胞吞噬活的作用，有降ALT作用，显著降γ球蛋白作用，及改善肝脏病理损害和抑制HBV复制作用［13］。

1.2茶抗病毒功效及增强机体免疫力研究进展

中国是茶叶的故乡，用茶治疗痢疾、胃肠炎、伤寒、痈肿疮疡、眼炎等历史悠久。

茶叶中含有生物碱、茶多糖、茶多酚、茶氨酸、维生素类、矿物质类等多种成分。

随着医药学技术的发展和茶叶研究的深入，发现茶叶具有防癌抗癌、抗突变、抗病毒、抗衰老、增强机体免疫和造血功能等作用。

白茶作为中国六大茶类之一，由于其特殊的加工工序，相较于其他茶类，保留了大量的茶多酚、茶氨酸、咖啡碱等营养成分。

1.2.1茶多酚抗乙型肝炎病毒及提高机体免疫力作用

茶多酚（teapolyphenols，TP）是茶叶中多酚类物质的总称，其中包含有儿茶素类、黄酮及黄酮醇类、花色素类和缩酚醛类等主要物质。

茶多酚是一种天然抗氧化剂，有研究表明茶多酚可减轻酒精性肝损伤，其作用机制可能是改变一系列肝细胞和炎症细胞的细胞因子的表达，继而改变炎症反应、氧化应激等续发反应，从而阻断肝损伤的发展。

茶叶中总黄酮（TeaTotalFlavonoids，TTF）在民间被用于治疗黄疸型肝炎，感冒发热，咽喉肿痛，急性结膜炎或水煎外洗治疗痛疮湿毒等。

杨柯等以人工感染乙型肝炎病毒（DHBV）的北京雏鸭为动物模型，应用斑点杂交法观察TTF对鸭血清鸭乙型肝炎病毒DNA（DHBV-DNA）的影响。

结果TTF对感染鸭血清DHBV-DNA水平的抑制作用显著［14］。

APS是茶黄酮中的主要单体化合物。

欧贤红等采用血清药理学方法，将APS含药血清作用于HepG2.2.15细胞，收集细胞上清液，用MTT法测定细胞上清液中HBsAg、HBeAg的含量。

结果APS含药血清对HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg、HBeAg有显著抑制作用。

结果证明APS对HepG2.2.15细胞分泌乙型肝炎病毒抗原有抑制作用［15］。

儿茶素类是茶叶中茶多酚的重要成分，儿茶素类化合物有明显的清除自由基作用，它能够抑制病菌及病毒的繁衍，且抗衰老和防治癌症［16］。

李建祥等用1日龄北京雏鸭制备鸭乙型肝炎病毒（DHBV）模型，对试验模型进行药物干预，取血清检测DHBV-DNA、DHBsAg、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（ALT）活性观察肝功能变化，并作肝组织病理切片观察形态学改变。

结果儿茶素类各给药组鸭血清DHBV-DNA和DHBsAg含量均有降低，结果显示它对乙型肝炎表面抗原具有清除作用，对乙型肝炎抗原/抗乙型肝炎系统有改善作用，证实了儿茶素对病毒引起的慢性病毒性肝炎有效，鸭血清ALT与AST活性均降低；绐药后的肝组织病理变化有明显改善。

因此可说明儿茶素类有抗乙肝病毒、降低转氨酶活性、减轻肝脏病理损伤作用［17］。

近年来的研究发现酯型儿茶素，尤其是EGCG，它在消炎抑菌、抗衰老、抗肿瘤等多方面功效都超过其他组分，近年有研究发现EGCG能够抑制TNF-α诱导的NF-κB/p65入核，并可能通过此机制发挥诱导细胞凋亡的作用［18］。

据国内外研究，白茶中EGCG的含量比其他种类茶高，白茶的杀菌效果比绿茶好。

1.2.2茶方治疗病毒性肝炎高胆红素血症

近年来，随着茶叶中各成分的功效被陆续发现，人们逐步通过改善生活习惯来提高自身机体的免疫力。

高永忠对广东省惠来县溪西镇卫生院的58例病毒性肝炎患者进行试验，对患者采用一岗茶I方对患者进行治疗，以甘草酸二铵、门冬氨酸钾镁、促肝细胞生长素、人血白蛋白、维生素C、肌苷等常规药物为对照组。

观察患者的症状及测量患者的总胆红素，结果显示一岗茶I方煎剂能明显降低总胆红素水平，疗效优于对照组，是临床上治疗湿热黄疸有效的试剂［19］。

1.2.3茶多糖对机体免疫力功能的影响

茶叶中含有多种糖类，其具有防辐射、增加白血球数量、具有降血糖等功效，茶多糖还是增强人体免疫能力的有效成分。

沈健等用免疫力低下小鼠为模型，通过TPS（TeaPolysaccharide）灌胃后，发现TPS不仅能明显提高小鼠的体重、脾重，还能提高血清中IsG含量、诱导小鼠脾细胞产生IL-2和TNF–α。

结果表明TPS能提高机体的免疫功能，同时我们的实验结果还显示，TPS必须达到一定的浓度才能起到这一作用，这提示只有多饮茶才能对机体免疫功能有帮助［20,21］。

1.2.4茶生物碱对机体免疫力功能的影响

茶叶中生物碱主要以咖啡碱为主，咖啡碱是一种中枢神经的兴奋剂，因此具有提神的作用。

聂汉祥等以19名哮喘患者口服茶碱缓释片（400mg/d）治疗4w，观察治疗前后患者症状积分和肺功能变化，并分别采用直接免疫荧光技术、瑞氏染色和酶联免疫吸附试验，检测治疗前后高渗盐水诱导痰中CD4+T细胞和嗜酸性粒细胞（Eos）数量以及白介素-5（IL-5）和干扰素-γ（IFN-γ）水平的变化。

结果显示茶碱治疗可使哮喘患者诱导痰中IL-5水平和嗜酸性粒细胞（Eos）数量显著下降，但CD4+T细胞数量和IFN-γ水平无显著性变化；患者症状和肺功能明显改善，FEV1.0和FEV1.0％增加。

平均血浆茶碱浓度为7.9mg/L（3.9～14.7mg/L）。

可得出结论小剂量茶碱可能通过减少哮喘患者气道IL-5的产生而发挥抗炎作用［22,23］。

1.2.5茶氨酸对机体免疫功能的影响

茶叶中的氨基酸的种类繁多，其中以茶氨酸含量最多。

氨基酸是人体必需的营养成分，茶氨酸具有抗肿瘤、保护神经、增强记忆、抗糖尿病、降血压、抗疲劳、缓解抑郁症、保护心脑血管、减轻酒精对肝脏的伤害、增强对流行性感冒病毒疫苗的免疫响应等。

茶氨酸可以增强抗癌药物对癌细胞转移的抑制作用。

茶氨酸与DOX同时使用,可以抑制小鼠肝癌细胞的转移［24］。

1.3乙肝病毒模型的研究进展

随着人们对病毒性乙型肝炎的深入研究，人们已经运用各种方法进行了乙肝动物模型的尝试，发现和建立了越来越多的乙肝动物模型，但不同的模型有其各自的优点和不足。

1.3.1灵长类乙肝动物模型

非人灵长类乙肝动物模型主要有黑猩猩、猴类等。

在所有动物中，黑猩猩与人类的亲缘关系最近，在感染HBV后可产生与人类急性乙肝过程相似的细胞免疫反应。

黑猩猩在感染HBV后可以变成无症状病毒携带者，但不能发展成慢性乙型肝炎，因此只能用于研究病毒持续感染机制，而不能用于慢性乙肝发病和治疗的研究。

猴类也曾被人类用于病毒性乙型肝炎的研究，但不同的猴类对HBV的敏感性不同。

恒河猴虽可诱发HBV感染，但敏感性较低，松鼠猴和狒狒对HBV也不太敏感。

长臂猿感染HBV后可产生明显的血清酶学和肝组织学的改变，是研究乙肝的动物模型之一。

1989年葛宪民等［25］应用7只熊猴经下肢静脉接种人急性或慢性乙型肝炎患者的血清，结果发现7只熊猴的血清SGPT、HBsAg、抗-HBs、抗-HBc和HBV-DNA等均为阳性，病理改变与急性乙型肝炎病人的肝脏病变相同，并在猴肝细胞中找到HBsAg和HBV-DNA。

结果证实，熊猴可作为一种新的乙肝动物模型。

但是黑猩猩等非灵长类动物属于濒危动物，数量稀少，来源困难且价格昂贵。

因此，将这类动物作为实验动物模型有很大的局限性［26］。

1.3.2鼠类乙肝动物模型

由于鼠类的体型小、繁殖能力强、易于饲养、遗传背景明确和易于标准化等特点使得小鼠越来越广泛的被作为实验研究。

但作为病毒性乙型肝炎研究的有其很大的缺点，正常情况下的小鼠不能被HBV感染。

但随着生物技术、基因技术及其它各方面技术的发展，人类越来越多的将经特殊处理过的鼠类用于病毒性肝炎的实验研究［27,28］。

土拨鼠在进化上最接近于灵长类，土拨鼠肝脏分离的原代细胞对HBV有易感性，感染HBV的土拨鼠原代肝细胞中可检测到HBV-DNA和RNA的合成。

通过转基因手段获得的转基因小鼠，经HBV感染后，其临床表现、免疫学反应与人乙肝病毒携带者相似，因此转基因小鼠可用于慢性乙肝感染机制及病毒复制等研究。

HBV转染小鼠动物模型即快速大量的经静脉注射裸HBV-DNA到小鼠体内的方法应用得到HBV小鼠模型。

此模型可用于急性病毒性肝炎的研究［29］。

1.3.3禽类乙肝动物模型

禽类动物是除哺乳动物外的一大类最常用于实验研究的动物。

用于病毒性乙肝研究的主要有麻鸭、番鸭、北京鸭、雪鹅、苍鹭等。

鸭类是禽类中最常被作为乙肝动物模型，由于鸭对DHBV易感，且来源丰富，价格低廉，易于饲养。

现在国外多用先天感染的北京雏鸭作为乙型肝炎动物模型，国内选用后天感染的北京鸭作为乙型肝炎动物模型。

鸭乙肝动物模型常被用于研究病毒复制机理，由于鸭感染DHBV可形成急性感染过程，无论肝内原位病毒复制、免疫血清学指标都与人HBV感染相仿。

与人HBV感染相比，其急性感染特点为潜伏期较短、体内病毒清除较快、病程较短。

鸭感染DHBV后发展成慢性持续性感染的几率逐渐减低，也与人类一致［29,30］。

1.3.4体外动物细胞株模型

自1986年Sureau等首先报道筛选出能表达乙型肝炎病毒（HBV）全部病毒标志的细胞株后，HBV体外培养取得突破。

HepG2215细胞株应用最多，该细胞株是用2个头尾相连的HBV-DNA全基因的重组质粒转染受体细胞HepG2而成，可在体外无性繁殖，能够长期稳定地向培养上清液中分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane颗粒，而且还能产生大量的复制中间体，是体外筛选抗HBV药物的良好模型。

也有以PLC/PRF/5细胞株模型和肝细胞原代培养作为研究工具，但PLC/PRF/5细胞株现在已被HepG2215细胞代替。

肝细胞原代培养在人工肝支持系统，肝细胞移植、基因治疗、药物毒性评价及药代动力学、中草药研究等方面具有广泛的用途，可望成为更有应用价值的研究工具［31］。

1.4实时荧光定量PCR技术在临床上的应用研究

1.4.1实时荧光定量PCR技术的基本原理

实时荧光定量PCR技术融合了PCR技术与DNA探针杂交技术的优点，通过检测PCR每个循环发生荧光信号的变化来对DNA含量进行实时测定。

荧光定量PCR最大的特点是用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量从而对起始模板的分析。

以TaqMan荧光探针的实时定量PCR技术原理如下：

TaqMan探针荧光定量PCR原理图示如下：

图TaqMan探针荧光定量PCR原理

TaqMan荧光探针两端分别标记着一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射出的荧光信号被淬灭基团所吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，从而使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，如此荧光监测系统便可接收到荧光信号，光谱分析仪直接读出结果，并进行自动分析。

实时荧光定量PCR相对普通PCR有其很大的优点，荧光信号通过双重标记的序列特异性荧光探针获得，提高了检测的灵敏度、精确度和特异性。

整个过程在同一试管内进行PCR扩增，通过动态实时连续荧光监测，能够准确且灵敏地反映出病原体的感染情况及治疗恢复情况，同时还免除了标本和产物的污染，且无后续处理过程［32］。

1.4.2实时荧光定量PCR技术在临床中的应用

实时荧光定量PCR技术已被广泛应用于病毒性乙型肝炎的治疗。

乙型肝炎病毒（HBV）是一种嗜肝性DNA病毒，临床上传统用于HBV感染的血清标志物的方法是ELISA法，它实际检测的是人体对HBV的免疫反应状态。

即检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb及HBcAb乙肝标志物来判断HBV感染患者。

但HBV抗原、抗体的血清学标志与临床关系较为复杂，必须对几项指标同时分析，方能有助于临床判断。

检测HBV-DNA是直接反应乙肝病毒存在、活动性复制及具有传染性的可靠指标。

定量PCR检测HBV-DNA在判断体内HBV是否在复制、复制的程度、HBV是否被清除，以及对HBV血清学标志阴性肝炎患者的诊断等方面，均优于HBV血清学标