植物叶绿素含量分析研究.docx

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植物叶绿素含量分析研究

题目：

植物生长过程叶绿素含量的分析与研究

任务内容（包括内容、计划、时间安排、完成工作量与水平具体要求）

本文的研究方法主要以实验为基础，运用丙酮和乙醇的1:

1混合法提取测定叶绿素，对提取的叶绿素进行分光光度法，在进行数据对比和图像观察时应用计算机,借助于这些软件工具，对叶绿素的成分结构进行分析。

具体时间安排：

12月18日——12月30日学习叶绿素提取及分光光度法的相关知识。

1月2日——1月6日阅相关资料，确定论文提纲及相关论证内容。

1月9日——2月26日撰写开题报告提纲及相关论证内容

2月27日——3月5日：

查阅论文资料

3月6日——3月12日：

广泛搜索相关资料，初步了解相关内容

3月13日——3月19日：

筛选资料，选出密切相关的资料

3月20日——3月26日：

有针对性地阅读相关专业的书籍

3月27日——4月20日：

补充阅读过程中遇到的或遗漏的知识点

4月21日——5月7日：

进行论文的初步起稿做相关的实验和数据图像处理

5月8日——5月28日：

论文基本定稿

5月29日——6月4日：

在老师的帮助下认真修改论文

6月5日——6月11日：

充分做好论文答辩的准备

6月12日——6月17日：

进行论文答辩

其中：

参考文献篇数：

20篇以上（其中外文文献3篇）

图纸张数：

说明书字数：

论文字数：

8000字左右

外文翻译：

专业负责人意见

签名：

年月日

植物叶绿素的提取及分析研究

摘要

采用直接浸提法用丙酮与乙醇的1：

1提取液对绿色植物叶绿素进行提取,并利用Arnon公式测定叶绿素的含量。

绿色植物叶绿素含量与光合作用及氮素营养有密切关系，对绿色植物进行研究，叶绿素含量是重要指标，其定量测定是植物生理研究中必做的实验之一，对叶绿体结构的分析研究也是重要的手段，所以树木叶片叶绿素测定结果对决定树种的分布、科学育种及植物病理等研究具有指导意义。

本文分别从提取手段、提取溶剂和实验条件等几个方面综述了树木叶片叶绿素的提取用不同有机溶剂提取效果不同的机理；比较了不同树种叶片叶绿素含量的差别。

使用浸提、紫外光谱分析和荧光分析等手段，对不同溶剂提取测定树木叶片叶绿素的能力进行了对比分析，并对提取的叶绿素利用荧光显微镜进行观察,分析叶绿体的结构。

结果表明，用不同提取溶剂提取叶绿素，提取液吸收光谱相似。

其中丙酮与乙醇等体积混合浸提法提取叶绿素效果最好，叶绿素得率最高；华北卫矛叶片的叶绿素含量比其它树木叶片高，并且叶绿素b含量高于叶绿素a。

关键词：

叶绿素；叶绿素含量变化；浸提法

ExtractionofPlantChlorophylland

ResearchonFluorescenceAnalysis

Abstract

Theplantchlorophyllisextractedwithvariousextractedliquidbyadoptingsoakingmethod.AndthecontentofchlorophyllismeasuresedusingArnonformula.Thecontentofplantchlorophyllisrelatedtophoto-synthesisesclosely.Researchingonplants,thecontentofchlorophyllisanimportantindex.Itsmeteredmeasurementistheoneofnecessaryexperimentsinthephysiologicalresearch.Itisanimportantmeansforanalyzingthestructureofchloroplast.Sothemeasuredresultofchlorophyllhastheleadingsignificanceonstudyingonistributingtrees,cultivatingscientificallyandplantpathologyetc.Thetextsummarizesthedifferentimpactonmechanism,thatchlorophyllforextractionwithdifferentorganicsolvents.Itsdescriptionmanifestsseveralaspects,suchasextractionmethod,extractionsolventsandexperimentconditionandsoon.Itcomparesthedifferencesonthecontentofchlorophyllinthedifferentspecies.Usingsoakingandfluorescenceanalysismethods,thetextcarrysonthecontrastanalysistodifferentsolventsforextractioncapacityoftheplantchlorophyll.Extractedchlorophyllisobservedwithfluorescencemicroscopeinordertoanalyzethestructureofchloroplast.Asaresult,absorptionspectrumofextractedliquidisalikebyextractingchlorophyllwithdifferentdifferentsolvents.Amongthem,themethodofacetoneandethanolmixedwiththesamecubagehasthebesteffect.Thechlorophyllthatitextractsisthemost.TheThecontentofchlorophyllofHuaBeiWeiMao’sleavesarehigherthanothers.Andthecontentofchlorophyllaishigherthanchlorophyllb’s.

Keywords:

chlorophyll;FluorescenceAnalysis;soakingmethod

目录

摘要

Abstract

1绪论……………………………………………………………………………………………5

1.1对叶绿素提取及测定方法研究的重要性…………………………………………………5

1.2叶绿体的形态结构…………………………………………………………………………5

1.3叶绿素的构成………………………………………………………………………………6

2提取及测定方法……………………………………………………………………………7

2.1.1直接浸泡提取法………………………………………………………………………7

2.1.2研磨法…………………………………………………………………………………8

2.1.3超声波提取法……………………………………………………………………………9

2.1.4国内学者对植物叶绿素提取的研究……………………………………………………9

2.2叶绿素的测定方法……………………………………………………………………10

2.2.1测定方法的发展及趋势………………………………………………………………10

2.2.2Arnon法及Arnon公式简介……………………………………………………………10

3材料与实验……………………………………………………………………………………11

3.1实验材料…………………………………………………………………………………11

3.1.2溶剂的选择……………………………………………………………………………11

3.1.3仪器………………………………………………………………………………………11

3.2实验方法………………………………………………………………………11

3.2.1树叶的处理…………………………………………………………………………11

3.2.2有机溶剂浸提法提取叶绿素………………………………………………11

4结果与计论…………………………………………………………………………………13

4.1不同提取溶剂对叶绿素提取总量的影响…………………………………………………13

4.2不同提取溶剂提取叶绿素的进程…………………………………………………………13结论…………………………………………………………………………………………13

参考文献.

附录

致谢

植物生长过程叶绿素含量分析与研究

1绪论

1.1对叶绿素提取及测定方法研究的重要性

叶绿素是存在于植物细胞中的一类极重要的绿色色素，是绿色植物进行光合作用时吸收、转化和传递光能的主要物质。

它是以一种色素蛋白复合体的形式存在于类囊体中，占植物鲜重的0.05%至0.20%，占干重的0.5%左右。

目前，基木认同叶绿素在光化学反应中起着重要的作用，叶绿素a是利用日光能的主要色素，叶绿素b是辅助色素。

植物体内的叶绿素水平可以衡量光合能力。

关于叶绿素与光合作用的关系因叶龄、叶绿素含量而表现出一定的差异性。

叶绿素a/b值对光合作用也有一定的影响，叶片净光合速率与大于1的叶绿素a/b值呈负相关。

叶绿素a含量决定总叶绿素含量水平，而叶绿素b含量主导叶绿素a/b值的变化、总叶绿素含量、叶绿素a含量与净光合速率。

植物中的叶绿素含量，被广泛作为植物生长的常测指标，并与植物的光合作用、营养吸收等密切相关。

叶绿素具有解热，止血等药理功效，在生物及药物研究中有重要作用.因此，叶绿素的提取、测定及其性质研究有着重要意义。

叶绿素含量的测定一般有分光先度法、活体叶绿素仪法和光声光谱法，其中以分光光度法应用最为广泛。

叶绿素提取方法的研究最早的是1941年Mackinney提出的丙酮法和由Arnon解释和推导的Arnon法，80年代初，有人又提出了用丙酮乙醇混合液的提取法[4]。

对于叶绿素的提取方法的研究，具有非常现实的意义，所以很多科研工作者对叶绿素的提取方法做了很多的研究和探讨。

1.2叶绿体

叶片是进行光合作用的主要器官，而叶绿体是光合作用的重要细胞器。

从绿藻到高等植物的绿色细胞都包含有叶绿体。

叶绿体是从前质体发育而成的。

通常，前质体是由未受精的卵细胞衍生而来的，经细胞与前质体的形成无关。

当胚发育是前质体进行分裂；当叶片和茎形成是，前肢质体发育成叶绿体。

幼叶绿体也能进行分裂，特别是含有幼叶绿体的器官曝光时，分裂更迅速，所以每个成熟的也细胞通常含有几百个叶绿体。

在光学显微镜下可以看到，高等植物的叶绿体大多呈椭圆形，一般直径为3～6μm，厚约2～3μm。

据统计，每平方毫米的蓖麻叶就含有3～5×107个叶绿体。

这样叶绿体的总面积就比叶面积大的多，因而对太阳光能和CO2的吸收利用都有好处。

下图是叶绿体的亚显微结构。

每个叶绿体由被膜、基质和内膜组成。

图1叶绿体的微观结构

叶绿体被膜分两层。

外层厚65

，是非特异离子扩散膜，低分子物质如无机盐、核苷酸和蔗糖等都可以较快的透过。

而高分子物质如糊精就不能透过。

内膜厚约85

的类脂—蛋白质组成的生物膜，对离子有地渗透性，所以对物质透过就有一定的限制。

外膜和内膜之间有10nm距离的电子半透明区。

叶绿体基质电子密度较小，呈无定形的凝胶状，含有转换CO2成为碳水化合物特别是淀粉的酶系统。

在电镜下还可见许多微粒结构，包括DNA纤丝、核糖体、淀粉粒和亲锇颗粒等。

叶绿体DNA以双链超螺旋环的形式存在，在基质中进行转录和翻译作用。

叶绿体片层膜系统是由基质类囊体与基粒类囊体相互连接而成的三维空间网状结构，贯穿在整个基质中，类囊体是由两层厚约7nm的膜组成的扁平囊，含有色素，以及内有一个腔，充满着水和溶于水的盐。

通常由10～100个类囊体垛叠成基粒。

基粒的直径约为0.3～2μm。

组成基粒的类囊体称为基粒类囊体，也称基粒片层。

一个基粒类囊体与另一个类囊体接触的区域称为紧贴区域，不与其他类囊体接触的区域称为非紧贴区域。

没有发生垛叠的类囊体称为基质类囊体，也称基质片层。

基质类囊体是把一个基粒与另一个基粒相连接的长形类囊体，贯穿在整个基质中。

它们经常延伸成为和构成一个或多个基粒的组分。

这样基质类囊体与基粒类囊体就形成了一个三维空间网状结构。

关于类囊体膜的结构，根据冰冻撕裂的研究和X-衍射的分析，可以认为类囊体膜并不是对称的。

膜由脂质双分子层组成，其中埋藏着许多大小不同的蛋白质分子。

不同植物或同一植物不同部位的叶绿体内基粒的类囊体数量不同。

例如，烟草叶绿体的基粒有10～15个类囊体，玉米则有15～50个；同是冬小麦，基粒类囊体数目随叶位上升而增多，至旗叶达到高峰。

叶绿体的含水量为75％～80％，其干物质中30％～50％为蛋白质，20％～30％为脂类物质（包括色素），色素约占叶绿体干重的8％。

叶绿体片层膜中的脂类物质，除负责吸收光的色素外，重要的是糖脂，其次是磷脂和硫。

1.3叶绿体色素

（1）叶绿体色素的化学特性

叶绿体色素有三类：

（1）叶绿素，主要包括叶绿素a和叶绿素b；

（2）类胡萝卜素，其中有胡萝卜素和叶黄素；（3）藻色素。

类囊体膜中含有叶绿素和类胡萝卜素，叶绿体被膜中只含有一些类胡萝卜素（特别是紫黄质，叶黄素的一种，不含叶绿素）。

叶绿素中主要有叶绿素a和叶绿素b。

叶绿素a的分子式为C55H72O5N4Mg，叶绿素b的分子式为C55H70O6N4Mg，其结构式见图。

这两种色素差别很小，叶绿素a呈蓝绿色，叶绿素b呈黄绿色。

它们在结构上的差别，仅在于1个-CH3被1个-CHO所取代。

叶绿素a和b都是卟啉化合物，即都是由4个吡咯环组成的1个大环。

这个大环中有一整套共轭双键，也就是1个大π键。

在这个卟啉环中央有1个镁原子。

镁与4个氮原的距离是相等的。

叶绿素所以是绿色，主要就是由这个卟啉环中的π电子和Mg所决定的。

叶绿素a和b都是1个双羧酸的酯，1个羧基为甲基所酯化，另1个羧基为叶醇基所酯化。

所以叶绿素可以发生皂化反应：

叶绿素a和b中的卟啉环是亲水的，但其上所带的叶醇基的“尾巴”都是亲脂的。

叶醇是1个由4个异戊二烯单位所组成的双萜，是1个亲脂的脂肪族链。

这个“尾巴”的存在决定了叶绿素分子的脂溶性。

叶绿素分子中卟啉环的大小为（15

）2，叶醇基长为20

。

卟啉环中的镁原子可为H+，Cu2+，Zn2+等离子所取代，当镁被铜或锌取代后，仍可保持绿色。

绿色的新鲜植物标本的保存就是利用这一原理，即用醋酸铜溶液处理绿色的新鲜植物标本。

　叶绿素不溶于水，仅溶于酒精、丙酮、乙醚、乙烷等有机溶剂中。

叶绿素a、b的结构图

（2）绿色植物光合作用的作用光谱

作用光谱是指不同波长的光所引起的光合作用的多少。

如果以氧的释放作为光合作用强度的指标，那么作用光谱的测定就是要知道不同波长的光所能引起的氧释放的数量。

下图描述了22种作物的作用光谱。

作用光谱的测定有助于鉴定参与的色素，因为作用光谱常常和参与的色素的吸收光谱密切相关。

2提取及测定方法

2.1叶绿素的提取方法

总的来说，提取方法主要分直接浸泡提取法、研磨法和超声波提取法等三种。

2.1.1直接浸泡提取法

将样品直接放入有机溶剂中提取叶绿素，是最简单，目前应用最广泛的一种叶绿素的提取方法之一。

使用不同的浸提剂，浸提时间、浸提温度以及浸提效率也各不相同。

因此，如何选择溶剂在直接浸泡提取法中就显得非常重要。

在浸提法中溶剂应该具有提取效率高、挥发性小、毒性低、价格不贵、易于获取等特点。

目前使用过的溶剂主要有丙酮（Acetone）、甲醇（Methanol）、二甲基亚砜（DMSO）、NN-二甲基甲酰胺（DMF）、乙醇（Ethanol）等几种。

因叶绿素浸提法受到重视，陈福明、陈顺伟[6]和张宪政[4]分别对不同配比的丙酮、乙醇和水的混合液的浸提效果进行了研究，证明利用混合液进行叶绿素浸提的可行性。

洪法水等研究表明，丙酮与乙醇混合液提取叶绿素存在协同效应，且两者在等浓度混合时提取效果最好。

另外，彭运生、刘恩[12]和刘绚霞、董振生[11]等研究认为，丙酮乙醇（1：

1）混合液浸提叶绿素效果较好。

由于本试验拟采取丙酮与乙醇的1：

1溶液提取叶绿素，下面主要对这两种溶剂进行介绍。

（1）丙酮（Acetone）

1940年，Mackinney首先提出用丙酮作为提取剂，并得出了叶绿素a和叶绿素b的消光系数。

（Mackinney.1940）；1949年，Arnon用80%的丙酮作为提取液来提取菠菜苗叶绿素并进行分光光度法测定，他所使用的方法在国际上被广泛应用至今（Arnon.1949）。

1952年，Richard等用丙酮将样品浸泡了9个小时得到叶绿素a.b和c（Richardetal.,1952）。

1960年、Vernon用80%丙酮作溶剂用分光光度法测定叶绿素a、叶绿素b和脱镁叶绿素a、脱镁叶绿素b，并得出了计算公式（Vernon,1960）。

后来又经Humphrey和Wooton在1966年证实90%丙酮是提取海洋浮游植物中叶绿素的一种理想溶剂（Humphreyetal.,1966）。

1966年国际海洋研究科学委员会推荐使用将样品浸泡于90%丙酮中低温过夜浸提的方法。

Parsons等人和其后的许多人都是用90%丙酮提取色素（Parsonseta1.,1963;Parsons,1984）.1985年Inskeep等认为Arnon的研究结果有误，在80%丙酮中叶绿素a和b的最大吸收波长应分别为664.5和647nm，而且对等消光系数也进行了修正（Inskeep,1985）。

丙酮和90%丙酮作溶剂，测定叶绿素a、b和c的光谱数据己为众人所知，Jeffery和Humphrey给出了计算叶绿素的光谱经验公式，并为后人所证实（Jefferyetal.,1975）。

到目前为止，以90%丙酮为溶剂的方法仍然在广泛使用。

叶绿素的光学性质随溶剂中水分的增加而改变。

1960年Vernon将100%,90%和80%丙酮的叶绿素谱图进行比较，认为随着水分的增加，叶绿素a,b的最大吸收波长由小向大移动（叶绿素a从662移至665nm，叶绿素b从647移至649nm），而且含水分样品比脱水样品更易提取色素（Vernon,1960）。

1974年Jeffery建议先用100%丙酮提取叶绿素，进行光谱测定时再稀释成90%的丙酮。

但是丙酮易挥发、易燃的性质仍是使用时需要考虑的问题（Jeffery,1974）。

（2）乙醇（Ethanol）

在迄今己知的色素提取溶剂中，乙醇是最安全的提取溶剂，但多数时间用于提取淡水浮游植物的色素提取，后来一些科学家也将乙醇用于提取海洋浮游植物。

2.1.2研磨法

研磨法主要是通过研磨机械破碎植物细胞，使溶剂更易进入细胞提取色素。

早期的研磨法是使用聚四氟乙烯小锤在玻璃的搅拌器中以500r.p.m的转速将植物细胞捣碎，让溶剂浸入。

这种方法至今仍被广泛使用。

但这种方法也有缺点，首先锤与搅拌器之间的距离直接影响提取结果，距离太小容易引起局部过热而且滤液不宜进入缝隙，提取效率低;其次转移过程不可避免会引起遗漏而使操作者直接接触溶剂。

为避免溶剂遗漏可能带来的危险，操作者应注意保护眼睛和手，佩戴安全眼罩和手套。

较常使用的研磨法还有人工在玛瑙研钵中研磨和在20r.p.s的玻璃珠搅拌器中研磨提取色素的方法。

2.1.3超声波提取法

超声波提取法主要是先通过超声波来破坏植物细胞，然后用溶剂提取色素。

超声波在狭小的空间内可产生20,000个大气压的压力，并可产生穿越几个微米的震动波，产生的瞬间高温可达10，000K。

1975年Alliger使用超声波在溶剂中形成破坏空穴使细胞破裂（Alliger,1975）。

研究者发现超声仪的探针传输功率为73.5W.

，时效果不如研磨法，而当功率达到398W.

，时效果优于研磨法（Changetal.,19$2;Wrightetal.,1984）。

如果总传输功率只有60W，超声波很少能穿透置入超声仪中的样品容器外壁进入溶液（Sartoryetal.,1984）。

研究证明传输功率大小很大程度上会影响提取时间的长短。

使用大功率超声仪超声10分钟的操作会导致提取液温度上升和色素降解（Sartoryetal.,1984）。

虽然超声波法有一定的优势，但由于设计和几何学不同的超声仪提取色素效果不同，而且换算相当复杂，所以难以广泛应用。

2.1.4国内学者对植物叶绿素提取的研究

（1）洪法水对菠菜叶绿素提取的研究[5]

方法：

将从市场采购的菠菜洗净，除去叶脉，剪碎、混匀，称菠菜叶2g放入棕色试剂瓶中，加入60ml下列有机溶剂:

丙酮，乙醇，甲醇，乙醚.n（丙酮）:

n（乙醇）=1:

1混合液，浸泡至发白，用UV-Vis测定光吸收，每隔24h测1次，测5次后，光吸收不再增加，计算叶绿素含量，并在350-700nm光波段扫描吸收光谱.同时称菠菜叶2g按Arnon法用丙酮或乙醇研磨并定容至60m1，过滤后测定光吸收，计算叶绿素含量.比较不同有机溶剂、直接浸提法和Arnon法提取叶绿素的效率.

结果:

用n（丙酮）:

n（乙醇）=1:

1的摩尔比混合浸提后.其萃取反应的平衡常数远大于丙酮、乙醇单独浸提的萃取反应平衡常数.因此用丙酮和乙醇混合浸提植物叶片叶绿素明显比丙酮、乙醇单独浸提的效率高.

（2）李得孝对玉米叶绿素提取的研究[7]

方法：

按体积比配制提取液:

80%丙酮，丙酮：

乙醇（1：

1），丙酮：

乙醇：

水（4.5：

4.5：

1），丙酮：

甲醇（1：

1），丙酮：

甲醇：

水（4.5：

4.5：

1），分别用上述几种提取液浸提提取玉米叶绿素。

结果：

在室温10摄氏度下浸提和冷冻处理后浸提，不同提取液表现同样的趋势:

丙酮和乙醇（甲醇）混合液比同类含水的提取液要好，其中丙酮：

乙醇为1:

1的提取液提取叶绿素快而完全，丙酮：

乙醇：

水为4.5：

4.5：

1的提取液最慢，丙酮：

甲醇：

水为4.5：

4.5：

1的提取液提取较快但提取量最少。

因此，采用丙酮：

乙醇为l：

1的提取液提取叶绿素的方法最好。

（3）冯双华对水稻叶绿素提取的研究[9]

方法：

在水稻各生育时期自上而下取三片叶，用剪刀剪碎（长1cm以下），各处理分别称2g鲜重，放入带塞的三角瓶中，分别用95%乙醇和80%丙酮作为浸提液，将浸提液小心倾入100ml容量瓶中定容至100m1摇匀后吸5ml该液于50ml容量瓶中用95%乙醇和80%丙酮分别定容至50ml然后用分光光度计比色测定。

结果：

用95%乙醇作为浸提液，测得的叶绿素含量在所有处理中均比用80%丙酮作浸提液的高，其差值平均为0.274士0.204,平均高13.10%，说明用95%乙醇浸提效果比80%丙酮的好。

（4）于相丽对牡丹叶绿素提取的研究[8]

方法：

将新鲜的牡丹品种赵粉叶片洗净、用滤纸吸干，去大叶脉后剪碎混匀，称取0.05g，放人比色管中，分别加人l0ml<1>丙酮；<2>95%乙醇；<3>80%丙酮；<4>丙酮:

95%乙醇1: