受体的放射配体结合分析法.docx
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受体的放射配体结合分析法
第八章受体的放射配体结合分析与应用
第一节概述
受体（receptor）是细胞膜上或细胞内的一些能与生物活性物质相互作用并引起特异性生物效应的蛋白质。
受体与配体结合后，通过受体特定的信号传递系统，引起细胞的特定反应，是高等动物适应环境、协调机体各种细胞功能的关键性分子。
用放射性核素标记的配体（radioligand）与相应的受体进行特异结合反应，从而对受体进行定性和定量，此即为受体的放射配体结合分析法（radioligandbindingassayofreceptors,RBA）。
定量的RBA是在已知配体与受体反应的基础上，通过结合反应得知一定量的组织或细胞能与该放射性配体结合的受体数，称结合位点数（numberofbindingsites）。
亲和力则以平衡解离常数表示。
定性RBA则通过反应量效关系、某些参数的变化等判断受体的类型、单位点或多位点系统、受体与配体相互作用的特点等。
RBA出现前，虽然提出了受体的一些基本概念，如配体占领学说、激动剂和拮抗剂、配体结合反应的质量作用定律等，但对受体的研究主要靠观察受体激动剂或拮抗剂的生理效应或药理效应。
20世纪60年代，由于放射性探测的灵敏度高、核素标记物不改变配体的构型，可用来直接观察配体在亚细胞组分中的分布，并进行精确定量。
RBA使受体的研究从间接观察进入了直接观察，从宏观进入微观，许多不易或无法用生理（或药理）效应进行观察的受体得以精确定量，并进而对受体分子进行纯化，分析结构。
受体的研究从20世纪70年代已经扩展到了神经递质、激素、细胞因子的作用机制、细胞水平的调控机制、疾病的发病机制及疾病的诊断等方面，渗透到了许多学科领域，受体的研究进入了分子生物学水平。
自20世纪80年代以来，随着新技术、新方法的应用，受体的研究取得了长足的进展。
例如，利用基因克隆技术测定受体分子的一级结构，上百种受体的氨基酸序列得以阐明，测出某种受体的不同亚型在氨基酸序列上的差别，为受体亚型的确定奠定了基础；用点突变技术确定受体结合位点在分子中的位置；利用单克隆抗体、荧光和酶等非放射性标记物来定位受体，丰富了受体的研究方法。
但这些分子生物学技术并不能直接观察受体的数量和分布，更无法了解受体与配体的亲和力。
免疫学技术对研究受体也很重要，但是用抗体观察到的是受体分子的免疫学活性，而不是受体的生物活性。
只有RBA能直接观察受体的数量和亲和力，因此这一技术目前仍在广泛地应用，且在不断地发展。
一、受体的分类及亚型
根据在细胞内的定位可将受体分为膜受体、核受体。
近年来研究发现，原来认为位于细胞浆内的受体，在完整细胞内实际上是位于细胞核上的，当未和激素结合时，核受体与染色体的亲和力较低，易从上面脱落下来。
用不破坏细胞的方法进行观察（如免疫荧光法），可发现这些受体几乎都在核上。
再根据受体的分子结构及信息传递方式，又可以将膜受体及核受体分别分为以下几类：
（一）膜受体（membranereceptors）
由胞膜外、胞膜内及跨膜区三部分组成，配体在细胞外侧同受体的胞外部分或跨膜部分上的特定结合位点结合后，受体的分子构型发生变化，通过膜内部分启动相应的信息传递机制，引起细胞功能变化。
根据受体的分子结构和受体后信息传递方式，膜受体又分为4种（图8-1）：
图8-1受体示意图
1．G-蛋白（鸟苷酸结合调节蛋白）偶联型受体家族
该型受体均有7个跨膜区，受体膜内部分与G-蛋白偶联。
许多神经递质、生物胺类、小分子肽、某些多肽的受体都属于此类。
当激动剂作用于受体时，通过激活G-蛋白，再通过受体后的信号传递机制把信号传递到效应器，引起细胞功能变化。
2.单一跨膜区有激酶活性型受体（酶联受体）家族
该型受体只有一个跨膜区，膜内结构域均有一个激酶（酪氨酸激酶或其他）活性区段。
各类生长因子受体和胰岛素受体属此类。
受体与激动剂结合引起受体分子构型变化，使激酶激活，从而将细胞外的信号传递到细胞内该酶的底物，引起功能变化。
3.单一跨膜区无激酶型受体（与可溶性激酶偶联的受体）家族
该型受体只有一个疏水的跨膜区段，膜外结构都类似纤维结合素（fibronectin），也称fibronectin样受体。
受体无激酶活性区，但可激活细胞内的可溶性酪氨酸蛋白激酶。
生长激素受体、很多细胞因子受体属此类。
4.离子通道型受体家族
这类受体蛋白本身组成一个跨膜的离子通道，几个亚单位围成中央空隙，竖插在膜上，中央空隙就是离子通道。
通道的开或关控制一些离子的跨膜流量，并通过改变细胞内离子浓度影响细胞功能。
此类受体调控的离子主要是Na+、K+、Cl-、Ca2+。
N-胆碱受体、GABA受体属此类。
（二）核受体（nucleusreceptors）
本类受体在细胞核上，与细胞核内特定的DNA结合，通过这种结合影响遗传信息的转录。
核受体一般是由400～1,000个氨基酸残基组成的可溶性单体蛋白质，不含糖基，无酶活性。
氨基端是一个高度可变区，大约由25～603个氨基酸残基组成，与转录的特异性有关，具有转录激活作用。
中间是DNA结合区，约由66～68个氨基酸残基组成，富含半胱氨酸，含有两个“锌指”结构，受体通过“锌指”与DNA结合；该区域部位保守性强，同种激素的受体在不同种属间有完全相同的DNA结合部位。
羧基端为激素结合区，大约由220～250个氨基酸残基组成，相同激素的受体在此区种属差异较小，而不同激素的受体即使是同一种属，差异性也较明显，因而决定了受体的特异性。
与受体结合的染色体的DNA序列称为激素反应元件（hormoneresponseelement,HRE）,HRE一般位于受调控基因启动子上游，一个基因的上游通常有多个HRE。
根据受体与HRE结合的特征，将核受体分为两类：
1．糖皮质激素受体类
这类受体包括糖皮质激素受体（GCR）、盐皮质激素受体（MR）、孕激素受体（PR）及雄激素受体（AR）等。
与它们结合的HRE称为糖皮质激素反应元件（glucocoticoidresponseelement,GRE）
2．甲状腺激素受体类
这类受体包括甲状腺激素受体（TR）、雌激素受体（ER）、维生素D3受体（VDR）、维甲酸受体（RAR）及维甲酸X受体（RXR）等。
与它们结合的HRE称为雌激素反应元件（estradiolresponseelement,ERE）。
（三）受体亚型
受体都有特异的内源性和外源性配体，但研究发现，不少受体存在两种或两种以上亚型。
受体亚型是指受体分子结构上既有部分相同，也存在一定差别，它们对同一配体具有不同的亲和力，生物学上具有不同的效应。
（1）用药理学方法可见到，同一种受体的几种激动剂（拮抗剂）对各亚型都有作用，但作用有相对的选择性。
例如，对于α肾上腺素受体，哌唑嗪对血管平滑肌收缩的拮抗作用强（受体为α1），对胃肠道平滑肌舒张的拮抗作用较弱（受体为α2），而育亨宾则相反。
（2）用放射配体结合分析法可观察到，同一种受体的某些激动剂（拮抗剂）对各亚型都有特异性结合能力，但是亲和力不同。
（3）用分子生物学技术可观察到，同一种受体的不同亚型的分子结构类似，但基因的编码和氨基酸序列有一定的差异。
二、受体与配体相互作用的基本特点
不同受体有不同的生理效应和不同的分布情况，然而它们都具有特定的结构和与配体相互作用的特点。
这些特点归纳起来有：
1．可饱和性（saturabilty）
每种受体在一定量的组织或细胞上的量有一定的限度，若逐步加大配体的浓度，当达到一定的程度后，虽再加大配体，但所形成的受体配体复合物再也不增加，即受体已被配体饱和。
饱和性也称有限结合能力。
2．特异性（specificity）
受体对配体应具有特异性和立体特异性。
配体可分为激动剂与拮抗剂，激动剂与受体结合后引起正性生理效应，天然存在于体内的配体大多为激动剂。
有些配体属药物或毒物，它们可以是激动剂，也可以是拮抗剂。
拮抗剂与受体结合后可阻碍激动剂发挥作用，帮助引起负性生物效应。
同类的激动剂和拮抗剂对受体的竞争能力是与它们的生物学效应相平等的。
激动剂激发生物效应的强度，应该反映在激动剂对受体结合部分竞争的强度上，两者应该大致相等，专一拮抗剂应该阻断其他配体的结合。
3．适度的亲和力（affinity）
受体对它的配体的亲和力，或配体占据受体的浓度范围，应该相当于体内配体的生理浓度，通常是10-9mol/L。
例如，以低浓度存在的信号分子的受体应该有高亲和力，以高浓度存在的信号分子的受体则亲和力相对低一些。
4．可逆性（reversibility）
受体与配体的结合反应是可逆的。
如果在放射配体与受体结合后将受体周围多余的放射性配体移去，则放射性配体与受体的复合物会渐渐解离，即这种结合是可逆反应。
可逆性还表现在已经结合的配体可被另一种与受体亲和力更高的配体取代。
5.识别能力（recognition）和生物效应的一致性
受体与配体的特异性结合保证了受体对机体内成千上万生物活性物质的高度识别能力。
这种能力与配体引起的生理（药理）效应相一致性。
表现在：
①在组织分布上的一致性。
②在浓度上的一致性。
受体主要存在于相应配体发挥生理或药理效应的器官，称之为靶器官。
有的配体生理或药理效应广泛，而另一些配体的作用则有明显的器官专一性。
配体和受体结合的有效浓度通常也应该和该配体发挥生理或药理作用的浓度一致。
6.需具有内源性配体
一般受体都有内源性配体，如果通过外源性配体发现某种蛋白分子具有类似受体的结合特性，但未能找到内源性配体，则称之为孤儿受体（orphanreceptor），还不能看做肯定是真正的受体。
第二节单位点系统RBA的基本原理
一、简单单位点系统受体配体相互作用的基本规律
不少受体与配体结合的系统只存在一种结合位点，即简单单位点系统，其基本规律符合质量作用定律。
（一）质量作用定律
受体和配体结合反应最基本的性质是服从可逆的质量作用定律，对简单单位点系统可分析如下：
[R]为游离受体，[L]为游离配体，[RL]为复合物的浓度；1为复合物的形成速率,2为游离速率；1和2是相应的速率常数。
根据质量作用定律:
1=1[R][L]，
2=2[RL]
当反应最后达到平衡，1=2，亦即1[R][L]=2[RL]，则平衡解离常数：
（8.1）
KD是平衡解离常数,为平衡亲和常数KA的倒数，单位为mol/L，KD越大表示亲和力越低。
设受体和配体的初始浓度为[RT]和[LT],[R]=[RT-RL]，[L]=[LT-RL]，则：
（8.2）
经整理后得：
[RL]2—[RL][RT+LT+KD]+[RT][LT]=0（8.3）
对特定配体和某一固定量的特定受体，[RT]和KD均是定值，于是[RL]仅随[LT]而变，二者呈双曲线函数关系。
观察生物效应过去普遍采用Clark模型，该模型来源于：
假定[LT]远大于[RL]，于是：
（8.4）
（二）饱和曲线
简单单位点系统RBA应能得到典型的饱和曲线。
以[RL]为纵坐标，[LT]为横坐标，得到[RL]随[LT]变化的曲线。
配体的浓度从零开始上升时，复合物浓度先是上升很快，以后逐渐变慢，最后绝大部分受体都与配体结合，即受体饱和了。
此就是饱和曲线（saturationcurve）。
饱和曲线趋向水平则说明大部分受体已与配体结合。
饱和曲线的形状和KD有关。
KD越小，即亲和力越高，曲线起始上升的越快，后续部分越早趋向水平（图8-2）。
如KD相同而[RT]不同，则各曲线的形状相似但高度不同（图8-3）。
图8-2KD对饱和曲线的影响图8-3[RT]对饱和曲线影响
（三）Scatchard作图
简单单位点系统在Scatchard作图中应呈一条直线。
将：
移项并稍加整理可得：
（8.5）
以[RL]/[L]对[RL]作图，即为Scatchard作图。
在简单单位点系统，应得一直线。
斜率是-1/KD，而直线与横轴的交点则等于[RT]值（图8-4）。
当KD相同而[RT]不同时，应得到相互平行但与横轴交于不同位置的直线（图8-5a）。
当[RT]相同而KD不同时，各直线斜率不同但与横轴交于同一点（图8-5b）。
图8-4简单单位点系统受体结合分析的Scatchard作图
图8-5简单单位点系统的Scatchard作图
a:
KD=0.5nM，线上数字为[RT]值（nmol/L）
b:
[RT]=0.2nM，线上数字为KD值（nmol/L）
（四）Hill作图
简单单位点系统的Hill作图应得一斜率为1的直线。
将式
重排并取对数，可得：
（8.6）
以lg[RL]/[RT–RL]为纵坐标，以lg[L]为横坐标，即为Hill作图（见图8-6），也称logit图。
对简单单位点系统，直线与横轴交于lgKD处，与纵轴交于-lgKD处，斜率为1。
图8-6简单单位点系统的Hill作图
Hill作图和斜率还可进一步分析，设每一受体能和两个或更多（n个）分子的配体结合（KD相同），根据质量作用定律：
则公式
可写成:
（8.7）
上式中的斜率为n，称为Hill系数。
二、非特异性结合（non-specificbinding，NSB）
放射性配体除与受体特异性结合外，尚可与其他成分结合，即称之为NSB。
NSB主要来自杂蛋白、反应器壁、分离材料的吸附等。
特点是结合容量大而亲和力小，不会出现饱和现象，结合量与所使用的配体量呈线性关系。
NSB对Scatchard作图也有影响，如以[TB]代替[RL]代入公式
作图，则得到一条向上凹的曲线。
RBA时，当分离特异结合的复合物测量放射性时，这部分NSB的放射性混在一起，测得的是总放射性（totalbinding，TB），必需先减去NSB，才能得到特异结合（specificbinding，SB）。
最基本的方法是做一系列平行管，所有的条件都与TB管相同，仅是多加了200～1,000倍量非标记配体，将SB完全取代，这时测得的放射性计数为NSB。
因NSB与放射性配体呈线性，多点饱和法实验中常常只做3、4点，再用直线回归法求出其余各点（图8-7）。
图8-73H-组胺与组胺受体特异结合的饱和曲线
（○表示NSB,●表示TB，x表示SB=TB-NSB）
三、正协同及负协同现象
在某些情况下，一部分受体与配体结合后可使相邻的受体分子亲和力降低，且这种变化往往随着复合物的形成增加而加强。
这种现象通常称为负协同作用（negativecooperativity）。
反之，亲和力逐步升高则使斜率逐步变大，曲线向上凸，称为正协同作用（positivecooperativity）（图8-8）。
图8-8Scatchard作图中的正负协同作用
（1.无协同作用；2.负协同作用；3.正协同作用）
四、受体配体结合反应的动力学
受体与配体的结合与解离均很迅速。
研究结合动力学的实验通常都是固定[RT]和[LT]，并使[LT]>[RL]，不同时间取样测结合部分的放射性比活度，得到的时相曲线是复合物一边形成、一边解离的综合过程。
任一时间[RL]的净增加是：
d[RL]/dt=k1[R][L]-k2[RL]=k1[RT-RL][LT-RL]-k2[RL]
若[LT]
[RT]，并设反应平衡时的[RL]为[Rle]，则可导出：
（8.8）
上式系常用的求k1的函数式，也称结合反应的假一级速度函数。
至于解离动力学，实验中常可在反应达到平衡后加入大量缓冲液或加入高浓度的非标记配体造成单向解离条件，此复合物的解离属一级动力学模式。
根据质量作用定律，KD应等于k2/k1，由上述动力学实验得到的k2/k1应与其他方法求得的KD相一致。
温度对结合速率及解离速率都有明显影响，一般说，温度越低，结合和解离也都越慢。
第三节离体RBA的条件和基本方法
离体RBA的基本方法可概述如图8-9所示。
图8-9离体RBA的基本方法
一、标记配体的基本要求
标记配体是RBA实验成功的首要条件。
RBA是通过标记配体的用量和比活度，以及测定结合部分的放射性活度，用数学方法求出受体的相关参数，因此对放射性配体的要求很严格。
一般从配体的特性和实验的目的两方面考虑。
（一）标记配体的基本要求
1.高比活度
RBA中受体数目一般很低（0.01～1pmol/mg蛋白），必须用高比活度的标记配体才能得到理想的实验结果。
而且比活度高，可减少标记配体的用量。
一般要求在3.7×1011Bq/mmol以上。
2.亲和力高
高亲和力的配体可减少用量，从而降低NSB；且可使标记配体与受体的复合物解离变慢，便于结合与游离配体的分离，易获得准确的实验数据。
3.特异性强
标记配体应与其他受体的交叉反应少，与研究的受体有选择性结合。
理想的标记配体应只与一种受体或受体的一种亚型结合。
因此应选择对某一受体或其中一种亚型高亲和力的标记配体。
4.放射化学纯度高
RBA的计算是以标记配体的用量及比活度为依据，放射性杂质多可导致计算不准确，一般要求放射化学纯度在95%以上。
（二）标记配体的用量
标记配体的用量要根据实验方案通过预实验进行确定。
①单点法。
通常选一个使受体基本饱和的标记配体量。
该方法操作简便，标本量少，标记配体用量少，但只能给出受体的最大结合容量Bmax，且略小于饱和曲线法。
②多点饱和曲线：
每一受体标本做6～8个点（双位点需要更多），标记配体的用量应覆盖受体的不饱和区和饱和区，以得到典型的饱和曲线。
此方法能得到RT、KD、反映实验误差大小的平均误差等，可信度高，但工作量也大。
二、非标记配体的选择
非标记配体不一定要求与放射配体属同一化合物，但必需两者能竞争同一受体。
且非标记配体与受体的特异性亲和力应尽量地高，使其具有较高的竞争能力。
通常非标记配体的用量为标记配体的200～1,000倍，使绝大部分受体都被非标记配体所占据而不再与标记配体结合，如此测得的结合部分放射性才能代表NSB。
非标记配体的用量也不能过多，否则放射性配体的非特异性结合也将被取代，结果不再能反映NSB。
三、待测受体标本的制备
用于离体RBA的标本大体可分为组织切片、完整细胞悬液、经初步分离的细胞组分及经增溶或进一步纯化的受体蛋白等。
（一）组织切片
为保持受体活性，常用冷冻组织切片，厚度5～50m，将其贴于涂有明胶的玻片上，在温育缓冲液中与标记配体进行反应。
反应后洗去游离部分。
可刮下切片测量其放射性活度，也可用放射自显影或免疫组化研究受体分布。
（二）完整细胞悬液的制备
血细胞可用通常分离血中有形成分的方法分离。
从组织中分离细胞一般是用胶原酶处理组织，再将游离的细胞分离出来。
脂肪组织可制匀浆后收集上层油滴分离出脂肪细胞。
用完整细胞进行RBA的主要优点是可同时观察配体与受体结合的情况和细胞的生物效应，得到的结果更能反映受体的生理特性。
此外，还可直接给出平均每个细胞的受体数目。
缺点是在处理过程中有时可能导致细胞表面生理活性的改变。
有时受体在细胞中的含量很低，则需用较大量的细胞才能作一次实验。
（三）细胞组分的分离
多数RBA使用细胞组分进行分析。
其优点是：
①去除了大部分杂蛋白和内源性配体，减少NSB或其他因素的干扰；②受体蛋白得到初步浓缩，受体制剂的富集可获得可靠的实验结果。
图8-10分离细胞组分的一般方法
最常用的细胞组分分离方法是差速离心分离，加细胞匀浆在一定密度的介质中先后以不同的转速进行几次离心。
适当控制离心力和离心时间便可使某些颗粒组分沉到管底而另一些却保留在上清液中（图8-10）。
为保证制得的标本在受体含量和生物活性上无影响，必须注意：
①制备的全过程在0～4℃下进行；②介质的密度、离子的强度及酸碱度必须严格控制；③匀浆器需严格挑选，匀浆转速和时间需严格控制；④离心力和离心时间需严格保持一致；⑤每次实验均测定蛋白含量。
（四）受体的增溶和进一步纯化
膜受体可用表面活性剂从膜结构上增溶下来，最常用的是非离子型表面活性剂如TritonX-100等。
增溶后的膜受体极易变性，故如以增溶的膜受体作RBA，反应液中应含少量表面活性剂。
离心分离细胞组分虽在RBA的医学研究中用得很多，但标本中受体蛋白在总蛋白中的比例实际是很低的。
若需进一步研究，常需进一步纯化，最主要的纯化手段是亲和层析法、高效液相色谱和电泳技术等。
四、温育条件
（一）缓冲液
受体结合实验最适宜的缓冲液往往是经过多次实践后确定的。
常用的无机缓冲液是Na+-K+磷酸缓冲液，有的缓冲系统是Tris溶液。
例如，3H-GABA在需Na+的神经无和胶质细胞的摄入部位的结合，要比无Na+时与突触受体部位的结合大。
因此，为了消除摄入部位的结合可用无Na+缓冲液，如Tris-枸橼酸盐。
为了研究离子对受体结合过程的影响，可采用不含无机离子的缓冲液。
几乎所有神经递质结合实验，均可受到无机离子的不同影响。
至于pH，几乎所有受体结合实验的最适pH都在7～8之间，但可略有出入。
当最适pH确定后，最好保持不变。
（二）时间与温度
任何影响受体结合对配体亲和力的处理都能影响达到平衡的时间，故在进行动力学分析前，先确定足以达到平衡所需的温育时间。
温度在0～37℃间变化，随温度增高k1和k2都逐步变大，即结合和解离速度都变快。
有人主张选用37℃以尽可能保证反应达到平衡，且绝大多数工作的目的是测定总的结合位点数，温度较高有利于使原结合的内源性配体更快解离下来被放射性配体取代。
也有人主张选用25℃，使反应终止时易降温，以减少分离过程中复合物的降解。
还有人主张选37℃短时间温育后，再用较低温度进行结合反应。
如要测定未被内源性配体占领的受体，则需采用0～4℃。
五、结合配体和游离配体的分离
分离的目的是将已形成的放射性复合物与游离的放射性配体分开，测定其复合物放射性。
一旦分离，原有的反应平衡被破坏，因此在分离过程中要使复合物的解离降低到最低程度，低温和快速是最有效的措施。
多数情况下复合物是大分子，游离配体是小分子或多肽，因此在RIA中使用的B与F分离方法均能使用。
但选择分离方法时要考虑配体与受体解离的速度。
解离速度越快，从受体释放出的配体越多。
复合物从孵育液中分离出来后，再用不含配体的缓冲液淋洗，解离过程更易进行。
现介绍常用的平衡透析法、离心法和过滤法等。
其中，过滤法最为简便、快速，效率也最高。
但受体经过滤分离后，暴露在不含配体的缓冲液中的时间，比其他两种方法更长，故过滤法只对亲和力相对高的受体结合过程适用。
一般说，过滤法适用于检定受体-配体结合反应的KD为10nmol/L或更小的情况。
离心法适用于KD为10～1,000nmol/L的情况，而平衡透析法则适用于KD超过1,000nmol/L的情况。
（一）平衡透析法
将标记的配体与受体组织用半渗透膜隔开，当标记配体自由地透过膜到达平衡时，游离标记配体浓度在膜两侧相等，含受体一边的标记配体的总浓度为游离标记配体[L]与结合配体[LR]之和。
故结合配体的浓度为膜两侧标记配体的浓度差。
当这个差有意义时，平衡透析法才可靠。
受体浓度在受体-配体结合物的解离常数范围内，可得到较好的结合数据。
若当受体浓度远远高于结合物的解离常数，大部分加入的配体被受体结合，而游离配体浓度很低。
或当受体浓度远远低于结合物的平衡解离常数范围内，在含受体的膜一侧，只有一小部分标记配体处于结合状态，而大部分为游离状态，故测得的结合配体的量只取决于膜
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