一种果蝇来源的G蛋白偶联受体Methuselah信号转导相关性质的研究.docx

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一种果蝇来源的G蛋白偶联受体Methuselah信号转导相关性质的研究

硕士学位论文

Adissertationsubmittedto

TongjiUniversityinconformitywiththerequirementsfor

thedegreeofMasterofBiology

Mar,2011

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学位论文作者签名：

张静

2011年3月15日

同济大学学位论文原创性声明

本人郑重声明：

所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作所取得的成果。

除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。

对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。

学位论文作者签名：

张静

2011年3月15日

摘要

Methuselah（MTH）是一种果蝇来源的属于B家族的G蛋白偶联受体。

尽管人们对玛士撒拉受体调控动物寿命的机理仍然不是很清楚，但是当编码该受体的基因发生突变后可以延长果蝇平均寿命，并提高果蝇对外界胁迫因素的耐受性。

目前对MTH受体在生物学功能方面的研究报道较多，但对MTH在细胞水平的信号转导方面的研究却鲜有报道。

本研究中我们采用了稳定表达MTH的HEK293/MTH细胞株，通过免疫荧光染色、WesternBlot及钙流实验验证MTH在HEK293/MTH细胞表面稳定表达，且具有正常生物学活性。

我们对与该受体G蛋白偶联的选择性做了研究。

经研究发现MTH受体被其内源性配体N-stunted激活后所引起细胞内钙的上升不能被PTX预处理所抑制，这提示活化的MTH通过与Gq/11而非Gi/o蛋白相偶联；进一步研究发现，MTH被激活后既不显著上调也不显著下调细胞中的环化腺苷一磷酸（cAMP）水平，表明MTH既不与Gs也不与Gi/o相偶联；这些结果揭示了MTH很可能就是Gq/11蛋白偶联受体。

不同于许多常见的G蛋白偶联受体，我们发现了MTH受体长时间受到其内源性配体N-stunted刺激后并没有发生内吞和降解的现象，同时PKC的激活也不能引起MTH受体的内吞。

在受到N-stunted重复刺激后MTH受体会发生一定程度的脱敏，但当移除N-stunted1小时后受体即可发生复敏。

另外值得一提的是，MTH激活后可长时间持续激活ERK。

更有意思的是我们通过免疫荧光染色发现βarrestin2及其在果蝇中同源的蛋白Kurtz在MTH配体刺激下未见上膜，提示βarrestin2不介导玛士撒拉受体的内吞与脱敏过程。

这一研究工作不仅揭示了MTH受体的G蛋白选择性，也提示了该受体诸多特性都不同于其它已经广泛报道的G蛋白偶联受体，这为进一步研究MTH的下游信号转导和生物学功能奠定了基础。

关键词：

G蛋白偶联受体，玛士撒拉受体，G蛋白，信号转导

ABSTRACT

Methuselah（MTH）whichfromDrosophilarepresentsafamilyBGprotein-coupledreceptor（GPCR）.StudieshaveshownthattheMethuselahmutantincreasedtheaveragelife-spanofadultDrosophilamelanogasterandenhanceditsresistancetovariousformsofstress，howevertheunderlyingmechanismremainsunclear,.Atpresent,comparedtothefindingsofMTHphysiologicalfunctionsinfly,thesignaltransductionofMTHatcellularlevelhasbeenrarelystudied.InthecurrentstudyweuseHEK293celllinestablyexpressingMTH.FirstlyweconfirmedtheexpressionandbiologicalactivityofMTHinHEK293cellsbyusingimmunofluorescentstaining,westernblotanalysisandcalciummobilizationassay.WeinvestigateditsGprotein-couplingpreference.N-stunted,theendogenousligandofMTH,inducedcalciummobilizationincellsexpressingMTH.ThecalciumsignalwasinsensitivetoPTXpretreatment,indicatingMTHiscouplingtoGq/11ratherthanGi/opathway.ThenwediscoveredthatactivationofMTHdidnotinduceanychangeintheintracellularcAMPlevelinHEK293cells,suggestingthatMTHisnotcoupledtoGsorGi/o.TheseresultsfurtherdemonstratethatMTHiscoupledtoGq/11.Veryinterestingly,unlikemanyothercommonGPCRs,wefoundthatwhenbindtoitsendogenousligandN-stunted,MTHwasneitherinternalizednordegradated.Furthermore,activationofPKCdidnotleadtointernalizationofMTH.MTHcouldbepartiallydesensitizeduponbindingtoN-stunted,however,MTHwasresensitizedonehourafterremovingitsligand.Remarkably,weshowedthatactivationofMTHcouldinduceMAPkinaseERK1/2phosphorylationforupto2h.Surprisingly,immunofluorescentstainingshowedthatβ-arrestin2oritsdrosophilahomologueKurtz,didnottranslocalizedontothecytoplamicmembraneindicatingthatβ-arrestin2doesnotmediatetheinternalizationanddesensitizationofMTH.

OurresultsrevealedthemajorsignaltransductionpathwaysofMTHwhichareusefultohelpustofurtherunderstanditsbiologicalfunctions.

KeyWords:

Gprotein-coupledreceptor,Methuselah,Gprotein,signaltransduction

目录

第1章引言1

1.1G蛋白偶联受体（Gprotein-coupledreceptors,GPCRs）1

1.1.1GPCRs的结构1

1.1.1.1GPCRs的基本结构1

1.1.1.2GPCRs的空间结构1

1.1.2GPCRs的分类1

1.1.3GPCRs的配体结合域2

1.1.3.1A族受体的配体结构域2

1.1.3.2B族受体的配体结构域3

1.1.3.3C族受体的配体结构域3

1.1.4GPCRs活化的分子机制3

1.1.4.1分子内相互作用力使GPCRs处于静止构象3

1.1.4.2质子化是GPCRs活化的关键3

1.1.4.3GPCRs与G蛋白的偶联作用3

1.1.5GPCRs的脱敏/复敏反应及受体内吞5

1.2Methuselah及其生物学功能6

第2章实验材料方法9

2.1实验材料9

2.1.1质粒9

2.1.2细胞株9

2.1.3抗体及其它实验耗材9

2.1.4主要仪器10

2.2实验方法10

2.2.1质粒的转化10

2.2.2质粒的提取11

2.2.3磷酸钙细胞转染法12

2.2.4蛋白质免疫印迹（western-blot）13

2.2.5免疫荧光染色14

2.2.6钙流实验15

2.2.7GlosensorTMcAMP实验16

第3章实验结果17

3.1HEK293/Myc-MTH细胞系和Myc-MTH质粒的鉴定及Methuselah在HEK293细胞中信号转导通路的研究17

3.1.1鉴定HEK293/Myc-MTH稳转株细胞和Myc-MTH-pcDNA3.1质粒17

3.1.2受体MTH被激活后是通过与Gq/11而非Gi相偶联引起胞内钙的上升18

3.1.3受体MTH不与Gi相偶联20

3.1.4受体MTH不与Gs相偶联21

3.1.5受体MTH活化后可引起ERK磷酸化22

3.1.6小结23

3.2受体MTH的脱敏/复敏、内吞、降解的研究24

3.2.1N-stunted重复刺激MTH受体导致受体发生部分脱敏反应24

3.2.2解除配体刺激后，MTH受体发生快速复敏反应25

3.2.3PKC的激动剂PMA不能引起MTH发生脱敏及内吞反应27

3.2.4受体MTH受配体长时间刺激后不发生降解29

3.2.5小结30

3.3MTH与βarrestin2相互作用的研究30

3.3.1受体AT1活化后能与βarrestin2及Kurtz发生相互作用32

3.3.2受体MTH活化后不与βarrestin2及Kurtz发生相互作用35

3.3.3果蝇来源的受体CG10698，CG6986活化后可与βarrestin2相互作用37

3.3.4小结41

第4章结论43

致谢46

参考文献47

个人简历、在读期间发表的学术论文与研究成果51

第1章引言

1.1G蛋白偶联受体（Gprotein-coupledreceptors,GPCRs）

G蛋白偶联受体（GPCRs）是目前所知的最大的细胞表面受体超家族，是一类高度保守的膜整合蛋白，它们可以将细胞外的各种信号如光线、气味、激素、神经递质等传递到细胞内。

在多种生理学事件中承担着重要的作用，成为许多现代药物的潜在作用靶点。

1.1.1GPCRs的结构

1.1.1.1GPCRs的基本结构

GPCRs又称为七螺旋跨膜蛋白受体（seven-helicetrans-membranesegmentreceptors，7TMreceptors），其肽链由N末端、7个跨膜α螺旋（TM1→TM7）、C末端、3个胞外环（ECL1→ECL3）及3-4个胞内环（1CL1→ICL4）组成。

N端在胞外，C端在胞内，7个跨膜的α-螺旋反复穿过细胞膜的脂双层，每个TM由20-27个疏水氨基酸残基组成，N端有7-595个氨基酸残基，C端有12-359个氨基酸残基，ECL、ICL各含5-230个氨基酸残基[1]。

1.1.1.2GPCRs的空间结构

1993年Schertler[2]得到了牛和蛙的视紫红质的低分辨率结构：

从胞外观察7个α螺旋（TM1→TM7）按逆时针排列，TM3在分子中心。

2000年，Palczewski等[3]提出了牛视紫红质的三维晶体模式，该模式详细描述了GPCRs的TM、ECL和ICL的空间结构。

之后Chopra[4]用二维NMR研究固相合成的15肽的二级结构，该15肽的氨基酸序列与视紫红质上第258-272位氨基酸序列相同。

实验证实TM6主要是α螺旋，其中的Pro267不影响螺旋结构形成，而TM7上高度保守的Pro303则能使α螺旋被破坏。

1.1.2GPCRs的分类

GPCRs按一级结构的同源性可分为A、B、C3族[5]。

A族，又称为视紫红质β2肾上腺素受体样受体族，它们的一级结构具有以下共同特点：

N末端氨基酸残基数少；ECL1与ECL2之间以二硫键相连；TM3的胞质面有保守的DRY（Asp-Arg-Tyr）基序；ICL3较长；C末端有棕榈酰化的Cys形成ICL4；在7个TMα螺旋中有多个高度保守的氨基酸残基。

该族受体从种系发生上又分为6个亚族：

①生物胺受体；②胆囊收缩肽、内皮素、速激肽、神经肽Y等；③非脊椎动物的视蛋白和缓激肽受体；④腺嘌呤、大麻类、黑皮素及嗅觉受体；⑤趋化因子、互补因子、促性腺激素释放激素（gonadotropinreleasinghormone，GnRH）等；⑥褪黑激素受体及其它。

B族，又称为胰高血糖素（血管活性肠肽或降钙素受体样受体族，它们的一级结构具有以下共同特点：

N末端的氨基酸残基多达100多个，由几个Cys形成二硫键的网络结构；ECL1与ECL2之间以二硫键相连；TM3没有A族中的DRY基序；ICL3较长；C末端无棕榈酰化位点，不形成ICL4；保守脯氨酸的位置不同于A族受体。

B族受体又可分为4个亚族：

①降钙素和促肾上腺皮质激素释放因子受体；②甲状旁腺激素受体；③胰高血糖素、类胰高血糖素肽、垂体腺苷酸环化酶活化肽、血管活性肠肽和分泌素受体；④Latrotoxin受体。

C族，又称为神经递质或称为钙受体样受体族，它们的一级结构具有以下共同特点：

N末端有500-600个氨基酸残基；ECL1与ECL2之间以二硫键相连；ICL3很短且高度保守；C末端无棕榈酰化位点，不形成ICL4；TM中的保守氨基酸残基不同于A、B族受体。

C族受体又可分为5个亚族：

①谷氨酸受体；②γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）受体；③钙受体；④鼻神经外激素受体；⑤味觉受体。

并且在已发现的受体中，嗅觉受体的亚型种类最多，约有400到1000种不同受体。

有趣的是，这些受体的不同不是因几个基因的剪接差异引起，而是每个受体都有完全不同的基因编码，这说明G蛋白偶联受体的多样性。

1.1.3GPCRs的配体结合域

GPCRs配体结合域多种多样，有些是由跨膜α螺旋形成的结合裂隙；有些是受体的胞外结构域；有些配体既与结合裂隙相互作用，又与胞外结构域相互作用。

对应于GPCRs受体的种类，其配体结合域有如下特点：

1.1.3.1A族受体的配体结构域

A族受体的配体按分子大小分可以为两类：

一类是小分子配体，另一类是大分子肽类配体。

二者在A族受体的结合部位不同，小分子配体结合在受体跨膜α螺旋形成的结合裂隙中，而肽类配体主要结合在受体的胞外结构域。

经典的小分子配体有肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、组胺、乙酰胆碱等。

这些受体的结合部位均位于由跨膜α螺旋形成的结合裂隙中[5]。

目前已发现有50多种神经肽和肽类激素通过活化GPCRs传递信息。

肽类配体与小分子配体不同，由于其分子大，不能结合在受体跨膜α螺旋形成的结合裂隙中，其在GPCRs上的结合部位主要位于受体的胞外结构域。

哺乳动物的速激肽就是一种肽类配体，包括神经激肽A、神经激肽B和P物质，它们分别与神经激肽受体-1，2，3（NK-1,2,3受体）结合[5]。

1.1.3.2B族受体的配体结构域

与A族的肽类配体类似，B族受体的肽类配体结合部位主要位于受体的胞外结构域。

B族受体的N末端在大多数配体与受体的结合中起关键作用，例如分泌素、血管肠肽、胰高血糖素等肽类配体，它们不仅与受体的N末端结合，而且还与受体的ECL相互作用[5]。

1.1.3.3C族受体的配体结构域

C族受体的配体主要有谷氨酸、GABA和Ca2+。

这些配体分子小，但与A族小分子配体在受体上的结合部位又不相同，均位于受体胞外的N末端[1]。

1.1.4GPCRs活化的分子机制

1.1.4.1分子内相互作用力使GPCRs处于静止构象

GPCRs分子内相互作用力已被许多实验证实，如血管紧张素AT-1受体的TM3（Asp111）与TM7（Tyr292）相互作用形成的氢键；α、β肾上腺素受体的TM3（Asp125）与TM7（Lys331）形成的盐键；视紫红质的TM3（Glu113）与TM7（Lys296）之间形成的盐键。

在没有激动剂时，分子内相互作用力使GPCRs处于静止（非活性）构象，当受体与激动剂结合或受体发生突变时，此时破坏了受体分子内相互作用力，使受体的关键序列暴露给G蛋白从而活化G蛋白。

因此有人认为分子内相互作用力遭到破坏是GPCRs活化机制之一。

Rasmussen[6]等间接证实当受体发生定向突变时，破坏了分子内相互作用力，使受体易于在活性构象和非活性构象之间相互转变。

1.1.4.2质子化是GPCRs活化的关键

有实验证明，当受体活化时A族受体ICL2上保守的DRY（Glu-Asp-Arg-Tyr）基序中的Glu/Asp发生质子化。

质子化在GPCRs活化中的作用有两种假说。

一种是Scheer提出的“极性袋”[7]假说。

另一是Ballesteros提出的“精氨基酸笼”假说[8]。

1.1.4.3GPCRs与G蛋白的偶联作用

在细胞水平上G蛋白偶联受体都是通过与膜内侧的异源三聚体结合蛋白G蛋白的偶联作用而将信号传递给下游的效应分子系统。

GPCRs被激动剂激活后，与其连接的G蛋白α亚基和β、γ亚基解离，活化的G蛋白亚基调节腺苷酸环化酶、磷脂酶和离子通道等，起到放大和传递细胞内信号的作用。

许多激素、神经递质、神经冲动、光、药物等通过7次跨膜受体与G蛋白偶联，从而将信息传递至细胞内而发挥作用。

这一高度特异性的传导能够调节多种信号传导通路的活性从而产生各式各样的生物学效应。

这些传导通路互相交叉，交织成网，对细胞的代谢酶、离子通道、转运体，其他许多控制广泛细胞活动如转录、运动、收缩、分泌的因素的功能都至关重要。

实验证实，GPCRs的ICL2和ICL3在与G蛋白偶联中发挥重要作用。

其中ICL3决定偶联G蛋白α亚基的特异性，ICL2决定G蛋白的活化[9]。

Iiri等[10]提出了GPCR偶联G蛋白的模式。

该模式认为G蛋白α亚基鸟苷酸结合区与质膜有一定的距离，受体不能直接与鸟苷酸结合区作用，当GPCR活化时，其TM3和TM6的相对运动使G蛋白α亚基的C末端得以插入受体的跨膜缝中，从而引起G蛋白α5螺旋和β6片层结构改变，通过α5/β6环将信息传递给鸟苷酸结合区。

根据G蛋白α亚基的不同可以将G蛋白分为四类：

Gs，Gi/o，Gq/11和G12/13[11]。

（1）Gs传导通路

G蛋白传导通路的研究始于Gs信号通路，许多概念如第二信使，蛋白磷酸化、信号转导蛋白均来源于对该通路的研究。

作用于Gs蛋白的配体有：

高血糖素、肾上腺素、促黄体激素、促甲状腺激素刺激激素、多巴胺、组胺、抗利尿激素。

通过Gs蛋白将信息传递至胞内，通过刺激腺苷酸环化酶提高细胞内的第二信使cAMP水平，从而调控细胞的生物学反应。

（2）Gi传导通路

在研究Gαi抑制腺苷酸环化酶的实验中人们找到了Gi传导通路。

肾上腺素、乙酰胆碱、多巴胺、血清素通过Gi/o通路降低cAMP水平从而发挥其生理学效应。

百日咳毒素能催化Gαi亚单位的羧基端发生ADP核糖基化，使G蛋白与受体和效应器脱偶联。

从而阻断G蛋白介导的效应。

（3）Gq传导通路

实验证实多种递质和激素如乙酰胆碱、组胺、肾上腺素、5羟色胺、血栓烷、谷氨酸等受体通过Gq蛋白与膜上磷脂酶C（phospholipaseC，PLC）偶联，从而影响诸如1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）和甘油二酯（diacylg-lycerol，DAG）等第二信使物质的产生。

IP3与细胞内质网上的IP3受体结合，激活钙通道，使内质网中的钙离子释放到胞浆中，提高胞浆钙离子的浓度，调节胞内各种酶的活性。

DAG有两方面的作用。

一方面，作为重要的第二信使，DAG激活蛋白激酶C（proteinkinaseC，PKC）。

另一方面，DAG被磷脂酶α2（phospolipaseα2，PLA）水解后，释放出脂肪酸，尤其是花生四烯酸，它们都是重要的细胞外信息传递物质。

1.1.5GPCRs的脱敏/复敏反应及受体内吞

G蛋白偶联受体结合激动剂被激活后发生构象变化，激活G蛋白，改变细胞内第二信使（如环化腺苷一酸cAMP）的水平[12]。

大部分与G蛋白相偶联的受体在激动剂的长期或反复刺激下都会出现反应性降低的现象称为脱敏或失敏（desensitization）[13]。

受体发生脱敏作用后随着激动剂作用时间的延长会经历不同的变化历程，在激动剂刺激后较短时间内（几秒至几小时内）受体对刺激的反应性会有不同程度的降低，但此时细胞膜表面的受体数量却并未减少；但是如果这种作用持续进行会引起膜表面受体数量降低，即发生了内吞（internalization）[14-15]；G蛋白偶联受体被激活后发生内吞，从细胞膜表面转运进入细胞内，从而中止其介导的受体信号传导。

发生内吞后的G蛋白偶联受体经过早期内吞小泡和循环小泡的转运返回细胞膜表面，或者从早期内吞小泡进入晚期内吞小泡和溶酶体被降解（图1）[16]。

图1G蛋白偶联受体内吞以及内吞后细胞内转运的过程,此图引自[17]。

Arrestin最重要的作用是促使激活的、磷酸化的受休与G蛋白解偶联，加速受体的脱敏。

大多数的GPCRs在被激活后，在第二信使激酶或G蛋白偶联受体激酶的作用下发生快速磷酸化。

磷酸化提高了其对arrestin的亲和力，两者形成复合体并促使受体与G蛋白解偶联；进而此复合体与笼形蛋白衣被小泡结合并在dynamin的调解作用下发生内吞进入细胞内。

内吞后的受体有两种去向：

一是在衣被小泡内通过一些酶的作用发生去磷酸化，通过再循环回到细胞膜表面，此过程称为复敏作用（resensitization）[18]；二是受体被降解，即受体发生下调。

GPCRs被配体激活后，在激发下游信号转导通路的同时，GPCRs本身也会发生快速的磷酸化。

作用于受体的Ser/Thr位点的蛋白激酶家族在此过程中扮演了重要的角色[19