浅论对培美曲塞耐药胰腺癌Patu8988细胞株克隆侵袭能力及相关耐药基因的研究.docx

浅论对培美曲塞耐药胰腺癌Patu8988细胞株克隆侵袭能力及相关耐药基因的研究.docx

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浅论对培美曲塞耐药胰腺癌Patu8988细胞株克隆侵袭能力及相关耐药基因的研究

浅论对培美曲塞耐药胰腺癌Patu8988细胞株克隆、侵袭能力及相关耐药基因的研究

【摘要】　　目的：

探讨对培美曲塞耐药的胰腺癌Patu8988细胞株相对于亲本株在细胞克隆、侵袭能力及多药耐药相关蛋白1（MDR1）、ABC多药转运蛋白G家族成员2（ABCG2）、ABC多药转运蛋白C家族成员3（ABCC3）耐药基因的变化。

方法：

采用双层软琼脂克隆实验分别在无药及加入500μmol·L-1培美曲塞的环境下测定胰腺癌Patu8988耐药株及亲本株克隆生成能力的改变；采用Transwell侵袭小室检测两种条件下胰腺癌Patu8988侵袭能力的差异；采用RTPCR法检测胰腺癌Patu8988细胞MDR1、ABCG2、ABCC3的mRNA表达水平,Werstenblot检测ABCG2和ABCC3的蛋白表达水平,免疫荧光及激光共聚焦检测ABCG2的表达及分布。

结果：

在无药及加入500μmol·L-1培美曲塞的环境下,对培美曲塞耐药胰腺癌Patu8988细胞株的增殖克隆能力均与其亲本株有差异（P＜）,而两种培养条件下胰腺癌Patu8988细胞株的侵袭能力变化差异无统计学意义（P＞）。

RTPCR检测显示,在耐药株中ABCG2、ABCC3mRNA表达分别是其亲本株的倍和倍左右,而MDR1mRNA表达仅提高到倍；Werstenblot结果显示蛋白表达为其亲本株的倍和倍。

免疫荧光检测结果显示,耐药株中ABCG2的荧光强度较强,而其亲本株细胞较弱。

激光共聚焦显示，耐药株中ABCG2表达主要分布于细胞膜，细胞质内也有少量分布。

结论：

相对于亲本株，对培美曲塞耐药的胰腺癌Patu8988细胞株克隆能力加强,而侵袭能力无明显改变。

多药耐药基因表达均有不同程度的提高,以ABCG2基因表达提高尤为明显,而且其在耐药株中主要分布在细胞膜,细胞质内也有分布。

【关键词】胰腺肿瘤；获得性耐药；培美曲塞；ABC多药转运蛋白G家族成员2

　　［Abstract］Objective:

Toinvestigatethecloningcapability,invasionandassociatedmultidrugresistancegenes:

MDR1（Pgp）,ABCG2,ABCC3ofPatu8988humanpancreaticcancercellsresistancetothepemetrexedcomparedwithit′sparental:

ThecloningcapabilityofPatu8988humanpancreaticcancerandit′sparentalstrainweredetectedinconditionfreeoradding500μmol·L-1pemetrexedbysoftagarcloning　invasionabilitybetweentthemweredetectedbytranswellinvasion　mRNAexpressionofMDR1,ABCG2andABCC3weredeterminedbyRTPCR,ABCG2andABCC3proteinexpressionlevelsweredetectedbyWerstenblot,theexpressionanddistributionofABCG2weredetectedbyimmunofluorescenceandlaserscanningconfocal:

Thecloningcapabilitybetweendrugfreeandadding500μmol·L-1pemetrexedwassignificantlydifferent（P＜）,whereastherewasnosignificantchangesoftheinvasionabilitybetweenthem（P＞）.RTPCRandWerstenblotshowedthemRNAandproteinlevelsofABCG2,ABCC3werealmost250%and150%inthedrugresistantcellsthantheirparentalcells,whiletheexpressionofMDR1mRNAincreasedonly20%.ImmunofluorescenceshoweddrugresistantcellsofABCG2strongerfluorescenceintensitythantheirparental　confocaldetectionofdrugresistantcellsshowedABCG2expressionwasmainlydistributedinthecellmembrane,alsoasmallamountofthe:

ThecloningcapabilityissignificantlydifferentbetweenPatu8988humanpaucreaticcancercellsresistancetothepemetrexedandit′sparentalstrain,whereasinvasionabilityisno　isparticularlyincreasethanothermultidrugresistancegenesanditismainlydistributedinthecellmembraneanddistribution．

　　［Keywords］pancreaticneoplasms；acquiredresistance；pemetrexed；ABCG2

　　本实验室前期通过体外多次大剂量冲击诱导法成功诱导出对培美曲塞耐药的胰腺癌Patu8988细胞株［1］（IC50=倍）,通过Affymetrix基因芯片比对分析发现某些与耐药相关基因的变化。

本研究旨在鉴定对培美曲塞耐药的胰腺癌Patu8988细胞株生物学行为的改变,并验证相关耐药基因的变化,为下步针对相关耐药基因的逆转措施提供实验室前提保障。

　　1材料与方法

　　材料

　　胰腺癌Patu8988细胞株及其经培美曲塞诱导产生的耐药细胞株由东南大学医学院中心实验室提供。

主要试剂:

高糖DMEM培养基、胎牛血清、胰酶等购自Gibcol公司,培美曲塞为法国礼来公司产品（批号：

A512938H）。

PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

TakalaRTPCR试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司产品。

Werstenblot相关试剂为海门碧云天公司产品。

ABC多药转运蛋白G家族成员2（ABCG2）、ABC多药转运蛋白C家族成员3（ABCC3）、βactin一抗为SantaCruz产品,HRP（辣根酶）标记二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司,异硫氰酸荧光素（FITC）荧光标记二抗为美国KLP公司产品。

主要大型仪器：

德国Eppendorf公司梯度PCR扩增仪,美国Pharmacia公司VDS型凝胶自动成像仪,日本Olympus公司MF51倒置荧光显微镜,德国Leica公司TCSSP5激光共聚焦显微镜。

　　方法

　　胰腺癌细胞体外培养

　　胰腺癌Patu8988细胞亲本株及耐药细胞株分别置入含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液中,常规培养于37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中,细胞单层贴壁生长,至70％～80％融合时胰蛋白酶消化传代。

　　双层软琼脂克隆实验

　　亲本株和耐药株培养至80%融合后胰酶消化传代,分别加入两块6孔培养板中,设3复孔。

第一块板每孔加入2ml含%软琼脂和10%胎牛血清的DMEM培养基,待凝固后,在其上加入2ml含3×103个细胞及%软琼脂的含血清培养液；第二块板除同上处理外,在上层琼脂细胞混合液中另加入培美曲塞（终浓度为500μmol·L-1）,待凝固后放入37℃、体积分数为5%CO2培养箱21d后,将含有50个以上细胞的集落判定为一个克隆,每个孔随机选5个视野（×100倍）,计算细胞克隆形成数。

实验重复3次。

　　Transwell小室侵袭实验

　　亲本株和耐药株细胞培养至70%～80%融合后胰酶消化传代,调整细胞密度为2×108个·L-1,将500μl细胞悬液加入预先铺好Matrigel基质胶及FN的Transwell小室,6孔板下室加入2ml完全培养基培养24h。

95%乙醇固定细胞20min,以%结晶紫溶液行细胞染色，倒置显微镜下计数移到膜下层的细胞,每张膜分别计数5个随机视野（×250倍）的穿膜细胞,计算平均数。

每组实验重复3次。

　　RTPCR法检测ABCG2、ABCC3、MDR1的RNA表达

　　分别收集亲本株和耐药株人胰腺癌Patu8988细胞约5×106个,按RNA抽提试剂盒说明提取细胞总RNA,采用两步法进行RTPCR,测定ABCG2、ABCC3、MDR1mRNA的表达。

引物序列、扩增产物片段大小、退火温度及循环数见表1。

PCR完成表1ABCG2、ABCC3和MDR1的RNA引物

　　Westernblot检测ABCG2、ABCC3蛋白的表达

　　分别收集亲本株和耐药株胰腺癌Patu8988细胞约5×106个,加入裂解液提取蛋白,BCA法测定蛋白浓度。

取等体积的蛋白样品与电泳上样液混合后高温水浴处理10min,行10％SDSPAGE,分离蛋白,采用半干转法转移蛋白至膜上,室温封闭2h后,用TBST漂洗3次,分别加入一抗（小鼠抗人ABCG2单克隆抗体1∶400稀释,小鼠抗人ABCC3单克隆抗体1∶300稀释，小鼠抗人βactin抗体1∶400稀释）4℃反应过夜,TBST漂洗3次后,加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG（1∶5000稀释）,室温摇床反应2h,ECL显色、X线胶片曝光,以QuantityOne图像分析软件进行分析。

　　免疫荧光及激光共聚焦检测ABCG2的表达及分布

（1）免疫荧光检测。

亲本株和耐药株细胞在24孔板中培养至70%～80%融合后,以4%多聚甲醛固定,室温下静置30min；PBS洗涤后加入%TritonX100，室温下作用10min；PBS洗涤后加入封闭血清室温下作用30min；加入小鼠抗人ABCG2,1∶100一抗稀释液50μl,置湿盒内4℃过夜；PBS漂洗后加FITC标记的二抗（山羊抗小鼠）,置避光湿盒内室温下1h；PBS漂洗,荧光显微镜下在同一光线强度照相观察、成像。

（2）激光共聚焦检测。

耐药株细胞在铺盖玻片的6孔板中培养至70%～80%融合后,取出盖玻片,4%多聚甲醛固定,室温下静置30min；PBS洗涤后加入%TritonX100室温下作用10min；PBS洗涤后加入封闭血清室温下作用30min；加入小鼠抗人ABCG2,1∶100一抗稀释液50μl,置湿盒内4℃过夜；PBS漂洗后加FITC标记的二抗（山羊抗小鼠）,置避光湿盒内室温下1h；PBS漂洗后滴加DAPI,室温下暗处10min；PBS漂洗后加入抗荧光淬灭剂封片；激光扫描共聚焦显微镜观察、成像。

　　统计学处理

　　数据以x-±s表示,采用SPSS统计软件进行数据分析,配对资料采用t检验,P＜表示差异有统计学意义。

　　2结果

　　胰腺癌Patu8988