重组单抗药物的肽图分析_精品文档.pdf

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生物杖术通报研究报告丑了口百厅口乙口年增刊重组单抗药物的肤图分析魏敬双程立均刘进怀贾茜华北制药集团新药研究开发有限责任公司,石家庄巧摘要建立了重组单抗药物的肤图分析方法。

在变性条件下向抗体溶液加入还原剂,打开抗体内部所有交联的二硫键,再加入烷基化试剂封闭所有的自由筑基,使抗体分子在溶液中以游离伸展肤链的形式存在。

加入胰蛋白酶,将充分伸展的肤链酶解成小的肤段。

用反相高效液相色谱层析分析肤图谱。

对连续批中试产品及理化测定对照品进行肤图分析,各样品均能酶解完全,批间肤图谱一致。

该方法实用有效,适于进行重组单抗等结构复杂的大分子蛋白药物的肤图检查分析。

关键词重组单抗肤图抗狂犬病毒单抗胰蛋白酶反相八心翻刀门召,材以,访,理双珍,铭,班,卿叮,盯呷脚叫,一,即氏一口对于重组蛋白质药物的肤图检查,我国药典川中收录了两种方法,分别为胰蛋白酶裂解一反相高效液相色谱法和嗅化氰裂解法。

其中第一种方法应用更为广泛。

但是,对于重组单克隆抗体产品的肤图检查,如果使用药典中的胰酶裂解一反相分析方法,几乎得不到裂解峰图。

这是因为抗体分子结构复杂,由四条肤链组成,链间及链内由多对二硫键相联。

即使肤链被胰酶切开,但仍被二硫键联在一起,无法分成独立的肤段。

重组人源抗狂犬病毒单抗一,是采用基因工程手段,用中国仓鼠卵巢工程细胞表达的全人源亚型抗体,用于狂犬病毒暴露后预防。

在产品研发过程中,对重组抗体的肤图检查法进行了实验摸索,确定了使抗体产品酶解完全的实验方法。

材料与方法主要试剂与仪器为脚公司产品,盐酸肌,碘乙酞胺,二硫苏糖醇均为分析纯试剂。

基金项目“十一五”计划生物和医药技术领域重大项目基金资助作者简介魏敬双一,女,高级工程师,从事生物技术药物研究开发工作年增刊魏敬双等重组单抗药物的肤图分析了,乙二山二侧乃口刀刀刀图刀,刀刀刀刀刀刀刀刀用现行药典方法得到的重组人源抗狂犬病毒单抗原液的肚图重组人源抗狂犬病毒单抗原液批号,及理化测定对照品批号,浓度约岁,由华北制药集团新药研究开发有限责任公司试制。

超滤离心管截流量,超滤离心管截流量,。

台式高速冷冻离心机,一。

林一柱为公司产品。

高压液相色谱仪为公司产品巧泵,检测器,叮作站。

方法抗体蛋白的充分变性取重组人源抗狂犬病毒单抗原液或理化测定对照品闪,移人截流量为的超滤离心管,离心,加人含盐酸肌的碳酸氢铰溶液林,混匀后移人管中。

二硫键还原及烷基化保护按文献叫介绍的方法进行。

大致过程为向上述样品管中加入二硫苏糖醇溶液闪,混匀后于水浴。

加人碘乙酞胺溶液闪,混匀后于室温避光放置。

胰蛋白酶裂解将上述反应溶液移人截流量为的超滤离心管,离心,加人碳酸氢铁溶液闪,混匀后移人一装有胰蛋白酶溶液岁,序列分析纯闪的管中,于水浴,放置以终止反应。

反相分析将终止反应的样品管离心,精密量取上清液闪注人液相色谱仪。

以三氟乙酸的水溶液为流动相液以的乙睛溶液为流动相液。

流速为。

梯度洗脱液从至,液从至,检测波长。

结果对连续批中试规模制备的重组人源抗狂犬病毒单抗原液样品及理化测定对照品进行肤图分析,各批样品图形一致,结果见图。

讨论生物工程产品的质量控制是保障产品质量的关键,其中肤图是研究蛋白质一级结构的一种重要的分析方法。

对重组蛋白质药物来说,肤图分析可作为与天然产品或参考品作精密比较的手段,可以鉴别蛋白质的翻译后修饰,其次可以用作产品批间同一性的检测手段。

早在年,等就通过肤图谱分析的手段,鉴别出了第一个获得批准上市的治疗性单抗玲的降解位点。

目前,重组单抗药物已经成为生物技术制药的开发热点,我国也已有多个单抗产品获得生产批文。

作为重组蛋白质药物质量控制的一项重要内容,关于单抗的肤图分析方法值得我们进行认真的实验摸索。

对于含有多对二硫键的结构复杂的大分子蛋白质,为了得到酶解完全的肤段,首先需要将所有二硫键进行还原处理,使二硫键断裂成为还原状态的自由琉基。

为防止自由琉基再次形成二硫键,可采用生物杖术通报舒年增刊烷基化封闭的手段。

通过上述处理,蛋白质分子在溶液中成为彼此游离的伸展肤链,适于进行胰蛋白酶裂解。

对于含有大量二硫键的蛋白质,溶液中必须有足够的还原剂才能使所有二硫键得到充分还卜一一一原。

关于所需还原剂和烷基化试剂的用量,【推荐的剂量是,的量比二硫键的总量多,而碘乙酞胺的量则要比溶液中琉基的总摩尔数富余倍。

住川,注,。

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二,呱如喇甲叨兀匕二司山曰上一力刀刀,贬刀刀刀乃一刀力刀刀一户刀刀刀刀刀力刀刀重组人源抗狂犬病毒单抗原液样品及理化测定对照品的肤图姗哪即岌一一伴年增刊魏敬双等重组单抗药物的肤图分析为从重组单抗的肤图谱得到更多的信息,等还曾尝试过先将重组抗体的轻链、重链分开,分别进行蛋白酶裂解之后进行一分析。

利用这种方法,鉴别出了一种单抗的重链发生交联变异的情况。

在对抗体样品进行变性及胰蛋白酶裂解前,均需将抗体样品的缓冲液置换为适于进行下一步操作的环境中,常规的换液方式是采用透析法,透析换液的过程非常耗时,一般需要透析几个小时,而且在透析过程中,常常伴随着样品的稀释,透析换液后样品浓度降低。

本试验中,所有的换液操作通过超滤离心完成,使用超滤离心管,可以在很短的时间内完成换液操作,同时,样品还可以很方便地浓缩到所需要的浓度。

所以,只要选择好合适的截流量,使用超滤离心管进行换液操作是代替透析法的非常实用的手段。

鉴于台式高速离心机在一般的分析检测实验室已经属于常规仪器,所以用超滤离心代替透析法并不需额外的仪器设备,却可以大大缩短实验的时间,同时也避免了频繁更换透析液的繁琐操作。

除重组单抗药物外,其它一些分子量大、结构复杂、二硫键含量高的重组蛋白药物如我公司在研的重组人血白蛋白,每分子含对二硫键的肤图谱分析都可以适用于本研究所建立的方法。

参考文献国家药典委员会中华人民共和国药典年版部北京化学工业出版社,附录一,一,一,习滋,一盯,一,司,群,一上接第页选和检测更多中风相关多态性位点是我们研究的下一步目标卿。

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参考文献,洲,一,一,一,刃,一李瑶主编基因芯片技术一解码生命,北京化学工业出版社,叉,一,一张晨,等中华老年心血管病杂志,一住,印,一,加,一,苏净,谭兰国外医学脑血管疾病分册,一肠,肠,一张颖冬,等中风与神经疾病杂志,一赵勇,等中华老年心血管病杂志,一,一,一,一,口罗,一,习,一王先梅,等国外医学脑血管疾病分册,一一,一,一,又,一,】,盯,城,一王忠,刘建勋,王永炎中国药理学通报,一