蛋白质水解度测定方法综述.pdf
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食品研究与开发2007.Vol.28.NO.07作者简介：
徐英操（1978-），男（汉），助教，研究方向：
食品蛋白质及酶水解。
蛋白质由不同的氨基酸通过肽键相连所组成，在这些氨基酸中一部分可以由人体自己合成，称为非必需氨基酸；而另外约有八种氨基酸必需由食物供给，称为必需氨基酸。
食物中如含有全部的必需氨基酸，而且数量又多，这种食物蛋白质营养价值就高。
但是，存在一个问题，就是如何使蛋白质或氨基酸更有利于人体的吸收，因此国内外通过对此进行大量的研究表明：
蛋白质通过水解，水解为二肽或三肽的产物在人体内要比自由氨基酸易于吸收，比没有水解的蛋白质更易于吸收1。
因此在用不同的蛋白质酶对蛋白质进行水解时，必须要对水解度进行测定。
1水解度的定义蛋白质的水解度DH（Degreeofhydrolysis）代表蛋白质在水解过程中，肽键被裂解的程度或百分比，数学表达式为：
DH=hhtot100%式中：
h是被裂解的肽键数，htot是原蛋白质中的总肽键数，这里的h和htot单位经常用mmol/g表示。
对于一个特定的蛋白质，htot是一个常数，一般采用文献中的经验值，比如：
大豆蛋白质的htot值为7.8mmol/g，酪蛋白质的htot值为8.2mmol/g，也可以根据蛋白质中氨基酸的组成成分计算得到2。
在水解过程中，当肽键断裂后，就会有一个新的-COOH和-NH2形成，因此，水解肽键的数，就可以根据水解后测定新形成的末端-COOH或-NH2基团的量确定。
2水解度测定方法2.1pH-state法pH-state法主要是基于蛋白质水解过程中，总是要伴随质子的释放或吸收，质子化的多少，依赖于溶液的pH，通过加入的用于维持体系pH的碱或酸的量直接计算出水解度3。
计算公式如下：
DH=hhtot100%=BNb1a1Mp1htot100%式中：
B：
是碱液的体积mL；Nb是碱液的浓度mol/mL；：
是氨基的离解度；Mp是底物中蛋白质总含量g；htot是底物中蛋白质中肽键的总数mmol/g（protein）。
徐英操，刘春红（东北农业大学理学院应用化学系，黑龙江哈尔滨150030）蛋白质水解度测定方法综述摘要：
对目前国内外常用的蛋白质水解度测定方法进行了综述，其中pH-state方法是通过滴定水解过程中释放的质子测定DH；OPA、TNBS及国内常用的水合茚三酮和甲醛等测定方法是利用游离氨基的反应测定DH。
关键词：
蛋白质；水解度；游离氨基；测定INTRODUCTIONOFMETHODFORDETERMINATIONOFDEGREEOFHYDROLYSISOFPROTEINHYDROLYSATESXUYing-cao,LIUChun-hong（DepartmentofChemistry,CollegeofScience,NortheastAgricultureUniversity,Harbin150030,Heilongjiang,China）Abstract：
Thispaperisasummarybasedonthecurrentdomesticandforeignusedmethodsformeasuringthedegreeofhydrolysisofproteinhydrolysates,whichpH-statemethodisusedtodetermineDH（degreeofhydroly-sis）byprotonsreleaseofthehydrolysisprocessintitration;OPA,TNBSanddomesticcommonlyused,suchasninhydrinandformaldehydearemeasuredbyfree-amidosresponse.Keywords：
protein;degreeofhydrolysis;freeamidogen;determination综述173食品研究与开发2007.Vol.28.NO.07-氨基的解离度可以用下面的公式计算：
1a=1+10pK-pH因为蛋白中亮氨酸游离的氨基的量与碱液的量成正比关系，斜率用b表示，那么分别在pH1和pH2下进行水解，就可以利用下面的公式计算pK值4：
pK=pH2+log（b2-b1）-log（10pH2-pH1b2-b1）pH-state法的优点在于操作简单、快速、可重复性高，通常被用于水解度的连续测定。
然而这种方法一是在研究中需要用其他的方法进行校正；二是这种方法仅适用于中性及碱性（pH7）或pH3的酸性溶液中进行的水解，并且需要特别的仪器控制水解过程中的pH。
袁斌等人5在基于国外通用的pH-state法基础上，介绍了一种比较简单可行的蛋白质水解度的测定方法，采用本方法测定蛋白质水解度时，不需要经典的pH-state法那样，对反应体系的pH值进行在线控制，而只需在水解结束后将反应体系的pH调至7.0，并记录下所用的碱液的量即可。
具体方法如下：
水解开始时，调节反应体系的pH为7.0，反应结束后测定反应体系的pH值，用0.5mol/L的NaOH将反应体系的pH调到原来的pH，记录下所用的碱液的量，按下式即可计算出酪蛋白的水解度:
DH=BMb1a1Mp1htot100式中:
B：
NaOH的体积（mL）；Mb：
NaOH的浓度（mol/L）；在pH7.0，50的实验条件下，对于酪蛋白，1/为2.26；Mp：
蛋白质的质量（g）；htot：
每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数，对于酪蛋白，该值取8.2mmol/g。
2.2三硝基苯磺酸法（TrinitrobenzenesulfonicAcidTNBS）这个方法由JensAdler-Nissen6于1979年进行了详细描述，TNBS能与游离的氨基酸反应生成能在340nm处有吸收峰的物质。
反应是在弱碱性环境中，在酸性中终止。
水解度的计算公式下：
DH=AN2-AN1Npb100式中：
AN1指蛋白水解前氨基氮的含量mg/g（pro-tein）；AN2指蛋白水解后氨基氮的含量mg/g（pro-tein）；Npb指蛋白底物中肽键的氮含量。
AN1和AN2的值可由标样在340nm时的吸收曲线得知（标样一般采用L-亮氨酸）7。
Y.L.Xiong等8引用Adler-NissenTNBS法测定了酶水解WPI（wheyproteinisolate）的水解度，计算如下：
DH=hs-hoht-ho100式中：
hs和ho分别代表WPI水解产物中和没进行水解的WPI中氨基酸浓度；ht代表用6mol/L盐酸完全水解WPI产物中总的氨基酸的浓度。
没有酶的没水解的蛋白质溶液视为0%DH。
2.3邻苯二甲醛（Ortho-phthalaldehyde，OPA）法Church等9人首先于1983年应用OPA测定了蛋白质水解度,OPA是在碱性介质中与游离氨基反应生成具有荧光性的异吲哚衍生物，其反应如下：
使用荧光光度计在吸收波长为340nm条件下测定衍生物的荧光度。
水解度的计算公式：
DH=100n/N式中：
n代表牛乳蛋白水解后肽键的平均数，N代表每个蛋白分子的肽键总数。
n可用以下公式表示：
n=AbsMdC式中：
Abs指被测样品在340nm处的吸收峰与未水解样品在340nm处吸收峰的差值，M指被测蛋白的分子量，d指稀释因数，指340nm处的摩尔消光系数（6000/molcm），C指蛋白浓度（g/L）。
KangS.Lee等10利用荧光法测定游离氨基酸原理，针对半胱氨酸与胱氨酸与邻苯二醛反应生成的衍生物具有低荧光性的缺陷，进行研究，建立了通用、高灵敏度的利用OPA/2-ME进行蛋白质微量氨基酸分析。
2.4水合茚三酮（ninhydrin）法早在1949年TheodoreB.Schwartz11就已经对此做了详细的描述，水解样品的光密度可由下式求得：
m0（a0-a）+m1a+m2a=Dx其中：
0为底物的初始浓度，为每个水解产物的浓度，m0为光密度对底物浓度的直线关系的斜率，m1和m2为两种水解产物的斜率。
Dx任一水解样品的光密度。
水解度可由下列方程求得：
DH=（Dx-DO）等同于100/（0（m1+m2-m0），D0初始底物浓度的光密度。
水合茚三酮与-氨基酸一起在水溶液中加热，可发生反应生成蓝紫色物质。
首先是氨基酸被氧化分综述174食品研究与开发2007.Vol.28.NO.07解，放出氨和二氧化碳，氨基酸生成醛，水合茚三酮则生成还原型茚三酮。
在弱酸性溶液中，还原型茚三酮、氨和另一分子茚三酮反应，缩合生成蓝紫色物质。
根据水解度的定义如果直接用水解后游离氨基总含量计算水解度，由于用水合茚三酮显色法无法判断水解后的游离氨基是原样品中本来就含有的还是经水解产生的，因此，赵新淮，冯志彪12对此进行研究，并对原料大豆中游离氨基酸进行测定，计算如下：
DH=水解蛋白质的-NH2含量-0.33（mmol/g）7.8（mmol/g）100%其中：
0.33是原料大豆样品中游离氨基含量，可根据自己样品测定值代入。
但是由于不同氨基酸和水合茚三酮显色不同，对测量结果有部分偏差，例如脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质，因其-氨基被取代，所以产生不同的衍生物。
郭兴凤13利用待水解原料的完全水解液作为标准,消除了由于不同氨基酸与茚三酮结合产物的呈色度不同对测定结果造成的误差,并依据QinYunChen14的方法和现行的方法进行改进,使测定结果更接近真实值。
计算如下：
DH=A1000WV11
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