猪病实验室常规诊断技术.docx

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猪病实验室常规诊断技术

猪病实验室常规诊断技术

目录

一、诊断室工作人员的总的要求1

二、显微镜的构造及使用2

三、细菌学检查5

四、抗菌药物敏感性试验10

五、猪寄生虫病诊断方法14

六、常规病毒学实验技术17

七、猪瘟检测方法31

八、检测口蹄疫病毒抗原的方法34

十、检测口蹄疫血清抗体的方法39

十一、伪狂犬病检测方法44

十一、衣原体病间接血凝（IHA）试验操作方法53

十二、猪细小病毒检测方法55

十三、猪喘气病间接血凝试验操作方法58

十四、猪传染性萎缩性鼻炎乳胶凝集试验（LAT）操作方法59

十五、猪传染性胸膜肺炎间接血凝试验（IHA）操作方法60

十六、乙型脑炎检测方法62

一、诊断室工作人员的总的要求

（一）任务

1．快速和初步检出细菌与毒素。

2．采集的原标本和分离菌种的后送。

3．病毒处理和后送。

4．常见疾病的初步诊断与监测。

5．动物群体血清抗体水平监测。

（二）注意事项

从事兽医实验室诊断，会接触病原微生物，故要求工作谨慎，严防微生物扩散或实验室感染。

实验过程中的污染器材和污染物，应进行无害化处理，严禁乱扔。

提高人员防护意识，防止事故，确保人员安全。

实验室又是进行实验诊断的重要工作场所，故应保持整洁，有序，并注意节约。

整个实验操作过程，要有无菌操作的意识，特别是在微生物的分离培养，纯化，生长鉴定，动物感染试验等操作中，要严格遵守无菌操作的原则，否则结果将无意义。

（三）检查方法

病原学检查（包括显微镜检查、细菌分离培养、动物试验）

血清学检查（抗原抗体反应）

变态反应检查（布氏杆菌病，结核杆菌）

二、显微镜的构造及使用

显微镜是从事畜牧兽医实验室研究工作必不可少的工具之一，只有了解显微镜的原理和结构，才能正确地使用和充分发挥它的作用。

（一）显微镜的结构显微镜的结构可分为机械部分和光学部分

1．机械部分

镜筒是显微镜上方斜向的圆筒，上端套有接目镜，下端连接半球形膨大部，内装有一块五角棱镜。

镜筒下部与镜臂之间有转向装置，并由一小螺旋固定，使镜筒在一个固定平面上转动不同的方向。

物镜转换器连接在镜筒下端的一个凸面圆盘上装置3—4个不同放大率的物镜，转换器的边缘有一个固定卡，每当所转换的物镜与光轴同心时，即发出一种吻合的响声。

镜座及镜柱镜座在显微镜的底部，呈马蹄形，支撑着整个显微镜，使其稳固地放置在工作台上，有些显微镜的镜座内还装有照明光源和反射镜。

镜座上接镜柱。

镜柱是载物台、聚光器镜臂等的支柱，也是细调节装置的机巢。

镜臂在镜座与镜筒之间，呈弓形，在镜臂的底部与镜座相接处有粗、细调节轮。

粗调节轮（粗螺旋）系一对较大的旋动手轮，位于镜臂下端，粗调节轮旋转一圈可使物镜迅速抬升或下降10毫米，以调节焦距。

细调节轮（细螺旋）为一对较小的旋动手轮，位于粗调节轮前方的镜柱上，旋转一圈可使镜筒抬升或下降0.1毫米，细调节轮根部有不动的外套圈和可动的内轴（圈），它们均有刻度，表示每格等于0.002毫米，每动一格表示物镜抬升或下降2微米。

载物台固定在镜柱前上方，呈方形或圆形。

台中央的圆孔称为通光孔，台的表面装有二个压夹，用以固定玻片标本。

有的载物台是移动式，由上、下两层构成，装有旋柄，可使载物台下层能左右、前后移动。

如不需载物台活动可拧紧在右侧的载物台固定螺旋。

有的载物台上可装置推进器，利用推进器的两个旋钮可以前后、左右移动玻片标本。

2．光学部分光学部分主要包括目镜、物镜、聚光器、镜筒内的棱镜及反光镜等。

目镜（接目镜）目镜套在镜筒端，主要作用是扩大物镜所形成的实像，常由上、下两组透镜组成，在两组透镜之间有一个固定光栅，光栅的大小决定视场（视野）的大小。

目镜上标有5×、10×、15×等符号，代表目镜的放大倍数，常用的为10×。

根据教学需要，在目镜内可以自行装置“指针”（用一小段发丝胶粘有固定的光栅上）。

物镜（接物镜）是显微镜的主要光学部分，常称为镜头，它由多组透镜片组成，嵌在物镜转换器下方。

用来放大被检的玻片标本。

物镜一般分为低倍镜、高倍镜和油浸镜三种。

低倍镜：

其透镜镜口率（即数值孔径，简称N.A.）小、焦距长、放大倍数低、工作距离长，约7.63毫米（工作距离是指在调准焦点的情况下，物镜的前透镜至标本盖玻片表面的距离）。

如低倍物镜上标着10×/NA0.25和160/0.17（10×是放大倍数，NA0.25是镜口率，160是指镜筒长度，0.17是要求盖玻片的厚度）。

高倍镜上标有40×/0.65和160/0.17，工作距离为0.53毫米，同一型号显微镜的低、高倍物镜，在高计时已经考虑到可进行同高调焦，由低倍物镜转成高倍物镜后稍转动细调节轮即可调准焦距。

有些高倍镜、油镜，在镜头下端安有弹簧装置，可以压缩，可防止损坏玻片标本。

一般把目镜和物镜的放大倍数相乘，其得数即是显微镜的放大倍数。

如目镜10×，物镜10×，显微镜的放大倍数即10×10=100（即放大100倍）。

从物镜使用性能上的不同，又可分为干燥系物镜和油浸系物镜。

干燥系物镜：

是指镜头与被检标本之间以空气为介质的物镜，放大倍数较低，5×、10×、20×、40×等的物镜均属此类。

油浸系物镜：

在镜头与被检物之间需要以油为介质的物镜叫油浸镜，是物镜中放大倍数最大的镜头，有90×或100×等。

镜头上有黑圈、红圈或双层螺纹为标记。

在使用时必须在被检的玻片标本上滴加香柏油或石蜡油（与镜片的折光率相近似），使镜头与玻片之间借油滴相接触，避免透射的光线散失。

聚光器由一组透镜组成，装置于载物台下方，旋动聚光器升降螺旋，可改变聚光器的位置，借以调节被检物体上的光线强度，聚光器抬升时，光线增强，下降时，光线减弱。

聚光器上还装有可变光栅（虹彩）以调节进光量。

反射镜装在镜柱前下方，聚光器下，有平、凹两面。

反光镜可向各方转动，主要用来聚集光线，一般在人工光源或需要强的光线时，使用凹面镜，在天然光线或不需要较强的光线时，使用平面镜。

镜筒内折射棱镜装在镜筒下部的球形膨大部内，通过棱镜，可将接物镜所形成的影像呈45度角折射向目镜。

（二）显微镜的使用在使用显微镜时必须细心、谨慎，使用时应注意：

1．位置与姿势显微镜应放置在平稳的工作台上，同时注意将显微镜在身前稍左侧，使用者最好用左眼观察，右眼同时睁开，切忌在镜检时眯起或闭起右眼，以防止损伤视力。

2．光线的采集用天然光线应避免日光直射，以免损伤视力和图像出现光晕，如使用黄色灯时（钠光灯）应加蓝色滤光片。

3．聚光器的调整用高倍接物镜或油浸镜时，应将聚光器上升到最高点（此时，光线最强，但照明范围小）。

使用低倍物镜时，应将聚光器适当下降，调节至整个视场光亮均匀。

4．目镜的选择目镜倍数越低观察的影像愈清晰。

初学者往往喜欢用高倍目镜，这样所获的影像模糊不清，长时间观察也会感到头昏，平时应采用10×目镜为宜。

5．物镜的使用

干燥系物镜的使用镜检时宜先用低倍物镜对准通光孔或被检材料，进行观察，必要时，再换用高倍接物镜观察，不允许直接用高倍镜。

使用低倍物镜时，先将被检材料放在载物台上，用台上的压夹或推进器将玻片夹牢，然后转动粗调节轮，使镜筒下降接近被检玻片标本，约在6毫米左右，此时，从目镜中边观察边转动粗调节轮，使镜筒缓缓抬升，至视场中出现模糊的影像时，再用细调节轮，至物像清晰为止。

在低倍物镜下观察到的物镜，如需再放大，可调换高倍物镜，但被检物部分必须移到视场中央，一般情况下可直接转换高倍物镜，再用细调节轮稍加调节即可获得清晰的影像。

油浸系物镜的使用使用油浸前，必须先在低倍和高倍物镜下找到被检的部分，并移到视野中央，然后将聚光器上升，提升镜筒，转动物镜转换器，调换成油镜头，在玻片上滴加香柏油或石蜡油一小滴，再全神贯注地慢慢下降油镜，使镜头与滴加在盖玻片上的油滴相接触。

这时再自目镜中边观察边慢慢旋转细调节轮，使镜筒提升，直到出现清晰物像为止，再适度调节聚光器及光圈，使达到良好的观察效果。

注意使用油镜时，不宜大范围地移动玻片，以免油滴散失。

油镜使用完毕，提升镜筒，取去标本，先用擦纸擦去镜头及玻片上的油滴，然后再用擦镜纸蘸少量二甲苯擦拭一次，最后，用擦镜纸再次擦拭镜头及玻片，将残留的二甲苯擦去。

二甲苯的用量不宜过多，因二甲苯可以溶解粘接固定镜片的胶质。

（三）显微镜的保护

1．取放显微镜时，右手握紧镜臂，左手托住镜座，拿正，拿稳，不得单手取放。

2．勿使显微镜的任何部件与酸、碱或其他腐蚀性物品接触。

3．保持显微镜的清洁，使用完毕应用绸布将镜身机械部分擦拭干净。

旋转镜转换器使用物镜偏离通光孔，下降镜筒。

复原玻片夹，提升聚光器，把反射镜竖立以避尘埃。

4．注意防尘、防潮、防霉。

擦拭镜头必须用擦镜纸，保护好光学部分。

5．不得随意拆卸机械部件及光学部分，显微镜如发生故障可与供应商联系解决。

（李自力石德时）

三、细菌学检查

（一）细菌的分离培养

1．培养基制作的原则和一般步骤

（1）培养基制作的原则培养基是人工方法将多种物质按照各类微生物生长的需要而合成的一种混合营养料，一般用以分离和培养菌类。

常用的培养基有基础培养基、增菌培养基、选择培养基、鉴别培养基等。

在制作培养基时应掌握如下原则和要求：

培养基必须含有细菌生长所需要的营养物质。

必须彻底灭菌,不得含有任何活细菌。

培养基的材料和盛培养基的容器上,没有抑制细菌生长的物质。

所制备培养基应该是透明的，以便观察细菌生长性状和其它代谢活动所产生的变化。

培养基的酸碱度应该符合细菌的生长要求，多数细菌生长适宜范围是弱碱（pH7.1~7.6）。

（2）培养基制备的一般过程不同的培养基其制备方法不同，一般要经如下步骤：

根据不同的菌类和用途，选择适宜的培养基。

精确称量各种成分。

将各种成分按规定加热溶解，调整pH到适宜的范围内。

再加热煮沸10~15分钟（注意补加液体的损耗）

过滤（用滤袋或纱布棉花），分装、灭菌（不同的培养基的灭菌温度和时间不同，通常为15磅压力下15~30分钟）

培养基中的某些成分，象血清、腹水、糖类、尿素、氨基酸、酶等，在高温下易分解，变性，故应用滤菌器过滤，再按规定的温度和量加入培养基中。

无菌检验，取作好的培养基数管，置37℃恒温箱内24小时，若无细菌和霉菌生长即可使用。

2．细菌的分离培养

在细菌学诊断中，细菌的分离培养是不可缺少的一环，分离培养的目的是在病料中由多种细菌里挑选出可疑菌。

在分离培养之前，首先应该注意下列事项：

（1）选择适合于所含分离细菌生长的培养基。

（2）培养温度一般在37℃，但应考虑特殊细菌对温度的要求。

（3）考虑所分离的细菌是需氧性或厌氧性，进一步决定培养条件。

（4）初步分离时发现有多种细菌，应进一步选择可疑菌落进行纯培养

（二）细菌的接种

1．平板划线法此法为常用的细菌分离培养法。

平板划线培养的方法甚多，可按各人的习惯选择应用，其目的都是将被检材料作适当的稀释，以求获得独立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。

划线培养时须注意以下几点：

（1）左手持皿，用左手拇指，食指及中指将皿盖揭开成20度左右的角度（角度愈小愈好，以免空气中的细菌进入皿中将培养基污染）。

（2）右手持接种环，将材料少许涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，待接种环冷却后，再与涂材料之处轻轻接触，开始划线。

（3）划线时先将接种环稍稍弯曲，这易和平皿内琼脂平行，不致划破培养基。

（4）划线中不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。

（5）平皿盖向下，在培养皿上标注样品名称、编号、接种日期后，置温箱中培养。

2．斜面接种法

3．液体培养基接种法

（三）细菌培