猪病实验室常规诊断技术.docx

1、猪病实验室常规诊断技术猪病实验室常规诊断技术目录一、诊断室工作人员的总的要求 1二、显 微 镜 的 构 造 及 使 用 2三 、细 菌 学 检 查 5四、抗菌药物敏感性试验 10五、猪寄生虫病诊断方法 14六、常规病毒学实验技术 17七、猪瘟检测方法 31八、检测口蹄疫病毒抗原的方法 34十、检测口蹄疫血清抗体的方法 39十一、伪狂犬病检测方法 44十一、衣原体病间接血凝（IHA）试验操作方法 53十二、猪细小病毒检测方法 55十三、猪喘气病间接血凝试验操作方法 58十四、猪传染性萎缩性鼻炎乳胶凝集试验（LAT）操作方法 59十五、猪传染性胸膜肺炎间接血凝试验（IHA）操作方法 60十六、乙型

2、脑炎检测方法 62一、诊断室工作人员的总的要求 （一）任务1 快速和初步检出细菌与毒素。2 采集的原标本和分离菌种的后送。3 病毒处理和后送。4 常见疾病的初步诊断与监测。5 动物群体血清抗体水平监测。 （二）注意事项 从事兽医实验室诊断，会接触病原微生物，故要求工作谨慎，严防微生物扩散或实验室感染。实验过程中的污染器材和污染物，应进行无害化处理，严禁乱扔。提高人员防护意识，防止事故，确保人员安全。实验室又是进行实验诊断的重要工作场所，故应保持整洁，有序，并注意节约。 整个实验操作过程，要有无菌操作的意识，特别是在微生物的分离培养，纯化，生长鉴定，动物感染试验等操作中，要严格遵守无菌操作的原则

3、，否则结果将无意义。 （三）检查方法病原学检查（包括显微镜检查、细菌分离培养、动物试验）血清学检查（抗原抗体反应）变态反应检查（布氏杆菌病，结核杆菌）二、显 微 镜 的 构 造 及 使 用显微镜是从事畜牧兽医实验室研究工作必不可少的工具之一，只有了解显微镜的原理和结构，才能正确地使用和充分发挥它的作用。（一）显微镜的结构 显微镜的结构可分为机械部分和光学部分1机械部分镜筒 是显微镜上方斜向的圆筒，上端套有接目镜，下端连接半球形膨大部，内装有一块五角棱镜。镜筒下部与镜臂之间有转向装置，并由一小螺旋固定，使镜筒在一个固定平面上转动不同的方向。物镜转换器 连接在镜筒下端的一个凸面圆盘上装置34个不同

4、放大率的物镜，转换器的边缘有一个固定卡，每当所转换的物镜与光轴同心时，即发出一种吻合的响声。镜座及镜柱 镜座在显微镜的底部，呈马蹄形，支撑着整个显微镜，使其稳固地放置在工作台上，有些显微镜的镜座内还装有照明光源和反射镜。镜座上接镜柱。镜柱是载物台、聚光器镜臂等的支柱，也是细调节装置的机巢。镜臂 在镜座与镜筒之间，呈弓形，在镜臂的底部与镜座相接处有粗、细调节轮。粗调节轮（粗螺旋） 系一对较大的旋动手轮，位于镜臂下端，粗调节轮旋转一圈可使物镜迅速抬升或下降10毫米，以调节焦距。细调节轮（细螺旋） 为一对较小的旋动手轮，位于粗调节轮前方的镜柱上，旋转一圈可使镜筒抬升或下降0.1毫米，细调节轮根部有不

5、动的外套圈和可动的内轴（圈），它们均有刻度，表示每格等于0.002毫米，每动一格表示物镜抬升或下降2微米。载物台 固定在镜柱前上方，呈方形或圆形。台中央的圆孔称为通光孔，台的表面装有二个压夹，用以固定玻片标本。有的载物台是移动式，由上、下两层构成，装有旋柄，可使载物台下层能左右、前后移动。如不需载物台活动可拧紧在右侧的载物台固定螺旋。有的载物台上可装置推进器，利用推进器的两个旋钮可以前后、左右移动玻片标本。2光学部分 光学部分主要包括目镜、物镜、聚光器、镜筒内的棱镜及反光镜等。目镜（接目镜） 目镜套在镜筒端，主要作用是扩大物镜所形成的实像，常由上、下两组透镜组成，在两组透镜之间有一个固定光栅，

6、光栅的大小决定视场（视野）的大小。目镜上标有5、10、15等符号，代表目镜的放大倍数，常用的为10。根据教学需要，在目镜内可以自行装置“指针”（用一小段发丝胶粘有固定的光栅上）。物镜（接物镜） 是显微镜的主要光学部分，常称为镜头，它由多组透镜片组成，嵌在物镜转换器下方。用来放大被检的玻片标本。物镜一般分为低倍镜、高倍镜和油浸镜三种。低倍镜：其透镜镜口率（即数值孔径，简称N.A.）小、焦距长、放大倍数低、工作距离长，约7.63毫米（工作距离是指在调准焦点的情况下，物镜的前透镜至标本盖玻片表面的距离）。如低倍物镜上标着10/NA0.25和160/0.17(10是放大倍数，NA0.25是镜口率，16

7、0是指镜筒长度，0.17是要求盖玻片的厚度)。高倍镜上标有40/0.65和160/0.17，工作距离为0.53毫米，同一型号显微镜的低、高倍物镜，在高计时已经考虑到可进行同高调焦，由低倍物镜转成高倍物镜后稍转动细调节轮即可调准焦距。有些高倍镜、油镜，在镜头下端安有弹簧装置，可以压缩，可防止损坏玻片标本。一般把目镜和物镜的放大倍数相乘，其得数即是显微镜的放大倍数。如目镜10，物镜10，显微镜的放大倍数即1010=100（即放大100倍）。从物镜使用性能上的不同，又可分为干燥系物镜和油浸系物镜。干燥系物镜：是指镜头与被检标本之间以空气为介质的物镜，放大倍数较低，5、10、20、40等的物镜均属此类

8、。油浸系物镜：在镜头与被检物之间需要以油为介质的物镜叫油浸镜，是物镜中放大倍数最大的镜头，有90或100等。镜头上有黑圈、红圈或双层螺纹为标记。在使用时必须在被检的玻片标本上滴加香柏油或石蜡油（与镜片的折光率相近似），使镜头与玻片之间借油滴相接触，避免透射的光线散失。聚光器 由一组透镜组成，装置于载物台下方，旋动聚光器升降螺旋，可改变聚光器的位置，借以调节被检物体上的光线强度，聚光器抬升时，光线增强，下降时，光线减弱。聚光器上还装有可变光栅（虹彩）以调节进光量。反射镜 装在镜柱前下方，聚光器下，有平、凹两面。反光镜可向各方转动，主要用来聚集光线，一般在人工光源或需要强的光线时，使用凹面镜，在天

9、然光线或不需要较强的光线时，使用平面镜。镜筒内折射棱镜 装在镜筒下部的球形膨大部内，通过棱镜，可将接物镜所形成的影像呈45度角折射向目镜。（二）显微镜的使用 在使用显微镜时必须细心、谨慎，使用时应注意：1位置与姿势 显微镜应放置在平稳的工作台上，同时注意将显微镜在身前稍左侧，使用者最好用左眼观察，右眼同时睁开，切忌在镜检时眯起或闭起右眼，以防止损伤视力。2光线的采集 用天然光线应避免日光直射，以免损伤视力和图像出现光晕，如使用黄色灯时（钠光灯）应加蓝色滤光片。3聚光器的调整 用高倍接物镜或油浸镜时，应将聚光器上升到最高点（此时，光线最强，但照明范围小）。使用低倍物镜时，应将聚光器适当下降，调节

10、至整个视场光亮均匀。4目镜的选择 目镜倍数越低观察的影像愈清晰。初学者往往喜欢用高倍目镜，这样所获的影像模糊不清，长时间观察也会感到头昏，平时应采用10目镜为宜。5物镜的使用干燥系物镜的使用 镜检时宜先用低倍物镜对准通光孔或被检材料，进行观察，必要时，再换用高倍接物镜观察，不允许直接用高倍镜。使用低倍物镜时，先将被检材料放在载物台上，用台上的压夹或推进器将玻片夹牢，然后转动粗调节轮，使镜筒下降接近被检玻片标本，约在6毫米左右，此时，从目镜中边观察边转动粗调节轮，使镜筒缓缓抬升，至视场中出现模糊的影像时，再用细调节轮，至物像清晰为止。在低倍物镜下观察到的物镜，如需再放大，可调换高倍物镜，但被检物

11、部分必须移到视场中央，一般情况下可直接转换高倍物镜，再用细调节轮稍加调节即可获得清晰的影像。油浸系物镜的使用 使用油浸前，必须先在低倍和高倍物镜下找到被检的部分，并移到视野中央，然后将聚光器上升，提升镜筒，转动物镜转换器，调换成油镜头，在玻片上滴加香柏油或石蜡油一小滴，再全神贯注地慢慢下降油镜，使镜头与滴加在盖玻片上的油滴相接触。这时再自目镜中边观察边慢慢旋转细调节轮，使镜筒提升，直到出现清晰物像为止，再适度调节聚光器及光圈，使达到良好的观察效果。注意使用油镜时，不宜大范围地移动玻片，以免油滴散失。油镜使用完毕，提升镜筒，取去标本，先用擦纸擦去镜头及玻片上的油滴，然后再用擦镜纸蘸少量二甲苯擦拭

12、一次，最后，用擦镜纸再次擦拭镜头及玻片，将残留的二甲苯擦去。二甲苯的用量不宜过多，因二甲苯可以溶解粘接固定镜片的胶质。（三） 显微镜的保护 1取放显微镜时，右手握紧镜臂，左手托住镜座，拿正，拿稳，不得单手取放。 2勿使显微镜的任何部件与酸、碱或其他腐蚀性物品接触。 3保持显微镜的清洁，使用完毕应用绸布将镜身机械部分擦拭干净。旋转镜转换器使用物镜偏离通光孔，下降镜筒。复原玻片夹，提升聚光器，把反射镜竖立以避尘埃。 4注意防尘、防潮、防霉。擦拭镜头必须用擦镜纸，保护好光学部分。 5不得随意拆卸机械部件及光学部分，显微镜如发生故障可与供应商联系解决。(李自力 石德时)三 、细 菌 学 检 查（一）细

13、菌的分离培养 1培养基制作的原则和一般步骤 （1）培养基制作的原则 培养基是人工方法将多种物质按照各类微生物生长 的需要而合成的一种混合营养料，一般用以分离和培养菌类。常用的培养基有基础培养基、增菌培养基、选择培养基、鉴别培养基等。在制作培养基时应掌握如下原则和要求：培养基必须含有细菌生长所需要的营养物质。必须彻底灭菌,不得含有任何活细菌。培养基的材料和盛培养基的容器上,没有抑制细菌生长的物质。所制备培养基应该是透明的，以便观察细菌生长性状和其它代谢活动所产生的变化。培养基的酸碱度应该符合细菌的生长要求，多数细菌生长适宜范围是弱碱（pH7.17.6）。 （2）培养基制备的一般过程 不同的培养基

14、其制备方法不同，一般要经如下步骤： 根据不同的菌类和用途，选择适宜的培养基。 精确称量各种成分。 将各种成分按规定加热溶解，调整pH到适宜的范围内。再加热煮沸1015分钟（注意补加液体的损耗） 过滤（用滤袋或纱布棉花），分装、灭菌（不同的培养基的灭菌温度和时间不同，通常为15磅压力下1530分钟） 培养基中的某些成分，象血清、腹水、糖类、尿素、氨基酸、酶等，在高温下易分解，变性，故应用滤菌器过滤，再按规定的温度和量加入培养基中。 无菌检验，取作好的培养基数管，置37恒温箱内24小时，若无细菌和霉菌生长即可使用。 2细菌的分离培养 在细菌学诊断中，细菌的分离培养是不可缺少的一环，分离培养的目的是

15、在病料中由多种细菌里挑选出可疑菌。在分离培养之前，首先应该注意下列事项：（1）选择适合于所含分离细菌生长的培养基。（2）培养温度一般在37，但应考虑特殊细菌对温度的要求。 （3）考虑所分离的细菌是需氧性或厌氧性，进一步决定培养条件。 （4）初步分离时发现有多种细菌，应进一步选择可疑菌落进行纯培养 （二） 细菌的接种 1平板划线法 此法为常用的细菌分离培养法。平板划线培养的方法甚多，可按各人的习惯选择应用，其目的都是将被检材料作适当的稀释，以求获得独立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。划线培养时须注意以下几点： （1）左手持皿，用左手拇指，食指及中指将皿盖揭开成20度左右的角度（角度愈小愈好，以免空气中的细菌进入皿中将培养基污染）。 （2）右手持接种环，将材料少许涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，待接种环冷却后，再与涂材料之处轻轻接触，开始划线。 （3）划线时先将接种环稍稍弯曲，这易和平皿内琼脂平行，不致划破培养基。 （4）划线中不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。 （5）平皿盖向下，在培养皿上标注样品名称、编号、接种日期后，置温箱中培养。 2斜面接种法 3液体培养基接种法 （三）细菌培