小鼠相关转录因子试剂盒说明书模板.docx

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小鼠相关转录因子试剂盒说明书模板

小鼠Runt相关转录因子2（RUNX2）酶联免疫吸附测定试剂盒

使用说明书

产品编号:

E-EL-M1030

（本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!

）

声明:

尊敬的客户,感谢您选用本公司的产品。

本产品选用世界著名生产厂家的原料,采用专业ELISAkit生产技术制造。

适用于体外定量检测小鼠血清、血浆、组织匀浆或细胞培养上清液中天然和重组RUNX2浓度。

使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分!

如有疑问,请及时联系伊莱瑞特生物科技有限公司。

试剂盒组成:

名称-中文

名称-英文

规格

保存条件

ELISA酶标板

MicroELISAPlate

8×12/8×6*

4℃

冻干标准品

ReferenceStandard

2/1支*

4℃

标准品&样品稀释液

ReferenceStandard&SampleDiluent

1瓶20mL/12mL*

4℃

浓缩生物素化抗体

ConcentratedBiotinylatedDetectionAb

1支120μL/70μL*

4℃

生物素化抗体稀释液

DiluentforBiotinylatedDetectionAb

1瓶10mL/6mL*

4℃

浓缩HRP酶结合物

ConcentratedHRPConjugate

1支120μL/70μL*

4℃（避光）

酶结合物稀释液

DiluentforHRPConjugate

1瓶10mL/6mL*

4℃

浓缩洗涤液（25×）

ConcentratedWashBuffer（25×）

1瓶30mL/16mL*

4℃

底物溶液（TMB）

SubstrateReagent

1瓶10mL/6mL*

4℃（避光）

反应终止液

StopSolution

1瓶10mL/6mL*

4℃

封板覆膜

PlateSealer

5/3张*

产品说明书

ProductDescription

1份

*:

[96T/48T]（打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整）

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。

用抗小鼠RUNX2抗体包被于酶标板上,实验时标本或标准品中的RUNX2会与包被抗体结合,游离的成分被洗去。

依次加入生物素化的抗小鼠RUNX2抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。

抗小鼠RUNX2抗体与结合在包被抗体上的小鼠RUNX2结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物,游离的成分被洗去。

加入显色底物（TMB）,TMB在辣根过氧化物酶的催化下现蓝色,加终止液后变黄。

用酶标仪在450nm波长处测OD值,RUNX2浓度与OD450值之间呈正比,经过绘制标准曲线求出标本中RUNX2的浓度。

标本收集:

1.血清:

全血标本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟,取上清即可检测,收集血液的试管应为一次性的无热原,无内毒素试管。

2.血浆:

抗凝剂推荐使用EDTA.Na2,标本采集后30分钟内于1000×g离心15分钟,取上清即可检测。

避免使用溶血,高血脂标本。

3.组织匀浆:

用预冷的PBS（0.01M,pH=7.4）冲洗组织,以去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果）,称重后将组织剪碎。

将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:

9的重量体积比,比如1g的组织样本对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。

推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。

为了进一步裂解组织细胞,能够对匀浆液进行超声破碎,或重复冻融。

最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟,取上清检测。

4.细胞培养上清:

取细胞培养上清于1000×g离心20分钟,除去杂质及细胞碎片。

取上清检测。

5.其它生物标本:

1000×g离心20分钟,取上清即可检测

（具体处理方法可参考:

）

6.标本应清澈透明,悬浮物应离心去除。

7.标本收集后若不及时检测,请按一次使用量分装,冻存于-20℃/-80℃冰箱内,避免重复冻融,1-6月内检测,4℃保存的应在1周内进行检测。

8.如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值,请根据实际情况,做适当倍数稀释（建议先做预实验,以确定稀释倍数）。

试验所需自备物品:

1.酶标仪（450nm波长滤光片）

2.高精度移液器,EP管及一次性吸头:

0.5-10μL,2-20μL,20-200μL,200-1000μL

3.37℃恒温箱,双蒸水或去离子水

4.吸水纸

检测前准备工作:

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水稀释（1:

25）。

未用完的放回4℃。

从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象,可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃,使用时洗涤液应为室温）。

3.标准品:

加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中,静置10分钟,待其充分溶解后,轻轻混匀（浓度为20ng/mL）。

然后根据需要进行倍比稀释（注:

不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。

建议配制成以下浓度:

20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0ng/mL,样品稀释液直接作为空白孔0ng/mL。

如配制10ng/mL标准品:

取0.5mL20ng/mL的上述标准品加入含有0.5mL样品稀释液的EP管中,混匀即可,其余浓度依此类推。

4.生物素化抗体工作液:

实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计）,实际配制时应多配制100-200μL。

使用前15分钟,以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体（1:

100）成工作浓度。

当日使用。

5.酶结合物工作液:

实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计）,实际配制时应多配制100-200μL。

使用前15分钟,以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物（1:

100）成工作浓度。

当日使用。

标准品稀释方法图例:

（以500μL/管为例,也可根据实际用量来稀释,如200μL/管）

20

10

5

2.5

1.25

0.63

0.31

0

ng/mL

洗涤方法:

1.自动洗板机:

每孔加入洗涤液350μL,注入与吸出间隔60秒。

2.手工洗板:

甩尽孔内液体,在洁净的吸水纸上拍干,每孔加洗涤液350μL,浸泡1-2分钟,吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体,在厚的吸水纸上拍干。

操作步骤:

实验开始前,各试剂均应平衡至室温;试剂或样品配制时,均需充分混匀,并尽量避免起泡。

1.加样:

分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。

空白孔加样品稀释液100μL,余孔分别加标准品或待测样品100μL,注意不要有气泡,加样时将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。

给酶标板覆膜,37℃孵育90分钟。

为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体,甩干,不用洗涤。

每个孔中加入生物素化抗体工作液100μL（在使用前15分钟内配制）,酶标板加上覆膜,37℃温育1小时。

3.弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,大约350μL/每孔,甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。

4.每孔加酶结合物工作液（临用前15分钟内配制）100μL,加上覆膜,37℃温育30分钟。

5.弃去孔内液体,甩干,洗板5次,方法同步骤3。

6.每孔加底物溶液（TMB）100μL,酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右（根据实际显色情况酌情缩短或延长,但不可超过30分钟。

当标准孔出现明显梯度时,即可终止）。

7.每孔加终止液50μL,终止反应,此时蓝色立转黄色。

终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

8.立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值）。

应提前打开酶标仪电源,预热仪器,设置好检测程序。

9.实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。

注意事项:

1.保存:

试剂盒中各试剂请按说明书提示合理存放。

在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。

所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染,否则可能会出现错误的结果。

2.酶标板:

刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。

3.加样:

加样或加试剂时,第一个孔与最后一个孔的加样时间间隔如果太大,将会导致不同的”预温育”时间,从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。

每次的加样时间最好控制在10分钟内。

推荐设置复孔。

4.温育:

为防止样品蒸发,实验时必须给酶标板覆膜;洗板后应尽快进行下步操作,避免酶标板处于干燥状态;严格遵守给定的温育时间和温度。

5.洗涤:

洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸上拍干,勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。

在读数前要注意清除底部残留的液体和手指印,以免影响酶标仪读数。

6.试剂配制:

ConcentratedBiotinylatedDetectionAb及ConcentratedHRPConjugate体积较小,运输过程会使液体沾到管壁或瓶盖,因此使用前1000转/分离心1min,以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。

取用前,请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。

标准品、生物素化抗体工作液、酶结合物工作液请根据所需用量配制,并使用相应的稀释液配制,不能混淆。

请精确配制标准品及工作液,尽量不要微量配制（如吸取ConcentratedBiotinylatedDetectionAb时,一次不要小于10μL）,以避免由于不准确稀释而造成浓度误差;请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素化抗体工作液、酶结合物工作液。

若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装,将其放在-20～-80℃贮存。

避免重复冻融。

7.显色时间的控制:

加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如每隔5分钟）,如梯度已很明显,请提前加入终止液终止反应,避免颜色过深影响酶标仪读数。

8.底物:

底物请避光保存,在储存和温育时避免强光直接照射。

9.混匀:

充分轻微混匀对反应结果尤为重要,最好使用微量振荡器（使用最低频率）,如无微量振荡器,可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。

10.安全:

试验中请穿着实验服并带乳胶手套做好防护工作。

特别是检测血液或者其它体液标本时,请按国家生物试验室安全防护条例执行。

11.不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）

12.试验中所用的EP管和吸头均为一次性使用,严禁混用,否则将影响试验结果!

结果判断:

1.每个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图,如设置复孔,则应取其平均值计算。

以标准品的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,绘出标准曲线。

亦能够OD值为横坐标,标准品的浓度为纵坐标,绘出标准曲线。

2.推荐使用专业的曲线制作软件,如curveexpert1.3,在软件界面既可根据样品OD值,由标准曲线查出相应的浓度,乘以稀释倍数;亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

3.若标本OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测,