小鼠相关转录因子试剂盒说明书模板.docx

1、小鼠相关转录因子试剂盒说明书模板小鼠Runt相关转录因子2 (RUNX2)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书 产品编号: E-EL-M1030 ( 本试剂盒仅供体外研究使用、 不用于临床诊断!) 声明: 尊敬的客户, 感谢您选用本公司的产品。本产品选用世界著名生产厂家的原料, 采用专业ELISA kit生产技术制造。适用于体外定量检测小鼠血清、 血浆、 组织匀浆或细胞培养上清液中天然和重组RUNX2浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分! 如有疑问, 请及时联系伊莱瑞特生物科技有限公司。试剂盒组成: 名称-中文名称-英文规格保存条件ELISA酶标板Micro ELISA Plate 812

2、/ 86*4冻干标准品Reference Standard 2/ 1支*4标准品&样品稀释液Reference Standard & Sample Diluent 1瓶 20mL/12mL*4浓缩生物素化抗体 Concentrated Biotinylated Detection Ab 1支 120L/70L*4生物素化抗体稀释液 Diluent for Biotinylated Detection Ab 1瓶 10mL/6mL*4浓缩HRP酶结合物 Concentrated HRP Conjugate 1支 120L/70L*4(避光)酶结合物稀释液 Diluent for HRP Conj

3、ugate 1瓶 10mL/6mL* 4浓缩洗涤液( 25) Concentrated Wash Buffer ( 25) 1瓶 30mL/16mL*4底物溶液( TMB) Substrate Reagent 1瓶 10mL/6mL*4(避光)反应终止液 Stop Solution 1瓶 10mL/6mL*4封板覆膜Plate Sealer5/3张*产品说明书Product Description1份*: 96T/48T( 打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整) 检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗小鼠RUNX2抗体包被于酶标板上, 实验时标本或标准品中的RUNX2会与包被抗

4、体结合, 游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗小鼠RUNX2抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗小鼠RUNX2抗体与结合在包被抗体上的小鼠RUNX2结合、 生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物, 游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB), TMB在辣根过氧化物酶的催化下现蓝色, 加终止液后变黄。用酶标仪在450nm波长处测OD值, RUNX2浓度与OD450值之间呈正比, 经过绘制标准曲线求出标本中RUNX2的浓度。标本收集:1. 血清: 全血标本于室温放置2小时或4过夜后于1000g离心20分钟, 取上清即可检测, 收集血液的试管应为一次性的无热原, 无内毒素试管。2. 血浆: 抗凝剂

5、推荐使用EDTA.Na2, 标本采集后30分钟内于1000g离心15分钟, 取上清即可检测。避免使用溶血, 高血脂标本。3. 组织匀浆: 用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织, 以去除残留血液( 匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果) , 称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS( 一般按1:9的重量体积比, 比如1g的组织样本对应9mL的PBS, 具体体积可根据实验需要适当调整, 并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂) 加入玻璃匀浆器中, 于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞, 能够对匀浆液进行超声破碎, 或重复冻融。最后将匀浆液于5000g 离心510分钟,

6、取上清检测。4. 细胞培养上清: 取细胞培养上清于1000g离心20分钟, 除去杂质及细胞碎片。取上清检测。5. 其它生物标本: 1000g离心20分钟, 取上清即可检测( 具体处理方法可参考: ) 6. 标本应清澈透明, 悬浮物应离心去除。7. 标本收集后若不及时检测, 请按一次使用量分装, 冻存于-20/-80冰箱内, 避免重复冻融, 1-6月内检测,4保存的应在1周内进行检测。 8. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值, 请根据实际情况, 做适当倍数稀释(建议先做预实验, 以确定稀释倍数)。试验所需自备物品:1. 酶标仪(450nm波长滤光片)2. 高精度移液器, EP管及一次性吸

7、头: 0.5-10L, 2-20L, 20-200L, 200-1000L3. 37恒温箱, 双蒸水或去离子水4. 吸水纸检测前准备工作:1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒, 平衡至室温。2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶, 属于正常现象, 可用40水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液( 加热温度不要超过50, 使用时洗涤液应为室温) 。3. 标准品: 加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中, 静置10分钟, 待其充分溶解后, 轻轻混匀(浓度为20ng/mL)。然后根据需要进行倍比稀释( 注: 不要直接在反应孔中进行倍比

8、稀释) 。建议配制成以下浓度: 20、 10、 5、 2.5、 1.25、 0.63、 0.31、 0 ng/mL , 样品稀释液直接作为空白孔0ng/mL。如配制10ng/mL标准品: 取0.5mL 20ng/mL的上述标准品加入含有0.5mL样品稀释液的EP管中, 混匀即可, 其余浓度依此类推。4. 生物素化抗体工作液: 实验前计算当次实验所需用量( 以100L/孔计) , 实际配制时应多配制100-200L。使用前15分钟, 以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:100)成工作浓度。当日使用。5. 酶结合物工作液: 实验前计算当次实验所需用量( 以100L/孔计) , 实际配制时

9、应多配制 100-200L。使用前15分钟, 以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物(1:100)成工作浓度。当日使用。标准品稀释方法图例: (以500L/管为例, 也可根据实际用量来稀释, 如200L/管)20 10 5 2.5 1.250.630.310ng/mL洗涤方法:1. 自动洗板机: 每孔加入洗涤液350L, 注入与吸出间隔60秒。2. 手工洗板: 甩尽孔内液体, 在洁净的吸水纸上拍干, 每孔加洗涤液350L, 浸泡1-2分钟, 吸去( 不可触及板壁) 或甩掉酶标板内的液体, 在厚的吸水纸上拍干。操作步骤:实验开始前, 各试剂均应平衡至室温; 试剂或样品配制时, 均需充分混匀, 并

10、尽量避免起泡。1. 加样: 分别设空白孔、 标准孔、 待测样品孔。空白孔加样品稀释液100L, 余孔分别加标准品或待测样品100L, 注意不要有气泡, 加样时将样品加于酶标板底部, 尽量不触及孔壁, 轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜, 37孵育90分钟。为保证实验结果有效性, 每次实验请使用新的标准品溶液。2. 弃去液体, 甩干, 不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100L( 在使用前15分钟内配制) , 酶标板加上覆膜, 37温育1小时。3. 弃去孔内液体, 甩干, 洗板 3次, 每次浸泡1-2分钟, 大约350L/每孔, 甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。 4. 每孔加酶结合物工作液(

11、临用前15分钟内配制) 100L, 加上覆膜, 37温育30分钟。5. 弃去孔内液体, 甩干, 洗板5次, 方法同步骤3。6. 每孔加底物溶液(TMB)100L, 酶标板加上覆膜37避光孵育15分钟左右( 根据实际显色情况酌情缩短或延长, 但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时, 即可终止) 。7. 每孔加终止液50L, 终止反应, 此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。8. 立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度( OD值) 。应提前打开酶标仪电源, 预热仪器, 设置好检测程序。9. 实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。注意事项: 1.

12、 保存: 试剂盒中各试剂请按说明书提示合理存放。在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染, 否则可能会出现错误的结果。2. 酶标板: 刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质, 此为正常现象, 不会对实验结果造成任何影响。3. 加样: 加样或加试剂时, 第一个孔与最后一个孔的加样时间间隔如果太大, 将会导致不同的 ”预温育”时间, 从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。每次的加样时间最好控制在10分钟内。推荐设置复孔。4. 温育: 为防止样品蒸发, 实验时必须给酶标板覆膜; 洗板后应尽快进行下步操作, 避免酶标板处于干燥状态; 严格遵守给定的温育时间

13、和温度。5. 洗涤: 洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸上拍干, 勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。在读数前要注意清除底部残留的液体和手指印, 以免影响酶标仪读数。6. 试剂配制: Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate体积较小, 运输过程会使液体沾到管壁或瓶盖, 因此使用前1000转/分离心1min, 以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前, 请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。标准品、 生物素化抗体工作液、 酶结合物工作液请根据所需用量配制, 并使用相应的稀释液配制, 不能混淆。请精确配制标

14、准品及工作液, 尽量不要微量配制( 如吸取Concentrated Biotinylated Detection Ab时, 一次不要小于10L) , 以避免由于不准确稀释而造成浓度误差; 请勿重复使用已稀释过的标准品、 生物素化抗体工作液、 酶结合物工作液。若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装, 将其放在-20-80贮存。避免重复冻融。7. 显色时间的控制: 加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化( 比如每隔5分钟) , 如梯度已很明显, 请提前加入终止液终止反应, 避免颜色过深影响酶标仪读数。8. 底物: 底物请避光保存, 在储存和温育时避免强光直接照射。9. 混匀: 充分轻微混匀对反应结

15、果尤为重要, 最好使用微量振荡器(使用最低频率), 如无微量振荡器, 可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。10. 安全: 试验中请穿着实验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其它体液标本时, 请按国家生物试验室安全防护条例执行。11. 不同批号的试剂盒组份不能混用( 洗涤液和反应终止液除外) 12. 试验中所用的EP管和吸头均为一次性使用, 严禁混用, 否则将影响试验结果! 结果判断:1. 每个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图, 如设置复孔, 则应取其平均值计算。以标准品的浓度为横坐标, OD值为纵坐标, 绘出标准曲线。亦能够OD值为横坐标, 标准品的浓度为纵坐标, 绘出标准曲线。 2. 推荐使用专业的曲线制作软件, 如curve expert 1.3, 在软件界面既可根据样品OD值, 由标准曲线查出相应的浓度, 乘以稀释倍数; 亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程式, 计算出样品浓度, 再乘以稀释倍数, 即为样品的实际浓度。3. 若标本OD值高于标准曲线上限, 应适当稀释后重测,