dna扩增技术总结.docx

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dna扩增技术总结

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　　PCR实验技术总结点击次数：

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佚名发表于：

20XX-06-1520:

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　　来源：

互联网

　　PCR技术简史

　　一、PCR的最早设想

　　核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：

“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

　　二、PCR的实现

　　1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。

其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。

　　三、PCR的改进与完善

　　Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：

①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。

②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。

此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。

这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。

　　1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。

但每循环一次，仍需加入新酶。

　　1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌（thermusaquaticus）中提取到一种耐热DNA聚合酶。

此酶具有以下特点：

①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的XX%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的XX%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的XX%。

②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。

③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度（2.0Kb）。

由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。

为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别，将此酶命名为TaqDNA多聚酶（TaqDNAPolymerase）。

此酶的发现使PCR广泛的被应用。

　　PCR技术的基本原理

　　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由

　　变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

（一）模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

（二）模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

　　（三）引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

（Plateau）。

到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

　　PCR的反应动力学

　　PCR反应体系与反应条件

　　一、标准的PCR反应体系：

　　10×扩增缓冲液10ul

　　4种dNTP混合物各200umol/L

　　引物各10～100pmol

　　模板DNA0.1～2ug

　　TaqDNA聚合酶2.5u

l/L

　　加双或三蒸水至100ul

　　二、PCR反应五要素

　　参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

（一）引物

　　引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

　　设计引物应遵循以下原则：

　　1、引物长度：

15-30bp，常用为20bp左右。

　　2、引物扩增跨度：

以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

　　4、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

　　5、引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

　　6、引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

　　7、引物的特异性：

引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

引物量：

每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

（二）酶及其浓度

　　目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。

催化一典型的PCR反应约需酶量2。

5U（指总反应体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

　　（三）dNTP的质量与浓度

　　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。

dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。

HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。

多次冻融会使dNTP降解。

在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），思想汇报专题就会引起错配。

浓度过低又会降低PCR产物的产量。

dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

　　（四）模板（靶基因）核酸

　　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。

SDS的主要功能是：

溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。

提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。

一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原

　　体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。

RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

　　（五）Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。

Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

　　三、PCR反应条件的选择

　　PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

（一）温度与时间的设置

　　基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。

在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。

对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性）。

　　1、变性温度与时间

　　变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。

一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。

此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

　　2、退火（复性）温度与时间

　　退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。

变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。

由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的

　　篇二：

分子生物学技术总结

　　分子生物学技术总结

　　姓名：

梁潇班级：

2班学号：

1080800066

　　一、核酸/蛋白分离技术

　　1．DNA分离：

破碎细胞→抽提蛋白质→DNA沉淀→乙醇洗除盐→琼脂糖凝胶电泳检测用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入SDS破裂核膜，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA是上解离下来，经苯酚、氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀DNA，XX%乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后，溶解于TE缓冲液中即得到相对分子量高的DNA。

　　2．RNA分离：

抑制RNase→抽提去蛋白质→DNase消化DNA→甲醛变性琼脂糖凝胶电泳

　　3．蛋白分离：

（1）层析法

　　离子交换层析

　　亲和层析

（2）电泳分离：

聚丙烯酰胺凝胶电泳

　　聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应。

它有两种形式：

非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。

而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。

此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。

　　应用：

分离蛋白质和寡糖核苷酸

　　二、基因克隆技术

　　1．PCR：

在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促和反应，PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。

反应分为三步：

1）变性（92~95℃）2）退火3）延伸

　　PCR各步骤的目的

（1）预变性：

破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。

使DNA充分变性，减少DNA复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。

此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。

（2）变性--退火--延伸循环：

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

　　（3）PCR仪扩增循环后72度延伸10分钟：

用PCR仪扩增时,（变性.退火,延伸）循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：

①延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。

（当然是在反应体系一定的条件下）②根据延伸速率推得，扩增1kb以内的DNA片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。

通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使PCR反应完全以提高扩增产量③继续72度延伸了10分钟除了可以使PCR反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：

在用普通Taq酶进行PCR扩增时在