SDSPAGE.docx

SDSPAGE.docx

《SDSPAGE.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SDSPAGE.docx（8页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

SDSPAGE

SDS-PAGE

SDS-PAGE

当蛋白质的相对分子量在凝胶的分离范围之内时，蛋白质电泳迁移率mR与相对分子量Mr的对数呈线性关系，符合如下方程：

其中：

b为斜率,K为截距；在一定条件下b和K均为常数。

蛋白质电泳迁移率mR是用蛋白质条带的迁移距离除以溴酚蓝条带前沿的迁移距离得到的，即

如果凝胶厚度>1mm，由于染色、脱色和保存过程中，凝胶的膨胀或收缩将影响迁移率的变化，因此必须测量固定前和脱色后的凝胶的长度并按下式换算，以消除误差。

据此，可以将一系列已知Mr的标准蛋白质进行SDS—PAGE电泳分离，然后以每个已知Mr的标准蛋白质的电泳相对迁移率为横坐标，以Mr的对数为纵坐标作图得出蛋白质Mr的标准曲线。

同时将未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据电泳迁移率的测量计算结果，在标准曲线上求得相对分子量o

SDS—PAGE的优点：

简便、快速、重复性好；样品用量少，可同时测定多种样品的分子量；分辨率高：

蛋白质分离范围为10000-200000kU，可通过调节凝胶浓度来使蛋白质分离达到最佳效果。

几乎所有的蛋白质分析电泳都采用PAGE电泳。

SDS能确保蛋白质解离成单个多肽亚基，并尽可能减少亚基之间的相互聚集．因此如果蛋白质是由多亚基组成时，则SDS电泳所测得的蛋白质相对分子量为亚基的分子量而不是天然蛋白质的分子量。

蛋白质对考马斯亮蓝的吸附与蛋白质的量大致成正比，因此可以用考马斯亮蓝染料对电泳后的蛋白质条带进行染色。

蛋白质样品制备应注意保持低温以避免蛋白质降解或修饰，在合适的盐离子浓度条件下保持蛋白质的最大溶解度和可重复性。

[实验器材]

电泳仪、垂直板电泳槽、微量加样器、50ml烧杯两个、移液

枪等。

[药品试剂]

1．5×电泳缓冲液储存液（PH8．3）：

取Tris7．5g，甘氨酸36g，

SDS2．5g，加水溶解后定容为500ml。

使用前稀释5倍。

2．TEMED（四甲基乙二胺）。

3．30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液：

称取29．2g丙烯酰胺

和o．8g甲叉双丙烯配胺，加水溶解后定容至100ml，过滤备用，4℃

储存。

4．分离胶Tris缓冲液（pH8．8）：

1．5mol/LTris—HCl，调整PH

值为8．8。

5．浓缩胶Tria缓冲液（pH6．8）：

1mol/LTris—HCl，调整pH值

为6．8。

6．10％过硫酸铵溶液（新鲜配制），配置后的10%溶液可以在4℃储存一周。

7．10％SDS。

8．2x上样缓冲液：

将2m10．5Mol/LTris—HCl（PH6．8）、2ml甘

油、2ml20％SDS，0．5ml0．1％溴酚蓝、1ml巯基乙醇和双蒸水

2．5ml混合后，—20℃储存。

9．染色液；0.2g考马斯亮蓝R250充分溶解在84m195％乙醇

和20ML冰醋酸中，定容至200ML，过滤备用，室温保存。

10．0．1％SDS。

11．蛋白分子量标准液（商品化）：

根据需要选择合适的蛋白质

分子量标推溶液。

在蛋白质分子量标准溶液中混合已知分子量的多

种蛋白质成分。

12．待测混合蛋白质

[实验方法]

1．SDS-PAGE凝胶的制备：

（1）安装玻璃板：

将玻璃扳清洗干净，吹风机吹干或竖直自然晾

干。

将长玻璃板平放于桌面上，带玻璃侧条面向上。

把橡皮胶条沿

玻璃板侧缘和下缘放置好，然后将带凹槽的短玻璃扳放置其上。

将

安好的长短玻璃板配套镶嵌入配胶架上，凹槽玻璃板朝外，夹人斜楔

扳固定。

在长短玻璃板之间加入少量水，看是否有漏液情况。

如漏

液，需重新安装玻璃板。

如不漏液，则可将水倒空。

在玻璃板之间插

入梳子，在梳子下0.5—1cm处画线做标记。

再取出梳子，继续下述

步骤。

（2）配制分离胶：

按表3-8所示依次在烧杯中加入水、30％丙烯

酰胺溶液、PH8.8的1.5Mol/LTris-HCl缓冲液、10％SDS、10％过硫

酸铵，依次混匀后加入加速剂TEMED，迅速混匀并灌入两玻璃扳间，

直至标记处。

随后在凝胶液上加2ml0.1％SDS溶液覆盖．以避免

凝胶干燥。

常温聚合1小时左右。

室温低于20℃时，可将凝胶放人

37℃烘箱以加速聚合。

（3）配制浓缩放：

待分离胶凝固之后，可见胶面与表层溶液有清

晰分界面。

倾去表层的溶液．用滤纸吸干残余溶液，注意勿接触胶

面。

按表3-9所示依次在烧杯中加人水、30％丙烯酰胺溶液、pH6．8

的1mol/LTris-HCl缓冲液、10％SDS、10％过硫酸铵，依次混匀后加

入加速剂TEMED，迅速混匀并灌人两玻璃板间。

随后立刻在凝胶液

上插人梳子，梳子平的一侧面对长玻璃扳，注意避免插入气泡。

常温

聚合30分钟左右。

室温低于20℃时，可将凝胶放入37℃烘箱以加

速聚合。

（4）将凝固好的玻璃板从配胶架上取下来，轻轻取出梳子和橡

皮胶条，然后把带胶的玻璃板凹槽短玻璃板向内插入电泳槽架上，固

定。

并在玻璃板之间形成的内槽和外槽中加入电泳缓冲液，内槽液

面需淹没过玻璃板上缘，外槽液面需掩没过玻璃板下缘数厘米。

2．蛋白样品的处理：

取待测样品20µl，加入等量2×上样缓冲

液，95℃加热5分钟，取出冷却至室温。

‘3．上样：

用微量加祥器吸取蛋白分子量标准液和待测样品

20µl，分别加人梳孔中。

4．电泳：

加样完毕后，上槽接负极，下槽接正极，打开电泳仪，调整

电压至75v，恒压电泳15-20分钟直至样品中溴酚蓝带形成一条直

线，并且处于浓缩放和分离胶的分界线处。

调整电压至130v，恒压

电泳，直至溴酚蓝条带跑到距离凝胶底部约0.5cm处停止电泳。

5．染色：

取出玻璃板，用拨胶板小心。

撬开短玻璃板，并将浓缩胶

去掉，将分离胶部分置于平皿中，用直尺测量凝胶长度和溴酚蓝的迁

移距离并记录，然后加入适量考马斯亮蓝染色液淹没过胶面，置于摇

床上常温染色5小时以上。

6．脱色：

染色完毕后，倒出染色液，倒人脱色液常温脱色3—6小

时，其间更换脱色掖3—4次．直至凝胶的蓝色背景褪去，蛋白质区带

清晰为止。

用直尺测量凝胶脱色后的长度以及各蛋白样品带的迁移

距离。

7．蛋白相对分子量的计算：

首先计算各蛋白质的相对迁移率，然

后以各标液蛋白质样品的相对迁移率为横坐标，其相对分子质量的

对数为纵坐标，在半对数坐标纸上作图，绘制出一条标准曲线。

根据

待测蛋白质样品的相对迁移率的数值，可以直接从标推曲线上查得

蛋自质的Mr。

8．蛋白质浓度的估算：

将脱色后的凝胶进行照相或扫描。

用

Photoshop对不同浓度的BSA蛋白条带的灰度以及待测蛋白条带的

灰度进行量化计算，以BSA蛋白浓度为横坐标，灰度为纵坐标，在坐

标纸上做标准曲线，根据测算出的待测蛋白条带灰度，可以大致估算

出蛋白质的浓度。

[思考题1

1．SDS—PAGE法测蛋白质分子量和含量的优缺点各有哪些?

2．简述SDS—PAGE法的用途。