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色素上皮衍生因子（PEDF）在膀胱癌中表达及其对膀胱癌治疗作用研究

一、趋势判断和需求分析

国内外现状、水平和发展趋势（含知识产权状况和技术原则状况）；经济建设和社会发展需求；科学技术价值、特色和创新点。

膀胱癌是危及人类健康重大疾病，全世界范畴内记录其发病率占全身肿瘤第8位，在男性其原则发病率9.9/10万；在女性，其原则发病率为2.3/10万，占第25位。

死亡率在男性为4.2/10万，占全身肿瘤死亡率第9位，在女性为1.1/10万，占第16位。

在国内,膀胱癌也是泌尿外科最常用恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤3.2%，1995年，北京市城区膀胱癌发病率大概为7/10万人，上海市城区发病率为8.6/10万人[1]，且此后发病率仍有上升趋势。

作为危害人类健康常用恶性肿瘤，膀胱癌发病机制和治疗方面研究始终是临床基本研究重点之一。

当前膀胱癌治疗仍以手术切除为主，辅以膀胱灌注化疗和免疫治疗、全身化疗、放疗和生物治疗等办法，但这些治疗办法效果都不满意，重要是治疗后易复发，复发率高达80%，其中大概16%-25%复发肿瘤其恶性限度增长，有10%发展为浸润性或转移性癌，因而,寻找一种新、更有效生物治疗办法，是当前临床迫切需要解决问题。

在膀胱癌这些辅助性治疗办法中，无论是化疗还是免疫治疗，重要机制是通过直接杀死肿瘤细胞、阻断肿瘤细胞分裂或诱导细胞调亡方式来抑制肿瘤生长。

做为一种实体性肿瘤生长，肿瘤细胞增殖固然重要，而新生血管形成在肿瘤生长和复发、转移过程中也发挥非常重要作用。

在正常状态下，人体内脉管系统在血管生长因子和抑制因子网络式互相作用下处在平衡状态；病理状态下，特别是发生恶性肿瘤时，这种平衡向血管生成方向发展。

当肿瘤生长达到肿瘤组织超过2mm时就会有新生血管形成，如果没有新生血管生成，肿瘤生长明显受到抑制，甚至停止[2，3]。

抗血管生成疗法是不同于当前常规疗法新肿瘤治疗方略，具备高效低毒和不易产生耐药性特点[4]。

关于血管生长因子和血管生长抑制因子在肿瘤中所起作用，以及通过抗血管生成治疗肿瘤已经成为当前肿瘤研究一种热点。

近来研究发现，色素上皮衍生因子（pigmentepitheliumderivedfactor，PEDF）是一种对肿瘤有抑制作用细胞因子。

这种细胞因子是Tombran-Tink等在实验中发现，由人视网膜色素上皮细胞分泌一种蛋白质，分子量为50KD[5]，属于serpin卵白蛋白/PAT-2亚群，其基因全长16kb，位于染色体17p13.1-pter[6]。

多项研究表白，PEDF是一种天然高效新生血管抑制剂[7]，并通过诱导肿瘤细胞分化起到抑制肿瘤生长作用。

Tombran-Tink等将PEDF基因定位于染色体17p13.1,肿瘤发生与该区域关系密切，提示该基因也许是抑癌基因或肿瘤有关基因[5]。

对肿瘤细胞进行编码PEDF腺病毒转染，在血管内皮生长因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）存在状况下，PEDF明显制止了血管内皮细胞管腔形成和迁移。

对患有CNV/AMD患者体外实验也发现，PEDF大量减少状况下，内皮细胞有明显迁移;而对照组具有正常水平PEDF,则抑制了内皮细胞迁移[6]。

Crawford等发现PEDF在神经母细胞瘤中是肿瘤细胞分化调控重要抗血管生成抑制剂[7]。

肝癌患者血管增生和肿瘤发展中，PEDF作为VEGF拮抗因子，起到了抑制作用。

对裸小鼠在体实验以及鼠肺癌模型也同样证明了PEDF对肿瘤抑制作用。

其机制乃因PEDF减少肿瘤微血管密度，因而可被用于抑制肿瘤新生血管形成，从而抑制肿瘤生长，在肿瘤治疗前景上非常乐观[8]。

咱们近来对PEDF在膀胱癌中表达状况初步研究发现，PEDF在膀胱癌组织中表达明显低于正常膀胱组织，并且PEDF表达状况与膀胱癌恶性限度以及癌组织中微血管密度呈负有关，提示PEDF在膀胱癌发生、发展中具备一定作用，PEDF正常表达也许抑制膀胱癌细胞生长、增殖，PEDF有也许成为膀胱癌生物学治疗一种有效新办法。

当前国内、外尚未见此项研究有关报道。

因而咱们设想，扩大样本量，应用分子生物学技术检测膀胱癌组织及非癌膀胱组织中PEDF表达水平，进一步研究PEDF在膀胱癌中表达状况，并结合临床资料分析PEDF表达与膀胱癌分期、分级、转移及预后关系；通过研究膀胱癌组织中PEDF与VEGF表达有关性，PEDF与血小板反映素-1表达有关性，探讨膀癌组织中PEDF表达与肿瘤血管形成有关性及也许作用机制；通过研究PEDF表达与金属蛋白酶-9（MMP-9）有关性，探讨PEDF表达与膀胱癌浸润有关性；通过研究PEDF表达与已知对肿瘤生长有明确调节作用肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1α（IL-1α）、血栓调节蛋白（thrombomodulin）和白介素8（IL-8）等细胞因子表达有关性，探讨PEDF表达对膀癌细胞调节也许机制，从而探讨PEDF在膀胱癌发生、发展过程中也许作用机制；在此基本上，以连接有PEDF编码基因腺病毒载体转染膀胱癌细胞株、以PEDF蛋白治疗裸鼠膀胱癌模型，进一步探讨PEDF表达对膀胱癌细胞生长抑制作用以及对膀胱癌治疗效果,为膀胱癌生物学治疗摸索一种有效新办法。

参照文献

[2]吴阶平，吴阶平泌尿外科学，山东科学技术出版社，.5：

898-917

二、研究内容和技术核心

研究总体目的：

（1）研究PEDF表达与膀胱癌发生、分期、分级、转移及预后关系，探讨PEDF表达在膀胱癌发生、发展及转移过程中也许作用机制。

（2）研究PEDF对膀胱癌细胞治疗效果，为临床治疗膀胱癌生物治疗摸索一种新有效办法

研究创新点：

本课题研究内容和思路不同于以往其她研究，应用分子生物学办法从研究PEDF表达与膀胱癌发生、分期、分级、转移及预后关系入手，探讨PEDF表达在膀胱癌发生、发展和转移中也许作用机制。

在此基本上，以连接有PEDF编码基因腺病毒载体转染膀胱癌细胞株、以PEDF蛋白治疗裸鼠膀胱癌模型，探讨PEDF对膀胱癌治疗作用。

当前，本项研究国内、外尚未见报道。

本研究顺利完毕，将为膀胱癌生物学行为研究开辟了新途径，也将为膀胱癌生物学治疗摸索一种新有效办法。

研究重要内容：

（1）膀胱癌组织和非癌膀胱组织中PEDF和有关细胞因子表达检测及有关性研究：

应用分子生物学技术研究膀胱癌组织和非癌膀胱组织中PEDF表达状况，并检测VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-α、IL-1α、血栓调节蛋白（thrombomodulin）和IL-8表达状况；采用免疫组化技术检测膀胱癌组织和非癌膀胱组织中微血管密度（microvasculardensity，MVD），分析PEDF与VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-α、IL-1α、血栓调节蛋白和IL-8表达有关性，PEDF与MVD有关性；并结合临床资料分析研究PEDF表达与膀胱癌患者5年生存率之间关系；阐明PEDF表达与膀胱癌发生、分期、分级、转移及预后关系，探讨PEDF表达在膀胱癌发生、发展中也许机制。

（2）PEDF对膀胱癌细胞株治疗：

以连接有PEDF编码基因腺病毒载体转染膀胱癌细胞株,以空载转染膀胱癌细胞株作为对照，观测检测VEGF、TNF-α表达状况及膀胱癌细胞凋亡、增殖状况。

（3）PEDF对裸鼠膀胱癌模型治疗：

以人膀胱癌细胞种植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱癌模型。

以PEDF蛋白（购自吉泰生物科技有限公司）直接注射于裸鼠皮下肿瘤组织内作为治疗组，以未注射PEDF组为阴性对照组。

观测各组MVD、VEGF及肿瘤增殖状况，探讨PEDF表达在膀胱癌发生、发展中作用机制，评估PEDF对膀胱癌治疗效果，为进一步过度到临床应用提供根据。

需要解决技术核心：

（1）连接有PEDF编码基因腺病毒载体转染膀胱癌细胞株转染成功率。

（2）PEDF定量检测：

咱们已有对前列腺癌、肾癌、膀胱癌等组织标本PEDF定量分析基本，已形成较成熟技术条件、设备和研究经验。

（3）膀胱癌裸鼠模型构建。

咱们已有成功构建裸鼠膀胱癌和前列腺癌模型经验。

研究办法：

办法

（1）膀胱癌组织和非癌膀胱组织中PEDF和有关细胞因子表达检测及有关性研究：

实验组

对照组

标本

膀胱癌组织

非癌膀胱组织

A期

B期

C期

D期

癌旁膀胱组织

正常膀胱组织

炎性膀胱组织

例数

30

30

30

30

120

120

120

1．应用SYBRGreenI实时定量聚合酶链反映（real-timePCR）技术,对膀胱癌、非癌膀胱组织中PEDF进行定量测定。

2．Westernblot法检测VEGF、TSP-1、MMP-9。

3．ELISA法检测TNF-α、IL-1α、血栓调节蛋白、IL-8浓度。

4．免疫组化办法检测标本MVD。

5．整顿临床资料：

膀胱癌患者性别、年龄、组织病理、分期、分级、与否转移、5年生存率。

6．数据记录分析（使用SPSS记录分析软件）：

PEDF与VEGF表达有关性。

PEDF与TSP-1表达有关性

PEDF与MMP-9表达有关性

PEDF与TNF-α、IL-1α、血栓调节蛋白、IL-8浓度有关性。

PEDF与组织MVD有关性。

PEDF与膀胱癌分期有关性。

PEDF与膀胱癌恶性限度（分级）有关性。

PEDF与膀胱癌转移有关性。

PEDF与膀胱癌5年生存率有关性。

办法

（2）PEDF对膀胱癌细胞株治疗：

以连接有PEDF编码基因腺病毒载体转染膀胱癌细胞,以空载转染膀胱癌细胞作为对照，检测VEGF、TNF-α浓度，观测细胞增殖、凋亡状况，分析有关性。

1．以RT-PCR法扩增PEDF基因。

2．将扩增后PEDF基因连接入腺病毒载体，转染膀胱癌细胞。

并以空载转

染为对照。

3．Westernblot法检测VEGF、TSP-1、MMP-9表达。

4．观测膀胱癌细胞增殖、侵袭、凋亡状况。

5．记录分析。

办法（3）PEDF对裸鼠膀胱癌模型治疗：

以人膀胱癌细胞种植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱癌模型。

以PEDF蛋白直接注射于裸鼠皮下肿瘤内作为治疗组，以未注射PEDF为阴性对照组。

观测两组膀胱癌组织MVD、VEGF表达状况、肿瘤增殖状况，评价PEDF对膀胱癌治疗效果。

1．以人膀胱癌细胞种植于裸鼠皮下构建膀胱癌裸鼠模型。

2．将PEDF蛋白注射于裸鼠瘤体内。

3．应用免疫组化办法检测MVD；应用Westernblot法检测VEGF、TSP-1、MMP-9；观测肿瘤增殖、凋亡状况。

分析PEDF与VEGF互相作用关系及其对肿瘤生长作用机制。

技术路线：

（1）膀胱癌组织和非癌膀胱组织中PEDF及有关细胞因子表达检测及有关性研究：

膀胱癌标本

120例

癌旁膀胱组织标本120例

RT-PCR检测PEDFmRNA表达

Westernblot法检测VEGF、TSP-1、MMP-9

ELISA法检测TNF-α、IL-1α、血栓调节蛋白、IL-8浓度

免疫组化办法检测标本微血管密度（MVD）

结合临床资料，数据记录分析

正常膀胱组织标本120例

炎性膀胱组织标本120例

（2）PEDF对膀胱癌细胞株治疗：

将PEDF转染膀胱癌细胞株，检测VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-α浓度，观测肿瘤细胞增殖、凋亡状况。

RTPCR法扩增PEDF基因

连接入腺病毒载体

转染膀胱癌细胞株

空载体

观测细胞凋亡、增殖状况

ELISA法检测TNF-α

Westernblot法检测VEGF、TSP-1、MMP-9表达

成果分析

（3）PEDF对裸鼠膀胱癌模型治疗：

观测PEDF与VEGF、MVD有关性及其对膀胱癌细胞抑制作用

构建膀胱癌裸鼠模型

注射PEDF蛋白

观测微血管密度（MVD）

VEGF、TSP