多环芳烃实验作业指导书.docx
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多环芳烃实验作业指导书
作业指导书
页码：
第1页，共12页
文件编号：
JLQX-03-022
版次：
2016版，第0次修订
文件名称：
水质多环芳烃的测定液液萃取和固相萃取高效液相色谱法
发布日期：
2016年1月1日
水质多环芳烃的测定
1、方法依据
水质多环芳烃的测定液液萃取和固相萃取高效液相色谱法，HJ478-2009
2、适用范围
本标准规定了测定水中十六种多环芳烃的液液萃取和固相萃取高效液相色谱法。
本标准适用于饮用水、地下水、地表水、海水、工业废水及生活污水中十六种多环芳烃的测定。
十六种多环芳烃（PAHs）包括：
萘、苊、二氢苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、芁屈、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚并[1,2,3-cd]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[ghi]苝。
液液萃取法适用于饮用水、地下水、地表水、工业废水及生活污水中多环芳烃的测定。
当萃取样品体积为1L时，方法的检出限为0.002～0.016μg/L，测定下限为0.008～0.064μg/L，详见表A.1。
萃取样品体积为2L，浓缩样品至0.1ml，苯并[a]芘的检出限为0.0004μg/L，测定下限为0.0016μg/L。
固相萃取法适用于清洁水样中多环芳烃的测定。
当富集样品的体积为10L时，方法的检出限为0.0004～0.0016μg/L，测定下限为0.0016～0.0064μg/L，详见表A.2。
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第2页，共12页
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JLQX-03-022
版次：
2016版，第0次修订
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水质多环芳烃的测定液液萃取和固相萃取高效液相色谱法
发布日期：
2016年1月1日
3、测定原理
3.1液液萃取法
用正己烷或二氯甲烷萃取水中多环芳烃（PAHs），萃取液经硅胶或弗罗里硅土柱净化，用二氯甲烷和正己烷的混合溶剂洗脱，洗脱液浓缩后，用具有荧光/紫外检测器的高效液相色谱仪分离检测。
3.2固相萃取法
采用固相萃取技术富集水中多环芳烃（PAHs），用二氯甲烷洗脱，洗脱液浓缩后，用具有荧光/紫外检测器的高效液相色谱仪分离检测。
4、试剂
本标准所用试剂除另有注明外，均应为符合国家标准的分析纯化学试剂。
除非另有说明，本标准中所涉及的水均为不含有机物的蒸馏水。
4.1乙腈（CH3CN）：
液相色谱纯。
4.2甲醇（CH3OH）：
液相色谱纯。
4.3二氯甲烷（CH2Cl2）：
液相色谱纯。
4.4正己烷（C6H14）：
液相色谱纯。
4.5硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H2O）。
4.6无水硫酸钠（Na2SO4）：
在400℃下烘烤2h，冷却后，贮于磨口玻璃瓶中密封保存。
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JLQX-03-022
版次：
2016版，第0次修订
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水质多环芳烃的测定液液萃取和固相萃取高效液相色谱法
发布日期：
2016年月日
4.7氯化钠（NaCl）：
在400℃下烘烤2h，冷却后，贮于磨口玻璃瓶中密封保存。
4.8标准溶液
4.8.1多环芳烃标准贮备液：
质量浓度为200mg/L含十六种多环芳烃的乙腈溶液，包括萘、苊、二氢苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、芁屈、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚并[1,2,3-cd]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[ghi]苝。
贮备液于4℃以下冷藏。
4.8.2多环芳烃标准使用液：
取1.0ml多环芳烃标准贮备液于10ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，该溶液中含多环芳烃20.0mg/L。
在4℃以下冷藏。
4.8.3十氟联苯（Decafluorobiphenyl）：
纯度：
99%，样品萃取前加入，用于跟踪样品前处理的回收率。
4.8.4十氟联苯标准贮备溶液：
称取十氟联苯0.025g，准确到1mg，于25ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，该溶液中含十氟联苯1000μg/ml。
在4℃以下冷藏。
4.8.5十氟联苯标准使用溶液：
取1.0ml十氟联苯标准贮备溶液于25ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，该溶液中含十氟联苯40μg/ml。
在4℃以下冷藏。
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水质多环芳烃的测定液液萃取和固相萃取高效液相色谱法
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2016年月日
4.9淋洗液：
二氯甲烷/正己烷（1+1）混合溶液（体积分数）。
.10硅胶柱：
1000mg/6.0ml。
4.11弗罗里硅土柱：
1000mg/6.0ml。
4.12固相萃取柱：
C18，1000mg/6.0ml，或固相萃取圆盘等具有同等萃取性能的物品。
4.13玻璃棉或玻璃纤维滤纸：
在400℃加热1h，冷却后，贮于磨口玻璃瓶中密封保存。
4.14氮气，纯度≥99.999%，用于样品的干燥浓缩。
5、仪器和设备
5.1液相色谱仪（HPLC）：
具有可调波长紫外检测器或荧光检测器和梯度洗脱功能。
5.2色谱柱：
填料为5μmODS，柱长25cm，内径4.6mm的反相色谱柱或其他性能相近的色谱柱。
5.3采样瓶：
1L或2L具磨口塞的棕色玻璃细口瓶。
5.4分液漏斗：
2000ml，玻璃活塞不涂润滑油。
5.5浓缩装置：
旋转蒸发装置或K-D浓缩器、浓缩仪等性能相当的设备。
5.6液液萃取净化装置
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水质多环芳烃的测定液液萃取和固相萃取高效液相色谱法
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2016年月日
5.7自动固相萃取仪或固相萃取装置
固相萃取装置由固相萃取柱、分液漏斗、抽滤瓶和泵组成。
见图1。
5.8干燥柱：
长250mm，内径10mm，玻璃活塞不涂润滑油的玻璃柱。
在柱的下端，放入少量玻璃棉或玻璃纤维滤纸，加入10g无水硫酸钠。
5.9一般实验室常用仪器。
6、样品
6.1样品的采集：
样品必须采集在预先洗净烘干的采样瓶中，采样前不能用水样预洗采样瓶，以防止样品的沾染或吸附。
采样瓶要完全注满，不留气泡。
若水中有残余氯存在，要在每升水中加入80mg硫代硫酸钠除氯。
6.2样品的保存：
样品采集后应避光于4℃以下冷藏，在7d内萃取，萃取后的样品应避光于4℃以下冷藏，在40d内分析完毕。
7、分析步骤
7.1样品预处理
7.1.1液液萃取
7.1.1.1萃取：
摇匀水样，量取1000ml水样（萃取所用水样体积根据水质情况可适当增减），倒入2000ml的分液漏斗中，加入50μl十氟联苯，加入30g氯化钠，再加入50ml二氯甲烷或正己烷，振摇5min，静置分层，
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水质多环芳烃的测定液液萃取和固相萃取高效液相色谱法
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2016年月日
收集有机相，放入250ml接收瓶中，重复萃取两遍，合并有机相，加入无水硫酸钠至有流动的无水硫酸钠存在。
放置30min，脱水干燥。
7.1.1.2浓缩：
用浓缩装置浓缩至1ml，待净化。
如萃取液为二氯甲烷，浓缩至1ml，加入适量正己烷至5ml，重复此浓缩过程3次，最后浓缩至1ml，待净化。
7.1.1.3净化
饮用水和地下水的萃取液可不经过柱净化，转换溶剂至0.5ml直接进行HPLC分析。
地表水和其他萃取液的净化：
用1g硅胶柱或弗罗里硅土柱作为净化柱，将其固定在液液萃取净化装置上。
先用4ml淋洗液冲洗净化柱，再用10ml正己烷平衡净化柱（当2ml正己烷流过净化柱后，关闭活塞，使正己烷在柱中停留5min）。
将浓缩后的样品溶液加到柱上，再用约3ml正己烷分3次洗涤装样品的容器，将洗涤液一并加到柱上，弃去流出的溶剂。
被测定的样品吸附于柱上，用10ml二氯甲烷/正己烷（1+1）洗涤吸附有样品的净化柱，收集洗脱液于浓缩瓶中（当2ml洗脱液流过净化柱后关闭活塞，让洗脱液在柱中停留5min）。
浓缩至0.5～1.0ml，加入3ml乙腈，再浓缩至0.5ml以下，最后准确定容到0.5ml待测。
注1：
在萃取过程中出现乳化现象时，可采用搅动、离心、用玻璃棉过滤等方法破乳，也可采用冷冻的方法破乳。
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注2：
在样品分析时，若预处理过程中溶剂转换不完全（即有残存正己
烷或二氯甲烷），会出现保留时间漂移、峰变宽或双峰的现象。
7.1.2固相萃取
7.1.2.1将固相萃取C18柱安装在自动固相萃取仪上。
7.1.2.2活化柱子：
先用10ml二氯甲烷预洗C18柱，使溶剂流净。
接着用10ml甲醇分两次活化C18柱，再用10ml水分两次活化C18柱，在活化过程中，不要让柱子流干。
7.1.2.3样品的富集：
在1000ml水样（富集所用水样体积根据水质情况可适当增减）中加入5g氯化钠和10ml甲醇，加入50μl十氟联苯，混合均匀后以5ml/min的流速流过已活化好的C18柱。
7.1.2.4干燥：
用10ml水冲洗C18柱后，真空抽滤10min或用高纯氮气吹C18柱10min，使柱干燥。
7.1.2.5洗脱：
用5ml二氯甲烷洗脱浸泡C18柱，停留5min后，再用5ml二氯甲烷以2ml/min的速度洗脱C18柱，收集洗脱液。
7.1.2.6脱水：
先用10ml二氯甲烷预洗干燥柱，加入洗脱液后，再加2ml二氯甲烷洗柱，用浓缩瓶收集流出液。
浓缩至0.5～1.0ml，加入
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2016年月日
3ml乙腈，再浓缩至0.5ml以下，最后准确定容到0.5ml待测。
7.2色谱条件
7.2.1色谱条件Ⅰ
梯度洗脱程序：
65%乙腈+35%水，保持27min；以2.5%乙腈/min的增量至100%乙腈，保持至出峰完毕。
流动相流量：
1.2ml/min。
7.2.2色谱条件Ⅱ
梯度洗脱程序：
80%甲醇+20%水，保持20min；以1.2%甲醇/min的增量至95%甲醇+5%水，保持至出峰完毕。
流动相流量：
1.0ml/min。
7.2.3检测器
紫外检测器的波长：
254nm、220nm和295nm。
荧光检测器的波长：
激发波长λex为280nm，发射波长λem为340nm。
20min后λex为300nm，λem为400nm、430nm和500nm。
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序号
组分名称
最大紫外吸收波长
激发波长λex
发射波长λem
1
萘
219
275
350
2
苊
228
—
—
3
芴
210
275
350
4
二氢苊
225
275
350
5
菲
251
275
350
6
蒽
251
260
420
7
荧蒽
232
270
440
8
芘
238
270
440
9
芁屈
267
260
420
10
苯并[a]蒽
287
260
420
11
苯并[b]荧蒽
258
290
430
12
苯并[k]荧蒽
240
290
430
13
苯并[a]芘
295
290
430
14
二苯并[a,h]蒽
296
290
430
15
苯并[ghi]苝
210
290
430
16
茚并[1,2,3-cd]芘
251
250
500
注：
“—”表示荧光检测器不适用于苊的测定。
表1用紫外和荧光检测器检测多环芳烃时对应的波长单位：
nm
7.3标准曲线的绘制
7.3.1标准系列的制备
取一定量多环芳烃标准使用液和十氟联苯标准使用液于乙腈中，制备至少5个浓度点的标准系列，多环芳烃质量浓度分别为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μg/ml，贮存在棕色小瓶中，于冷暗处存放。
7.3.2初始标准曲线
通过自动进样器或样品定量环分别移取5种浓度的标准使用液10μl，注入液相色谱，得到各不同浓度的多环芳烃的色谱图。
以峰高或峰面积为纵坐
标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
标准曲线的相关系数＞0.999，否则重
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新绘制标准曲线。
7.3.3标准样品的色谱图
不同填料的色谱柱，化合物出峰的顺序有所不同。
图1为在本标准规定的色谱条件Ⅰ下，两种不同检测器串联的十六种多环芳烃标准色谱图。
图116种多环芳烃标样的紫外谱图
7.3.4连续校准
每个工作日应测定曲线中间点溶液，来检验标准曲线。
7.4样品的测定
取10μl待测样品注入高效液相色谱仪中。
记录色谱峰的保留时间和峰高（或峰面积）。
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7.5空白试验
在分析样品的同时，应做空白试验，即用蒸馏水代替水样，按与样品测定
相同步骤分析，检查分析过程中是否有污染。
8、结果计算
按式
（1）计算样品中多环芳烃的质量浓度
（1）
式中：
ρi——样品中组分i的质量浓度，μg/L；
〉xi——从标准曲线中查得组分i的质量浓度，mg/L；
V1——萃取液浓缩后的体积，μl；
V——水样体积，ml。
8、质量保证和质量控制
9.1空白测试
所有空白测试结果应低于方法检出限。
9.1.1试剂空白：
每批试剂均应分析试剂空白。
9.1.2空白试验：
每分析一批样品至少做一个空白试验。
9.2加标回收率控制范围
9.2.1空白加标：
各组分的回收率在60%～120%。
9.2.2十氟联苯：
回收率在50%～130%。
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2016年月日
9.3连续校准（曲线中间点检查）
连续校准的质量浓度为曲线中间点。
按式
（2）计算ρc与校准点ρi的相对偏差（D）：
（2）
式中：
D——ρc与校准点ρi的相对偏差，%；
ρi——校准点的质量浓度（如1.0mg/ml）；
ρc——测定的该校准点的质量浓度。
如果D≤10%，则初始标准曲线仍能继续使用；如果任何一个化合物的D＞10%，要查找原因，采取措施。
如果采取措施后不能找到问题根源，应绘制新的标准曲线。
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