大肠杆菌中胞外分泌N糖蛋白的生产.docx

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大肠杆菌中胞外分泌N糖蛋白的生产

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大肠杆菌中胞外分泌N糖蛋白的生产

AdamC.Fisher,1CharlesH.Haitjema,2‡CassandraGuarino,3,4‡EdaC¸elik,3‡ChristineE.Endicott,3‡

CraigA.Reading,1JudithH.Merritt,1A.CelestePtak,5ShengZhang,5andMatthewP.DeLisa2,3,4*

摘要

空肠弯曲菌（Campylobacterjejuni）的pgl基因组编码的一个完整的N蛋白糖基化的途径，这个途径能官能地移到大肠杆菌上去。

在这个系统中，我们分析N糖基化，细菌中膜迁移和受体蛋白折叠之间的相互作用。

我们开发了一个重组N–聚糖受体肽标签，允许不同的重组蛋白的N-糖基化，蛋白质在能糖基化大肠杆菌分子的周质中表达。

用这种糖基化标签，一个明显不同之处在糖基化模型中被观察到了，周质蛋白决定了内膜迁移的模型（i.e.,Sec，信号识别颗粒[SRP]，或双精氨酸迁移[TAT]导出），这种现象表明蛋白质导出方式可以影响N-糖基化效率。

我们也建立工程培养基蛋白定位到周质外的环境，比如外膜，膜囊，和细胞外培养基，这些可以作为N糖基化培养基。

两者合计，我们的结果表明，空肠弯曲菌N-糖基化的组织与大肠杆菌中的不同的分泌机制是亲和的，有效扩大重组大肠杆菌N–糖组。

此外，这个简单的糖基化标签策略扩大了糖工程工具箱和打开了细菌合成一大批重组糖蛋白结合物的大门。

前言

天冬酰胺连接（N连接）蛋白糖基化是至关重要的且保留在真核生物有机体中。

它是最普遍的所有蛋白质翻译后修饰，影响到近70%的真核蛋白质组。

结合到真核分泌和膜蛋白上的聚糖附属物可影响蛋白的折叠和稳定性，齐聚，抗水解，排序，和运输。

N-连接的糖基化发生在内质网（ER）中且涉及到内质网膜脂质载体上多糖的装配,其次是转移到特定的天冬酰胺残留的目标多肽上。

最初，N–连接糖基化只发生在真核生物中。

然而，N-糖蛋白现在已经被描述到生活的所有领域，包括古菌和最近的细菌，其中最具特征的例子是人类胃肠菌空肠弯曲菌（Campylobacterjejuni）。

在空肠弯曲菌中，参与这个途径的基因组包括一个17-kb命名为pgl的蛋白糖基化基因。

迄今，超过40种周质和膜糖蛋白已被确定为空肠弯曲菌，且大多数这些绑定到N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）-特效血凝大豆凝集素（SBA）。

质谱和核磁共振共振（NMR）的研究显示，N连接聚糖就是GlcGalNAc5Bac，这里Bac是细菌糖胺（2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧葡萄糖）。

这个分支七糖通过按次序添加在脂质载体上的激活核苷酸糖以及细胞质内膜表面的十一碳烯焦磷酸酯来合成。

一旦装配完，脂连的七糖通过假定的ATP结合盒（ABC）运输人PglK快速翻转通过膜。

七糖通过一种叫PglB的寡糖传输酶（OST）催化转移到了周质培养基蛋白上。

PglB是单个完整的膜蛋白，和催化真核亚基OSTSTT3有明显的顺序相似性。

PglB把七糖固定在天冬酰胺酸上，以D/E-X1-N-X2-S/T为基本图案（在这里X1，X2是除脯氨酸外的任意残基），一种相似于真核细胞糖基化位点的位点。

近期Wacker和合作者把整段空肠弯曲菌（C.jejuni）pgl基因转移到大肠杆菌上，赋予这些分子使蛋白质糖基化的能力。

天然空肠弯曲菌（C.jejuni）糖蛋白例如Peb3和AcrA能通过Sec途径定位到周质，在具有糖基化能力的大肠杆菌中N糖基化。

AcrA通过双精氨酸转运途径（Tat）运输时也能N糖基化，Tat途径因为能通过内膜导出折叠蛋白的能力而众所周知。

除了周质蛋白，一些天然空肠弯曲菌（C.jejuni）N-糖蛋白基于生物信息分析被预测为完整的膜蛋白。

共同的，这些早期的研究表明空肠弯曲菌（C.jejuni）N-连接糖蛋白组织与不同的分泌机理亲和，能容忍从不折叠多肽到完整折叠蛋白域（虽然高度复杂且溶剂暴露）。

然而受到膜迁移和细菌上受体蛋白折叠的影响，糖基化还没有被完全完成。

定位到周质外的蛋白，例如外膜或细胞外培养基是否与N糖基化亲和还不知道。

因此，本文的目的在于研究不同分泌和细胞外蛋白培养基在带有pgl基因大肠杆菌分子中N糖基化的程度。

为了解决这个问题，我们开发了一种基因编码N聚糖受体多肽标签（GT），它能附加在末端或植入重组蛋白内部位置。

许多用GT来修饰的重组蛋白在表达pgl基因的大肠杆菌菌株中可靠地被糖基化了。

当GT被用来和通过不同输出途径（e.g.,Sec,信号识别颗粒[SRP]，或Tat）定位到周质上的蛋白质结合时，我们发现这些蛋白质在糖基化模型中的一个明显不同之处，这取决于他们在内膜上迁移的模式。

在所有测试的事例中，通过GT的N聚糖附属物没有对蛋白质活性产生任何可测量的影响。

最后我们发现定位到不同位点的蛋白质是很容易被N糖基化的，这些位点包括周质，外膜，膜囊和细胞外培养基。

材料和方法

细菌菌种和生长条件所有这个研究用到的菌种都在表1中列举了。

大肠杆菌DH5α用作质粒的克隆，大肠杆菌菌株CLM24（16）用在所有糖蛋白表达实验中除非特别标记。

由于分子表面糖蛋白的标记，大肠杆菌菌株BW25113∆waaL:

:

Kan被使用（3）。

为了外膜膜囊的准备，大肠杆菌菌株CE8032通过P1vir噬菌体的转导来生产。

简单来讲，卡那霉素标记的等位基因能在受体分子JC8031中转导，其中JC8031是一种有很多小泡的tolRA的突变菌株，等位基因能从BW25113∆waaL:

:

Kan中得到。

由于YebF影响分泌研究，MC4100菌株由于有最小的麦芽糖结合蛋白（MBP）漏损率而被使用，其中有15个普通的大肠杆菌菌株被测试，其中一个衍生菌株在它早期成长阶段没有MBP漏损率。

晚上大肠杆菌要用新鲜的Luria-Bertani（LB）培养基来稀释，再加抗生素和0.2%葡萄糖，在30℃或37℃下培养。

在对数中期时（光密度在600nm），培养基换成了没有葡萄糖且含有抗生素的LB溶液，蛋白质的表达受到100µM异丙基-β-D-硫代半乳糖-吡喃糖苷（IPTG）pTrc99A-基质表达载体或0.2%阿拉伯糖pBAD基质表达载体的诱导。

诱导反应在25℃或30℃下持续24h。

抗菌素用以下浓度：

100μg/ml氨苄青霉素（Amp），25μg/ml氯霉素（Cm）,和50μg/mlKan。

质粒构造质粒pTrc-GT-6Х-His是以植入合成的DNA来克隆的，该DNA编码GT（集成DNA技术［IDT］）和一个在XbaI和HindIIIpTRC99A之间的六—His（6Х-His）主题。

DNA编码malE,∆spmalE

（在那sp代表信号顺序/多肽），sptorA-malE,spdsbA-malE和spmalE被分别植入到SacI和XhoIof

pTrc-GT-6Х-His来制造pTrc-MBP-GT,pTrc-∆spMBP-GT,pTrc-spTorA-MBP-GT,pTrc-spDsbA-MBP-GT,和pTrc-spMBP-GT。

编码∆spmalE的DNA被克隆进pTrc-spMBP-GT的SalI位点来制造pTrc-spMBP-GT-MBP。

编码GT-MBP的DNA然后被克隆回SacI和AfeI位点的pTrc-MBP-GT来制造pTrc-spMBP-GT-MBP-GT。

编码Top7的DNA被克隆进pTrc-spDsbA-MBP-GT的XbaI和XhoI位点来制造pTrc-spDsbA-TOP7-GT。

编码sptorA-gfpmut2的DNA被克隆进pTrc-GT-6Х-His的SacI和BamHI位点来制造pTrc-spTorA-GFP-GT。

编码26.10IgG重链和轻链双版本的DNA通过pMAZ360-26.10的PCR扩大来得到且通过AvrII和SpeI消化。

PCR产品被克隆进pTrc-spDsbA-TOP7-GT，pTrc-spDsbA-TOP7-GT已经被XbaI和SpeI切断来移动Top7编码的基因。

最终的质粒是pTrc-spDsbA-26.10LC-spPelB-26.10HC-GT，表达带有DsbA信号肽的轻链，带有PelB信号肽的重链和一个C-终点的GT。

pTrc-spDsbA-Fc质粒通过克隆人类IgG1的Fc区变成pTrc-spDsbA-MBP-GT的XbaI和HindIII来制造。

pTrc-spDsbA-FcDQNAT质粒也用相同的方法来制造，除了Fc基因，Fc基因编码Q295D,Y296Q和S298A的点突变且通过在Saccharomyces

Cerevisiae中的同性质重组克隆进pMQ70（49）然后克隆进pTrc-spDsbA-MBP-GT的XbaI和HindIII位点。

质粒pBAD18-CjaA通过放大来自C.jejuni的cjaA基因来制造（由BrendanWren提供）。

cjaA的PCR放大在质粒pBAD18的NcoI和NotI位点被克隆，包括在NotI和PsiI之间的旗表位末端。

质粒pBAD24-OmpX-GT通过植入在质粒pBAD24-OmpX*-HisKpnI和SpeI位点的GT顺序来制造（在这里*表示一个OmpX的突变形式，OmpX包含包含一个植入多肽到loop2的克隆位点）这样的GT多肽末端定位在丝氨酸残基OmpX的细胞loop2外的53和54号位。

这跨膜循环能够容忍短肽插入不影响Ompx表面表达（44）。

一个在KpnI和SpeI位点侧面的GQSGQ键也被产生了。

一双顺反子结构的共表达OmpX-GT和PglB的是由放大pglB从空肠弯曲杆菌的基因组DNA，并插入得到的PCR之间的产品XbaI和SBFI的质粒pBAD24。

接下来，OmpX-GTNcoⅠ位和XmaⅠ之间插入在相同的质粒，但用其自己的核糖体结合位点相同的一个上游的pglB。

质粒pBAD18-ClyA-GT构建成pTrc-GT-6Х-His通过第一插入的PCR-amplifiedclyA基因-His的SacI和XhoI位之间。

整个ClyA-GT-6Х-His，它的结构是通过PCR扩增和插入之间的SacI和HindIII位点在pBAD18。

YebF质粒pTrc99A的衍生物。

对于这些，E.大肠杆菌一套YebFPCR扩增并克隆在pTrc99A的SacⅠ和XbaⅠ位之间。

对照组同样由克隆YebF的N-末端信号肽（spYebF）或构造运用于大肠杆菌表现系统的YebF缺乏成熟的域的N-末端信号肽（∆spYebF）SacI和XbaI位于pTrc99A上。

GT或MBP-GT的融合，再加入每个YebFXbaⅠ和SalⅠ位点之间，SalⅠ和HindⅢ位点之间插入。

本研究质粒的序列的所有构建的DNA测序被证实。

工程蛋白质溶液内消化在溶液中消化MBP-GT进行如前所述（63）无还原和烷基化反应。

A蛋白样品（200克）溶解在总量为100升变性溶液含有6.0MHCl和50毫摩尔Tris，pH值为8.0，并孵育在56℃下为45分钟。

样品1:

5稀释于50mM乙酸铵碳酸氢盐，pH值7.8。

然后，以10克胰蛋白酶（Promega）或1克的lysC（西格玛）被添加到的MBP-GT或ACRA-4（ACRA含有四种可能的糖基化位点）的溶液，分别在的酶-底物的比率为1:

20（重量/重量）。

蒸煮16小时在37℃下进行，并停止通过加法为0.5％（体积/体积）的三氟乙酸（TFA）。

摘要脱盐固相萃取使用的是9月包装盒（Waters公司），并洗脱的胰蛋白酶肽，蒸发至干，用SpeedVac离心SC110。

将样品重新溶解在200升含0.1％甲酸的用2％乙腈得到20pmol/μl的储备液。

纳米喷射的质谱分析MBP-GT进行了分析，输注纳升电质谱（MS）分析如下。

酶分析在2p