药品微生物检验常见问题.docx

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问：

沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）上

会不会生长细菌？

答：

SDA不是选择性培养基，而是一种广谱的增菌培养基，pH范围5.4-5.8，某些细菌是可以在SDA上生长的，霉菌和酵母菌总数计数时SDA上生长的菌均应计入霉菌和酵母菌总数；或者可以经过评估选择含有抗生素（如氯霉素）的SDA或者玫瑰红钠琼脂培养基进行霉菌和酵母菌总数计数。

问：

琼脂培养基为什么需要倒置培养？

答：

在进行微生物培养时，若正置培养，琼脂培养基中的水分易蒸发使平板干裂，不利于微生物的生长；同时水蒸汽会在平皿盖上形成冷凝水，若回落在培养基表面，会使菌落蔓延生长，无法计数，若冷凝水太多会使培养基与平皿分离，容易滑动倒置培养可减少培养基表面的空气流动，减慢培养基中水分蒸发的速度，充分维持弹性，有利于菌株的生长和繁殖，防止空气中杂菌对培养基及培养物造成污染；也会由于重力作用在一定程度上使营养物质沉积到培养基表面，有利于微生物利用营养物质；倒置的平板方便拿取，避免环境中杂菌的污染。

中国药典2015版1105中关于平皿法（倾注法）有明确要求。

需要注意的是，《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》（GB4789.15-2016）是要求正置培养，而非倒置，以防霉菌孢子形成次生菌落，影响计数结果。

问：

中国药典2015版要求霉菌和酵母菌平皿计数时培养5-7天，那么培养5天可以么？

答：

微生物限度检查中霉菌和酵母菌培养时间5-7天，因不同的霉菌酵母菌生长特性不同，所以具体培养时间，由企业根据各自情况（基于风险评估）自行确定。

问：

中国药典2015版要求霉菌和酵母菌平皿计数时培养5-7天，该如何计数？

答：

但是在实际操作中，我们会发现如果样品中存在霉菌，培养到第5-7天时，可能菌落之间已经融合，并蔓延生长至整个平皿，此时的霉菌已经无法计数。

建议霉菌和酵母菌检测时，第三天计一次数，培养结束时计一次数，比较两组数据，以多者为最终结果。

霉菌和酵母菌检测培养过程中，避免频繁取拿观察，尽量避免振动等，防止孢子扩散。

问：

药企的环境检测应该依据那个标准？

答：

关于环境检测，2015版《中国药典》的9205和GB/T16294-2010《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》都有规定，且一些细节略有差别。

其中国标的规定更为具体，建议实际操作中以国标为准，药典可以做为参考。

问：

一些不常用的培养基开瓶后在效期内较长时间没有用完，那么这些开瓶后的培养基需要进行复验吗？

答：

开瓶后的培养基，如果长时间不使用，还在效期内，建议开瓶后间隔1年进行复验。

如果出现结块，则不能使用。

同理，如果同一批次一次购买量较多，一年内未使用完，也建议进行复检。

问：

薄膜过滤法，滤膜边缘长了一圈菌，原因有哪些？

答：

出现这个现象，可能的原因（常见）包括以下三个方面：

（1）滤杯：

无论是一次性的滤杯还是反复灭菌的滤杯，理论上都是无菌的，但是不排除滤杯灭菌不彻底和使用时操作人员与滤杯底部接触，污染滤杯的可能。

（2）微限仪的滤头：

微限仪滤头如果在更换滤膜的过程中灭菌不彻底，上一个样品可能会污染下一批滤膜，如果微限仪长时间不灭菌，或使用的滤膜破损，都可能使微限仪内部管道带菌，在泵开启的瞬间形成气溶胶，污染滤头。

（3）转移过程中被污染：

在滤膜由滤头转移至平皿的过程中，镊子灭菌不彻底，操作者手不稳使滤膜和仪器，台面，平皿，身体发生过接触。

具体问题具体分析，如果出现这样的问题，需要根据实验室的实际情况具体分析。

问：

控制菌检查法中用到的培养基，在做培养基适用性的时候，其中有“指示特性”的表述，那么“指示特性”是指的什么意思？

答：

培养基指示特性包括菌落大小、形态特征、指示剂反应情况（菌落颜色变化）等。

例如大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂培养基上桃红色菌落有沉淀环、乙型副伤寒沙门菌在XLD有黑心等。

问：

无菌检查法用到的培养基（FTM和TSB）进行培养基适用性检查的时候需不需要使用对照培养基？

答：

在2015版《中国药典》无菌检查法通则1101中，并没有强制规定灵敏度检查需要使用对照培养基，所以不使用对照培养基也是可以的。

但是国家有FTM和TSB的对照培养基，建议在做FTM和TSB的培养基适用性时，使用对照培养基进行参比。

问：

生孢梭菌如何计数？

答：

（1）使用用硫乙醇酸盐流体培养基，在培养16-18小时这个时间进行观察，计数，计数前不要摇晃，培养时间太长，培养基将浑浊，点计不清；

（2） 使用哥伦比亚琼脂培养基，浇注或涂布后，置厌氧罐（袋）里，再置培养箱培养，计数。

问：

无菌检查法中，为什么培养基灵敏度检查用了铜绿假单胞菌，而方法适用性以大肠埃希菌为验证菌株？

答：

我国是抗生素及注射剂生产使用大国，铜绿假单胞菌为假单胞菌属菌种，对很多抗生素都天然耐药，药物敏感度不高，不适合做方法适用性。

但假单胞菌属的细菌对培养体系的营养要求高，所以适合做培养基适用性检查。

问：

什么是不可接受微生物？

答：

不可接受微生物通常是指那些已知有明显致病性的，存在足够的数量，通过产品的给药途径可能导致患者不可接受风险的微生物。

如何确定一种微生物是不可接受的，需要进行风险分析，包括微生物负载量、微生物特性、产品特性、给药途径、对患者潜在影响等。

问：

 培养基灭菌没有按照厂家提供的灭菌

参数进行，是否可行？

答：

可以。

厂家产品说明书提供的灭菌参数可作为参考使用，使用单位也可以根据自己实验室的实际情况，在相关法规要求内，使用自己验证过的灭菌参数来执行。

问：

草酸钾兔血浆和兔血浆的用途分别是什么？

答：

草酸钾兔血浆用于溶血性链球菌链激酶试验，致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶（即溶纤维蛋白酶），此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原，使生成血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。

此实验乙型溶血性链球菌阳性，金黄色葡萄球菌阴性。

兔血浆用于金黄色葡萄球菌的血浆凝固酶试验。

细菌生成血浆凝固酶后释放于血浆中，称为游离凝固酶，不直接作用到血浆纤维蛋白原上，而是被血浆中的致活剂（即凝固酶致活因子）激活后变成耐热的凝固酶样物质，此物质纤维蛋白原变为固态纤维蛋白，血浆因而凝固。

致病性葡萄球菌能产生凝固酶，例金黄色葡萄球菌阳性，表皮葡萄球菌阴性。

问：

革兰氏染色有哪些注意事项？

答：

（1）最好挑选18-24h的菌落进行革兰氏染色,培养时间过久的的革兰氏阳性细菌可能会被染成红色而造成假阴性。

（2）挑取适量的菌，不宜过多,均匀涂开。

（3）乙醇脱色是革兰氏染色是否成功的关键,15-30s为宜，脱色不够可能会造成假阳性,脱色过度可能会造成假阴性。

问：

如何根据实验需要制备斜面？

答：

根据实验需求，摆放斜面一般有三种形式：

（1）长斜面：

斜面底部刚覆盖试管底部，上部距管口2.5-3cm左右；例如TSA传代斜面。

（2）高层斜面：

斜面与底层高度约为2:

3，即底部高约3cm，斜面长度约2cm；如三糖铁高层斜面。

（3）普通斜面：

斜面底部距试管底部约1cm，上部距管口约2.5-3cm。

问：

三糖铁培养基颜色变化原理是什么？

答：

该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:

10:

1，只能利用葡萄糖的细菌，分解葡萄糖产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。

而发酵乳糖的细菌则产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。

如菌种接至培养基培养后产生黑色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。

问：

如果三糖铁上斜面红色、底层黄色，中间有黑色且产气，能否判定为沙门菌？

答：

不能。

某些非沙门菌也能在三糖铁上呈现和沙门菌一样的颜色变化，例如奇异变形杆菌。

如三糖铁上有上述颜色变化，需要进一步的进行适宜的鉴定试验，确证是否为沙门菌。

如果采用传统的生化鉴定，可参考GB4789.4-2016中沙门氏菌检验的方法。

问：

按照中国药典2015版1106控制菌检查法检测大肠埃希氏菌，如果麦康凯琼脂上有疑似菌，如何用传统方法确证？

答：

挑选疑似菌分离、纯化。

（1）革兰氏染色：

革兰氏阴性无芽孢杆菌；

（2）乳糖发酵试验：

产酸产气或产酸不产气；

（3）IMVIC试验结果：

++--或-+--；

判定检出大肠埃希氏菌。

问：

按照中国药典2015版1106控制菌检查法检测铜绿假单胞菌时，溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基中加入甘油的作用是什么？

答：

作为碳源补充，有利于绿脓菌素的生成。