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病理论文

PGE2通过EP2受体激活cAMP-PKA-CREB信号通路上调SnoN的表达而促进CCLP1细胞的增殖

黄文勇1，张丽1，束为2，彭韬1，张海1，马娟1，白小明1，冷静1*

（1南京医科大学生殖医学重点实验室，肿瘤中心，病理学系，2南京医科大学口腔医学研究所，南京医科大学附属口腔医院牙周科，江苏南京210029）

[摘要]目的：

探讨PGE2对人胆管上皮癌细胞CCLP1增殖能力影响的作用机制。

方法：

用PGE2、EP1-4四种受体激动剂、AC激动剂Forskolin、PKA抑制剂H89、cAMP拟似物dbcAMP处理CCLP1细胞，通过RT-PCR、Westernblot、WST等实验检测SnoNmRNA、SnoN蛋白表达量以及CCLP1细胞增殖能力的变化。

结果：

1μM、5μM、10μM、20μMPGE2处理CCLP1细胞24h后，细胞中SnoN蛋白的表达水平分别上升了13.4%、24.5%、35.6%、23.5%（P<0.05），10μMPGE2处理CCLP1细胞24h后，SnoNmRNA的表达水平与对照组相比上升了22.5%（P<0.01）；10μMEP2受体激动剂处理CCLP1细胞24h后，细胞中SnoN蛋白的表达水平与对照组相比上升了64.9%（P<0.05），细胞增殖能力上升了26.5%，而10μMEP1、EP3、EP4受体激动剂处理CCLP1细胞24h后，SnoN蛋白的表达水平与对照组相比分别上升了35.6%、29.6%、24.9%（P<0.05），细胞增殖能力也分别上升了12.5%、16.9%、30.2%；10μMAC激动剂Forskolin处理CCLP1细胞24h后，SnoN蛋白的表达水平及CREB蛋白的磷酸化水平较对照组分别上升了25.1%、71.3%，1μM、5μM、10μMForskolin处理CCLP1细胞24小时后细胞增殖能力也分别上升了2.7%、3.6%、4.4%；用500μMcAMP拟似物dbcAMP处理CCLP1细胞24小时后SnoN蛋白的表达水平较对照组上升了90.1%（P<0.05）；而用PKA抑制剂H89阻断Forskolin的作用后，SnoN蛋白的表达水平和CREB蛋白的磷酸化水平较Forskolin处理组分别下降了9.1%、14.1%，1μM、5μM、10μM、20μMH89分别处理CCLP1细胞后，细胞增殖能力较对照组分别下降了2.7%、9.1%、27.1%、45.7%，差异均有统计学意义。

结论：

PGE2可通过EP2受体激活cAMP-PKA-CREB信号转导通路上调CCLP1细胞SnoN的表达，从而促进CCLP1细胞的增殖。

[关键词]胆管上皮癌；PGE2；EP2受体；SnoN；cAMP-PKA-CREB

ProstaglandinE2promotesthecellprolifelationabilityofCCLP1throughEP2prostanoidreceptorwhichincreasedtheexpressionofSnoNbyactivationofcAMP-PKA-CREBpathway

HUANGWenYong1,ZHANGLi1,SHUWei2,PENGTao1,ZHANGHai1,MAJuan1,BAIXiao-Ming1,LENGJing1*

（1LaboratoryofReproductiveMedicine,Cancercenter,DepartmentofPathology,NanjingMedicalUniversity,2InstitueOFstomatoloy,NANJINGMedicalUniversityDepartmentofperiodortology,SchoolOfStomatology,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China）

[Abstract]Objective:

ToexploretheMechanismofProstaglandinE2affectsthecellprolifelationabilityofhumanBileductcarcinomacellsCCLP1.Methods:

CCLP1cellsweretreatedwithPGE2,EP1-4receptoragonist,ACagonistForskolin,PKAantagonistH89,cAMPanaloguesdbcAMP.ThelevelsofSnoNmRNA，SnoNproteinexpressionandthecellprolifelationabilitywereexaminedbyRT-PCR,WesternblotandWSTinCCLP1cells.Results:

TheexpressionofSnoNinCCLP1cellswereincreasedby13.4%、24.5%、35.6%、23.5%（P<0.05）aftertreatedwith1μM、5μM、10μM、20μMPGE2for24hrespectively,andtheexpressionofSnoNmRNAinCCLP1cellswereincreasedby22.5%（P<0.01）aftertreatedwithPGE2（10μmol/L）for24h；TheexpressionofSnoNinCCLP1cellswereincreasedby64.9%（P<0.05）aftertreatedwithEP2receptoragonist（10μmol/L）for24h,andthecellprolifelationabilityofCCLP1wereincreasedby26.5%，butjustincreasedby35.6%、29.6%、24.9%（P<0.05）aftertreatedwithEP1、EP3、EP4（10μmol/L）receptoragonistfor24h，andthecellprolifelationabilityofCCLP1wereincreasedby12.5%、16.9%、30.2%respectively；ThelevelsofSnoNexpressionandCREBphosphorylationinCCLP1cellswereincreasedby25.1%、71.3%（P<0.05）comparedwiththecontrolgroupaftertreatedwithACagonistForskolin（10μmol/L）for24h,andthecellprolifelationabilityofCCLP1wereincreasedby2.7%、3.6%、4.4%（P<0.05）aftertreatedwith1μM、5μM、10μMForskolinrespectively；TheexpressionofSnoNinCCLP1cellswereincreasedby90.1%（P<0.05）whenwetreatedwithcAMPanaloguesdbcAMP（500μmol/L）for24h,butwhenwetreatedthecellwithPKAantagonistH89（10μmol/L）for24h,thelevelsofSnoNexpressionandCREBphosphorylationinCCLP1cellsweredecreasedby9.1%、14.1%（P<0.05）comparedwiththeForskolintreatedgroup.andthecellprolifelationabilityofCCLP1weredecreasedby2.7%、9.1%、27.1%、45.7%（P<0.05）aftertreatedwith1μM、5μM、10μM、20μMH89respectively.Conclusion:

OurfindingssuggestedthatPGE2mightup-regulatetheexpressionlevelofSnoNthroughEP2receptorofCCLP1cellswhichcouldbepartlyrelatedtothecAMP-PKA-CREBSignalConductionPathway,andthenpromotesthecellprolifelationabilityofCCLP1.

[Keywords]Bileductcarcinoma;PGE2;EPprostanoidreceptor;SnoN;cAMP-PKA-CREB

肝癌是我国的高发肿瘤之一，五年生存率低，严重危及人类的健康和生命。

研究证实PGE2可以通过促进肿瘤细胞的增殖[1]、侵袭转移[2]、肿瘤血管的形成[3]而促进肿瘤的发生发展。

目前认为PGE2是通过细胞膜表面的PGE2受体（EP受体）发挥作用,EP受体为细胞膜G蛋白偶联受体,有4种亚型,分别称为EP1、EP2、EP3和EP4受体[4]。

SnoN（ski-relatednovelgene）是Ski原癌基因家族的成员之一，目前研究表明，SnoN蛋白在人类许多肿瘤细胞中高表达[5]，但在人肝癌组织中关于SnoN蛋白的报道较少，有关SnoN在PGE2对CCLP1细胞增殖能力调控中的作用目前还不清楚。

本研究应用PGE2、四种EP受体激动剂、腺苷酸环化酶（AC）激动剂Forskolin、cAMP拟似物dbcAMP及PKA抑制剂H89处理人胆管上皮癌细胞CCLP1，观察其SnoN表达水平的变化及与CCLP1细胞增殖能力变化的关系，意在阐明SnoN蛋白在PGE2调控CCLP1细胞生长中的作用及其可能的信号转导通路。

1材料和方法

1.1材料

人肝癌胆管上皮癌细胞CCLP1细胞株（美国匹兹堡大学医学院WuTong教授赠），DMEM培养基（美国Invitrogen公司），小牛血清（杭州四季青公司），PGE2（美国Cayman公司），EP1受体激动剂（17-phenyltrinorProstaglandinE2）、EP2受体激动剂（Butaprost）（美国Sigma公司）、EP3受体激动剂（Sulprostone）、EP4受体激动剂（ProstaglandinE1Alcohol）（美国Cayman公司），SnoN抗体（美国CellSignalingTechology公司），鼠抗人β-actin单克隆抗体（美国Sigma公司），抗鼠、兔二抗（美国Sigma公司），AC激动剂Forskolin（美国Sigma公司），PKA抑制剂H89（美国Sigma公司），cAMP拟似物dbcAMP（美国Sigma公司）.

1.2方法

1.2.1细胞培养

胆管上皮癌细胞株CCLP1置于含10%小牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2孵箱中常规培养，0.125%胰酶+0.020%EDTA消化传代，六孔板每孔接种2×105个细胞，96板每孔接种5×103个细胞，贴壁24h后用于实验。

1.2.2反转录PCR（RT-PCR）

六孔板每孔接种2×105个细胞,以DMSO为对照，10μMPGE2处理CCLP1细胞24h后，用TRIzolReagent方法提取RNA，测浓度后取2μg进行反转录（25μl体系）,取2μlcDNA,10μlSYGRGERRNPCRMasterMix,6μlddH2O,上下游引物各1μl进行反应，引物序列如下：

SnoN[6]sense：

5′-TTTCTGCCTCTTCCATCACC-3′、anti-sense5′-GACTTGGGGCAAACAGAGTC-3，目的片段长度为150bp；GADPHsense:

CACCCATGACGAACATGGG,anti-senseTTCCAGGAGCGAGATCCCT，目的片段长度为175bp。

1.2.3WST试验

96孔板每孔种细胞100ul（细胞浓度为5×10³/ml）,待细胞贴壁后,以DMSO为对照，加相关试剂处理24小时，弃培养上清液后，加入100μl无血清DMEM+10μlCellCountingKit-8，450nm检测细胞增殖能力。

1.2.4细胞中SnoN的检测

六孔板每孔接种2×105个细胞，贴壁24h，以DMSO为对照，不同浓度PGE2处理细胞24h,10μMEP1-4受体激动剂处理24h，10μMPKA抑制剂H89预处理细胞30min后加10μMPGE2处理24h后，PBS终止反应，用细胞刮匙收集细胞，加入适量细胞裂解液冰上作用30min，冰浴下超声粉碎，15000g，离心30min。

取上清，用BSA法定量蛋白浓度。

取60-100μg上述蛋白在10%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，电转至硝酸纤维素膜，封闭1h，一抗4℃孵育过夜，PBS-T洗涤后加二抗孵育2h，ECL显色系统检测SnoN的表达，以β-actin为内参照。

X线胶片上的信号用Image-J软件进行统计分析。

1.2.5统计学方法

采用SPSS10.0统计软件,以P<0.05为显著性检验。

2结果

2.1PGE2促进CCLP1细胞SnoN蛋白的表达.

以DMSO为对照，实验组用1μM，5μM，10μM，20μMPGE2分别处理CCLP1细胞24h后，Westernblot实验观察实验结果，用Image-J软件分析发现，细胞中SnoN蛋白的表达水平分别上升了13.4%，24.5%，35.6%，23.5%（P<0.05）,差异具有统计学意义（图1）。

以DMSO为对照，用10μMPGE2处理CCLP1细胞24小时，Westernblot实验观察到实验组细胞中SnoN的含量是对照组的1.17倍，差异具有统计学意义（图2）。

对照组相比，P<0.05

图1.PGE2对CCLP1细胞SnoN表达水平的影响

Fig1.TheeffectofPGE2onSnoNexpressioninCCLP1cells

对照组相比，P<0.05

图2.10μMPGE2对CCLP1细胞SnoN表达水平的影响

Fig2.Theeffectof10μMPGE2onSnoNexpressioninCCLP1cells

2.2PGE2促进CCLP1细胞SnoNmRNA的表达。

以DMSO为对照，实验组用10μMPGE2处理24小时后，RT-PCR实验观察到实验组SnoNmRNA含量是对照组的1.22倍，差异具统计学意义（图3）。

对照组相比，P<0.01

图3.PGE2对CCLP1细胞SnoNmRNA表达的影响

Fig3.TheeffectofPGE2onmRNAofSnoNinCCLP1cells

2.3四种EP受体激动剂对CCLP1细胞SnoN蛋白表达量及CCLP1细胞增殖能力的影响。

以DMSO为对照，实验组用10μMEP1-4四种受体激动剂（EP1:

ProstaglandinE1Alcohol，EP2:

Butaprost，EP3:

Sulprostone，EP4:

17-phenyltrinorProstaglandinE2）处理CCLP1细胞24h后，Westernblot实验观察实验结果，用Image-J软件分析发现，EP2受体激动剂组细胞中SnoN蛋白的表达水平与对照组相比上升了64.9%，而EP1，EP3，EP4受体激动剂处理组细胞中SnoN蛋白表达量与对照组相比只分别上升了35.6%，29.6%，24.9%（图4），差异均具有统计学意义。

用10μMEP1-4四种受体激动剂处理CCLP1细胞24h后，WST实验观察CCLP1细胞增殖能力，结果显示：

细胞增殖能力分别上升了12.5%，26.5%，16.9%，30.2%，差异具有统计学意义（图5）。

1μM，5μM，10μM，20μMEP2受体激动剂处理CCLP1细胞24h后，细胞增殖能力分别上升了13.3%，15.4%，16.1%,18.2%,差异具有统计学意义（图6）。

对照组相比，P<0.05

图4.四种EP受体激动剂对CCLP1细胞SnoN表达的影响

Fig4.TheeffectofEP1-4receptoragonistonSnoNinCCLP1cells

对照组相比，P<0.05

图5.四种EP受体激动剂对CCLP1细胞增殖能力的影响

Fig5.TheeffectofEP1-4receptoragonistonthecellprolifelationabilityofCCLP1.

对照组相比，P<0.05

图6.EP2受体激动剂对CCLP1细胞增殖能力的影响

Fig6.TheeffectofEP2receptoragonistonthecellprolifelationabilityofCCLP1

2.4腺苷酸环化酶（AC）激动剂Forskolin、cAMP拟似物dbcAMP及PKA抑制剂H89对CCLP1细胞SnoN蛋白表达量及细胞增殖能力的影响。

为探讨PGE2对CCLP1细胞中SnoN蛋白的调节作用是否与cAMP-PKA-CREB信号通道相关，以DMSO为对照，实验组分别用10μMForskolin、10μMH89预处理1h后再加入10μMForskolin处理24小时，Westernblot实验观察实验结果，用Image-J软件分析发现Forskolin组细胞中SnoN蛋白的表达水平较对照组上升了25.1%，而H89+Forskolin组较Forskolin组细胞中SnoN蛋白的表达水平下降了9.1%，差异均具有统计学意义（图7）；用1μM,5μM，10μMForskolin处理CCLP1细胞24小时后，WST实验检测细胞增殖能力，结果显示细胞增殖能力分别上升了2.7%，3.6%，4.4%（图8），而用1μM，5μM，10μM，20μMH89处理CCLP1细胞后，细胞增殖能力较对照组分别下降了2.7%，9.1%，27.1%，45.7%，差异均有统计学意义（图9）。

以ddH20为对照，实验组用500μMdbcAMP处理CCLP1细胞24h后，SnoN蛋白的表达水平较对照组水平上升了90.1%，差异具有统计学意义（图10）。

对照组相比，P<0.05

图7.Forskolin、H89抑制Forskolin对CCLP1细胞SnoN表达的影响

Fig7.ForskolinandForskolin-inducedSnoNexpressionwasblockedbyH89inCCLP1cells.

对照组相比，P<0.05

图8.Forskolin对CCLP1细胞增殖能力的影响

Fig8.TheeffectofForskolinonthecellprolifelationabilityofCCLP1

对照组相比，P<0.05

图9.H89对CCLP1细胞增殖能力的影响

Fig9.TheeffectofH89onthecellprolifelationabilityofCCLP1

对照组相比，P<0.05

图10.dbcAMP对CCLP1细胞增殖能力的影响

Fig10.TheeffectofH89onSnoNexpressioninCCLP1cells

2.5腺苷酸环化酶（AC）激动剂Forskolin及PKA抑制剂H89对CCLP1细胞CREB蛋白磷酸化水平的影响

为进一步探讨PGE2对CCLP1细胞中SnoN蛋白的调节作用是否与cAMP-PKA-CREB信号通道相关，以DMSO为对照，实验组分别用10μMAC激动剂Forskolin、10μMH89预处理1h后再加入10μMForskolin处理24小时，Westernblot实验观察实验结果，用Image-J软件分析发现Forskolin组细胞中CREB蛋白的磷酸化水平较对照组上升了71.3%，而H89+Forskolin组较Forskolin组细胞中CREB蛋白的磷酸化水平下降了14.1%，差异均具有统计学意义（图11）.

对照组相比，P<0.05

图11.Forskolin、H89抑制Forskolin对CCLP1细胞CREB磷酸化水平的影响

Fig11.ForskolinandForskolin-inducedCREBphosphorylationwasblockedbyH89inCCLP1cells

3讨论

PGE2是由活化的环氧合酶-2（COX-2）催化花生四烯酸而形成的，PGE2被人们广泛认为是一种介导炎症反应的物质，但除此之外它可能还具有其它一些更为复杂的作用。

PGE2通过与细胞膜表面的四种EP受体相偶联，而发挥调控细胞内cAMP水平、钙离子浓度及磷脂酰肌醇激活等的作用[7]。

通过大鼠和人胚肾细胞EP受体转染实验[8],人们推测4种EP受体可能各自通过以下信号转导途径发挥作用:

EP1受体与G蛋白的Gq部分偶联,通过提高细胞内Ca2+和激活蛋白激酶C（PKC）而发挥作用;EP3受体与G蛋白的Gi部分偶联,通过抑制腺苷酸环化酶（AC）的活性而发挥作用;EP2和EP4受体都与G蛋白的Gs部分偶联,通过激活腺苷酸环化酶/促进cAMP生成/激活蛋白激酶A（PKA）/使糖原合成激酶-3（GSK-3）磷酸化失活而发挥作用.根据上述推测，EP2受体通过激活腺苷酸环化酶而促进cAMP生成，cAMP作为第二信使，进一步激活蛋白激酶A（PKA），活化的PKA可催化cAMP应答元件结合蛋白（CREB）中的Ser133磷酸化，从而使CREB蛋白磷酸化[9]。

但是磷酸化的CREB蛋白能否调节人肝癌细胞特别是CCLPI细胞中SnoN蛋白的水平目前还不十分清楚。

早期人们对SnoN蛋白的认识是从Ski蛋白开始的，那时人们发现一种蛋白的基因序列中有很多序列和Ski蛋白同源，将之命名为SnoN蛋白。

SnoN比Ski的发现稍晚。

很久以来，人们知道Ski/SnoN是癌基因，但究竟两者如何引起细胞转化一直不清楚。

直到1999年底，才发现他们是通过与smads蛋白作用，进而调节TGF-β-smads信号通路。

后来的研究表明：

在SnoN蛋白中存在着两个重要的结合的区域：

一个是与TGF-β信号通路中smads蛋白结合的区域，并测得该区域SnoN蛋白结构域是684aa[10]。

另一个区域是与CREB蛋白结合的区域，该区域位于SnoN蛋白