病理论文.docx
《病理论文.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《病理论文.docx(16页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
病理论文
PGE2通过EP2受体激活cAMP-PKA-CREB信号通路上调SnoN的表达而促进CCLP1细胞的增殖
黄文勇1,张丽1,束为2,彭韬1,张海1,马娟1,白小明1,冷静1*
(1南京医科大学生殖医学重点实验室,肿瘤中心,病理学系,2南京医科大学口腔医学研究所,南京医科大学附属口腔医院牙周科,江苏南京210029)
[摘要]目的:
探讨PGE2对人胆管上皮癌细胞CCLP1增殖能力影响的作用机制。
方法:
用PGE2、EP1-4四种受体激动剂、AC激动剂Forskolin、PKA抑制剂H89、cAMP拟似物dbcAMP处理CCLP1细胞,通过RT-PCR、Westernblot、WST等实验检测SnoNmRNA、SnoN蛋白表达量以及CCLP1细胞增殖能力的变化。
结果:
1μM、5μM、10μM、20μMPGE2处理CCLP1细胞24h后,细胞中SnoN蛋白的表达水平分别上升了13.4%、24.5%、35.6%、23.5%(P<0.05),10μMPGE2处理CCLP1细胞24h后,SnoNmRNA的表达水平与对照组相比上升了22.5%(P<0.01);10μMEP2受体激动剂处理CCLP1细胞24h后,细胞中SnoN蛋白的表达水平与对照组相比上升了64.9%(P<0.05),细胞增殖能力上升了26.5%,而10μMEP1、EP3、EP4受体激动剂处理CCLP1细胞24h后,SnoN蛋白的表达水平与对照组相比分别上升了35.6%、29.6%、24.9%(P<0.05),细胞增殖能力也分别上升了12.5%、16.9%、30.2%;10μMAC激动剂Forskolin处理CCLP1细胞24h后,SnoN蛋白的表达水平及CREB蛋白的磷酸化水平较对照组分别上升了25.1%、71.3%,1μM、5μM、10μMForskolin处理CCLP1细胞24小时后细胞增殖能力也分别上升了2.7%、3.6%、4.4%;用500μMcAMP拟似物dbcAMP处理CCLP1细胞24小时后SnoN蛋白的表达水平较对照组上升了90.1%(P<0.05);而用PKA抑制剂H89阻断Forskolin的作用后,SnoN蛋白的表达水平和CREB蛋白的磷酸化水平较Forskolin处理组分别下降了9.1%、14.1%,1μM、5μM、10μM、20μMH89分别处理CCLP1细胞后,细胞增殖能力较对照组分别下降了2.7%、9.1%、27.1%、45.7%,差异均有统计学意义。
结论:
PGE2可通过EP2受体激活cAMP-PKA-CREB信号转导通路上调CCLP1细胞SnoN的表达,从而促进CCLP1细胞的增殖。
[关键词]胆管上皮癌;PGE2;EP2受体;SnoN;cAMP-PKA-CREB
ProstaglandinE2promotesthecellprolifelationabilityofCCLP1throughEP2prostanoidreceptorwhichincreasedtheexpressionofSnoNbyactivationofcAMP-PKA-CREBpathway
HUANGWenYong1,ZHANGLi1,SHUWei2,PENGTao1,ZHANGHai1,MAJuan1,BAIXiao-Ming1,LENGJing1*
(1LaboratoryofReproductiveMedicine,Cancercenter,DepartmentofPathology,NanjingMedicalUniversity,2InstitueOFstomatoloy,NANJINGMedicalUniversityDepartmentofperiodortology,SchoolOfStomatology,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China)
[Abstract]Objective:
ToexploretheMechanismofProstaglandinE2affectsthecellprolifelationabilityofhumanBileductcarcinomacellsCCLP1.Methods:
CCLP1cellsweretreatedwithPGE2,EP1-4receptoragonist,ACagonistForskolin,PKAantagonistH89,cAMPanaloguesdbcAMP.ThelevelsofSnoNmRNA,SnoNproteinexpressionandthecellprolifelationabilitywereexaminedbyRT-PCR,WesternblotandWSTinCCLP1cells.Results:
TheexpressionofSnoNinCCLP1cellswereincreasedby13.4%、24.5%、35.6%、23.5%(P<0.05)aftertreatedwith1μM、5μM、10μM、20μMPGE2for24hrespectively,andtheexpressionofSnoNmRNAinCCLP1cellswereincreasedby22.5%(P<0.01)aftertreatedwithPGE2(10μmol/L)for24h;TheexpressionofSnoNinCCLP1cellswereincreasedby64.9%(P<0.05)aftertreatedwithEP2receptoragonist(10μmol/L)for24h,andthecellprolifelationabilityofCCLP1wereincreasedby26.5%,butjustincreasedby35.6%、29.6%、24.9%(P<0.05)aftertreatedwithEP1、EP3、EP4(10μmol/L)receptoragonistfor24h,andthecellprolifelationabilityofCCLP1wereincreasedby12.5%、16.9%、30.2%respectively;ThelevelsofSnoNexpressionandCREBphosphorylationinCCLP1cellswereincreasedby25.1%、71.3%(P<0.05)comparedwiththecontrolgroupaftertreatedwithACagonistForskolin(10μmol/L)for24h,andthecellprolifelationabilityofCCLP1wereincreasedby2.7%、3.6%、4.4%(P<0.05)aftertreatedwith1μM、5μM、10μMForskolinrespectively;TheexpressionofSnoNinCCLP1cellswereincreasedby90.1%(P<0.05)whenwetreatedwithcAMPanaloguesdbcAMP(500μmol/L)for24h,butwhenwetreatedthecellwithPKAantagonistH89(10μmol/L)for24h,thelevelsofSnoNexpressionandCREBphosphorylationinCCLP1cellsweredecreasedby9.1%、14.1%(P<0.05)comparedwiththeForskolintreatedgroup.andthecellprolifelationabilityofCCLP1weredecreasedby2.7%、9.1%、27.1%、45.7%(P<0.05)aftertreatedwith1μM、5μM、10μM、20μMH89respectively.Conclusion:
OurfindingssuggestedthatPGE2mightup-regulatetheexpressionlevelofSnoNthroughEP2receptorofCCLP1cellswhichcouldbepartlyrelatedtothecAMP-PKA-CREBSignalConductionPathway,andthenpromotesthecellprolifelationabilityofCCLP1.
[Keywords]Bileductcarcinoma;PGE2;EPprostanoidreceptor;SnoN;cAMP-PKA-CREB
肝癌是我国的高发肿瘤之一,五年生存率低,严重危及人类的健康和生命。
研究证实PGE2可以通过促进肿瘤细胞的增殖[1]、侵袭转移[2]、肿瘤血管的形成[3]而促进肿瘤的发生发展。
目前认为PGE2是通过细胞膜表面的PGE2受体(EP受体)发挥作用,EP受体为细胞膜G蛋白偶联受体,有4种亚型,分别称为EP1、EP2、EP3和EP4受体[4]。
SnoN(ski-relatednovelgene)是Ski原癌基因家族的成员之一,目前研究表明,SnoN蛋白在人类许多肿瘤细胞中高表达[5],但在人肝癌组织中关于SnoN蛋白的报道较少,有关SnoN在PGE2对CCLP1细胞增殖能力调控中的作用目前还不清楚。
本研究应用PGE2、四种EP受体激动剂、腺苷酸环化酶(AC)激动剂Forskolin、cAMP拟似物dbcAMP及PKA抑制剂H89处理人胆管上皮癌细胞CCLP1,观察其SnoN表达水平的变化及与CCLP1细胞增殖能力变化的关系,意在阐明SnoN蛋白在PGE2调控CCLP1细胞生长中的作用及其可能的信号转导通路。
1材料和方法
1.1材料
人肝癌胆管上皮癌细胞CCLP1细胞株(美国匹兹堡大学医学院WuTong教授赠),DMEM培养基(美国Invitrogen公司),小牛血清(杭州四季青公司),PGE2(美国Cayman公司),EP1受体激动剂(17-phenyltrinorProstaglandinE2)、EP2受体激动剂(Butaprost)(美国Sigma公司)、EP3受体激动剂(Sulprostone)、EP4受体激动剂(ProstaglandinE1Alcohol)(美国Cayman公司),SnoN抗体(美国CellSignalingTechology公司),鼠抗人β-actin单克隆抗体(美国Sigma公司),抗鼠、兔二抗(美国Sigma公司),AC激动剂Forskolin(美国Sigma公司),PKA抑制剂H89(美国Sigma公司),cAMP拟似物dbcAMP(美国Sigma公司).
1.2方法
1.2.1细胞培养
胆管上皮癌细胞株CCLP1置于含10%小牛血清的DMEM培养基中,于37℃、5%CO2孵箱中常规培养,0.125%胰酶+0.020%EDTA消化传代,六孔板每孔接种2×105个细胞,96板每孔接种5×103个细胞,贴壁24h后用于实验。
1.2.2反转录PCR(RT-PCR)
六孔板每孔接种2×105个细胞,以DMSO为对照,10μMPGE2处理CCLP1细胞24h后,用TRIzolReagent方法提取RNA,测浓度后取2μg进行反转录(25μl体系),取2μlcDNA,10μlSYGRGERRNPCRMasterMix,6μlddH2O,上下游引物各1μl进行反应,引物序列如下:
SnoN[6]sense:
5′-TTTCTGCCTCTTCCATCACC-3′、anti-sense5′-GACTTGGGGCAAACAGAGTC-3,目的片段长度为150bp;GADPHsense:
CACCCATGACGAACATGGG,anti-senseTTCCAGGAGCGAGATCCCT,目的片段长度为175bp。
1.2.3WST试验
96孔板每孔种细胞100ul(细胞浓度为5×10³/ml),待细胞贴壁后,以DMSO为对照,加相关试剂处理24小时,弃培养上清液后,加入100μl无血清DMEM+10μlCellCountingKit-8,450nm检测细胞增殖能力。
1.2.4细胞中SnoN的检测
六孔板每孔接种2×105个细胞,贴壁24h,以DMSO为对照,不同浓度PGE2处理细胞24h,10μMEP1-4受体激动剂处理24h,10μMPKA抑制剂H89预处理细胞30min后加10μMPGE2处理24h后,PBS终止反应,用细胞刮匙收集细胞,加入适量细胞裂解液冰上作用30min,冰浴下超声粉碎,15000g,离心30min。
取上清,用BSA法定量蛋白浓度。
取60-100μg上述蛋白在10%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离,电转至硝酸纤维素膜,封闭1h,一抗4℃孵育过夜,PBS-T洗涤后加二抗孵育2h,ECL显色系统检测SnoN的表达,以β-actin为内参照。
X线胶片上的信号用Image-J软件进行统计分析。
1.2.5统计学方法
采用SPSS10.0统计软件,以P<0.05为显著性检验。
2结果
2.1PGE2促进CCLP1细胞SnoN蛋白的表达.
以DMSO为对照,实验组用1μM,5μM,10μM,20μMPGE2分别处理CCLP1细胞24h后,Westernblot实验观察实验结果,用Image-J软件分析发现,细胞中SnoN蛋白的表达水平分别上升了13.4%,24.5%,35.6%,23.5%(P<0.05),差异具有统计学意义(图1)。
以DMSO为对照,用10μMPGE2处理CCLP1细胞24小时,Westernblot实验观察到实验组细胞中SnoN的含量是对照组的1.17倍,差异具有统计学意义(图2)。
对照组相比,P<0.05
图1.PGE2对CCLP1细胞SnoN表达水平的影响
Fig1.TheeffectofPGE2onSnoNexpressioninCCLP1cells
对照组相比,P<0.05
图2.10μMPGE2对CCLP1细胞SnoN表达水平的影响
Fig2.Theeffectof10μMPGE2onSnoNexpressioninCCLP1cells
2.2PGE2促进CCLP1细胞SnoNmRNA的表达。
以DMSO为对照,实验组用10μMPGE2处理24小时后,RT-PCR实验观察到实验组SnoNmRNA含量是对照组的1.22倍,差异具统计学意义(图3)。
对照组相比,P<0.01
图3.PGE2对CCLP1细胞SnoNmRNA表达的影响
Fig3.TheeffectofPGE2onmRNAofSnoNinCCLP1cells
2.3四种EP受体激动剂对CCLP1细胞SnoN蛋白表达量及CCLP1细胞增殖能力的影响。
以DMSO为对照,实验组用10μMEP1-4四种受体激动剂(EP1:
ProstaglandinE1Alcohol,EP2:
Butaprost,EP3:
Sulprostone,EP4:
17-phenyltrinorProstaglandinE2)处理CCLP1细胞24h后,Westernblot实验观察实验结果,用Image-J软件分析发现,EP2受体激动剂组细胞中SnoN蛋白的表达水平与对照组相比上升了64.9%,而EP1,EP3,EP4受体激动剂处理组细胞中SnoN蛋白表达量与对照组相比只分别上升了35.6%,29.6%,24.9%(图4),差异均具有统计学意义。
用10μMEP1-4四种受体激动剂处理CCLP1细胞24h后,WST实验观察CCLP1细胞增殖能力,结果显示:
细胞增殖能力分别上升了12.5%,26.5%,16.9%,30.2%,差异具有统计学意义(图5)。
1μM,5μM,10μM,20μMEP2受体激动剂处理CCLP1细胞24h后,细胞增殖能力分别上升了13.3%,15.4%,16.1%,18.2%,差异具有统计学意义(图6)。
对照组相比,P<0.05
图4.四种EP受体激动剂对CCLP1细胞SnoN表达的影响
Fig4.TheeffectofEP1-4receptoragonistonSnoNinCCLP1cells
对照组相比,P<0.05
图5.四种EP受体激动剂对CCLP1细胞增殖能力的影响
Fig5.TheeffectofEP1-4receptoragonistonthecellprolifelationabilityofCCLP1.
对照组相比,P<0.05
图6.EP2受体激动剂对CCLP1细胞增殖能力的影响
Fig6.TheeffectofEP2receptoragonistonthecellprolifelationabilityofCCLP1
2.4腺苷酸环化酶(AC)激动剂Forskolin、cAMP拟似物dbcAMP及PKA抑制剂H89对CCLP1细胞SnoN蛋白表达量及细胞增殖能力的影响。
为探讨PGE2对CCLP1细胞中SnoN蛋白的调节作用是否与cAMP-PKA-CREB信号通道相关,以DMSO为对照,实验组分别用10μMForskolin、10μMH89预处理1h后再加入10μMForskolin处理24小时,Westernblot实验观察实验结果,用Image-J软件分析发现Forskolin组细胞中SnoN蛋白的表达水平较对照组上升了25.1%,而H89+Forskolin组较Forskolin组细胞中SnoN蛋白的表达水平下降了9.1%,差异均具有统计学意义(图7);用1μM,5μM,10μMForskolin处理CCLP1细胞24小时后,WST实验检测细胞增殖能力,结果显示细胞增殖能力分别上升了2.7%,3.6%,4.4%(图8),而用1μM,5μM,10μM,20μMH89处理CCLP1细胞后,细胞增殖能力较对照组分别下降了2.7%,9.1%,27.1%,45.7%,差异均有统计学意义(图9)。
以ddH20为对照,实验组用500μMdbcAMP处理CCLP1细胞24h后,SnoN蛋白的表达水平较对照组水平上升了90.1%,差异具有统计学意义(图10)。
对照组相比,P<0.05
图7.Forskolin、H89抑制Forskolin对CCLP1细胞SnoN表达的影响
Fig7.ForskolinandForskolin-inducedSnoNexpressionwasblockedbyH89inCCLP1cells.
对照组相比,P<0.05
图8.Forskolin对CCLP1细胞增殖能力的影响
Fig8.TheeffectofForskolinonthecellprolifelationabilityofCCLP1
对照组相比,P<0.05
图9.H89对CCLP1细胞增殖能力的影响
Fig9.TheeffectofH89onthecellprolifelationabilityofCCLP1
对照组相比,P<0.05
图10.dbcAMP对CCLP1细胞增殖能力的影响
Fig10.TheeffectofH89onSnoNexpressioninCCLP1cells
2.5腺苷酸环化酶(AC)激动剂Forskolin及PKA抑制剂H89对CCLP1细胞CREB蛋白磷酸化水平的影响
为进一步探讨PGE2对CCLP1细胞中SnoN蛋白的调节作用是否与cAMP-PKA-CREB信号通道相关,以DMSO为对照,实验组分别用10μMAC激动剂Forskolin、10μMH89预处理1h后再加入10μMForskolin处理24小时,Westernblot实验观察实验结果,用Image-J软件分析发现Forskolin组细胞中CREB蛋白的磷酸化水平较对照组上升了71.3%,而H89+Forskolin组较Forskolin组细胞中CREB蛋白的磷酸化水平下降了14.1%,差异均具有统计学意义(图11).
对照组相比,P<0.05
图11.Forskolin、H89抑制Forskolin对CCLP1细胞CREB磷酸化水平的影响
Fig11.ForskolinandForskolin-inducedCREBphosphorylationwasblockedbyH89inCCLP1cells
3讨论
PGE2是由活化的环氧合酶-2(COX-2)催化花生四烯酸而形成的,PGE2被人们广泛认为是一种介导炎症反应的物质,但除此之外它可能还具有其它一些更为复杂的作用。
PGE2通过与细胞膜表面的四种EP受体相偶联,而发挥调控细胞内cAMP水平、钙离子浓度及磷脂酰肌醇激活等的作用[7]。
通过大鼠和人胚肾细胞EP受体转染实验[8],人们推测4种EP受体可能各自通过以下信号转导途径发挥作用:
EP1受体与G蛋白的Gq部分偶联,通过提高细胞内Ca2+和激活蛋白激酶C(PKC)而发挥作用;EP3受体与G蛋白的Gi部分偶联,通过抑制腺苷酸环化酶(AC)的活性而发挥作用;EP2和EP4受体都与G蛋白的Gs部分偶联,通过激活腺苷酸环化酶/促进cAMP生成/激活蛋白激酶A(PKA)/使糖原合成激酶-3(GSK-3)磷酸化失活而发挥作用.根据上述推测,EP2受体通过激活腺苷酸环化酶而促进cAMP生成,cAMP作为第二信使,进一步激活蛋白激酶A(PKA),活化的PKA可催化cAMP应答元件结合蛋白(CREB)中的Ser133磷酸化,从而使CREB蛋白磷酸化[9]。
但是磷酸化的CREB蛋白能否调节人肝癌细胞特别是CCLPI细胞中SnoN蛋白的水平目前还不十分清楚。
早期人们对SnoN蛋白的认识是从Ski蛋白开始的,那时人们发现一种蛋白的基因序列中有很多序列和Ski蛋白同源,将之命名为SnoN蛋白。
SnoN比Ski的发现稍晚。
很久以来,人们知道Ski/SnoN是癌基因,但究竟两者如何引起细胞转化一直不清楚。
直到1999年底,才发现他们是通过与smads蛋白作用,进而调节TGF-β-smads信号通路。
后来的研究表明:
在SnoN蛋白中存在着两个重要的结合的区域:
一个是与TGF-β信号通路中smads蛋白结合的区域,并测得该区域SnoN蛋白结构域是684aa[10]。
另一个区域是与CREB蛋白结合的区域,该区域位于SnoN蛋白