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1、病理论文PGE2通过EP2受体激活cAMP-PKA-CREB信号通路上调SnoN的表达而促进CCLP1细胞的增殖黄文勇1，张丽 1，束为2，彭韬1，张海1，马娟1，白小明1，冷静1*（1南京医科大学生殖医学重点实验室，肿瘤中心，病理学系，2 南京医科大学口腔医学研究所，南京医科大学附属口腔医院牙周科，江苏 南京 210029）摘要 目的：探讨PGE2对人胆管上皮癌细胞CCLP1增殖能力影响的作用机制。方法：用PGE2、EP1-4四种受体激动剂、AC激动剂Forskolin、PKA抑制剂H89 、cAMP拟似物dbcAMP处理CCLP1细胞，通过RT-PCR、Western blot、 WST等

2、实验检测SnoN mRNA、SnoN蛋白表达量以及CCLP1细胞增殖能力的变化。结果：1M、5M、10M、20M PGE2处理CCLP1细胞24h后，细胞中SnoN蛋白的表达水平分别上升了13.4%、24.5%、35.6%、23.5%（P0.05），10M PGE2处理CCLP1细胞24h后，SnoN mRNA的表达水平与对照组相比上升了22.5%（P0.01）；10M EP2受体激动剂处理CCLP1细胞24h后，细胞中SnoN蛋白的表达水平与对照组相比上升了64.9%（P0.05），细胞增殖能力上升了26.5%，而10M EP1、EP3、EP4受体激动剂处理CCLP1细胞24h后，SnoN蛋

3、白的表达水平与对照组相比分别上升了35.6%、29.6%、24.9%（P0.05），细胞增殖能力也分别上升了12.5%、16.9%、30.2%；10M AC激动剂Forskolin处理CCLP1细胞24h后，SnoN蛋白的表达水平及CREB蛋白的磷酸化水平较对照组分别上升了25.1%、71.3%， 1M、5M、10M Forskolin处理CCLP1细胞24小时后细胞增殖能力也分别上升了2.7%、3.6%、4.4%；用500M cAMP拟似物dbcAMP处理CCLP1细胞24小时后SnoN蛋白的表达水平较对照组上升了90.1%（P0.05）；而用PKA抑制剂H89阻断Forskolin的作用后

4、，SnoN蛋白的表达水平和CREB蛋白的磷酸化水平较Forskolin处理组分别下降了9.1%、14.1%，1M、5M、10M、20M H89分别处理CCLP1细胞后，细胞增殖能力较对照组分别下降了2.7%、9.1%、27.1%、45.7%，差异均有统计学意义。结论：PGE2可通过EP2受体激活cAMP-PKA-CREB信号转导通路上调CCLP1细胞SnoN的表达，从而促进CCLP1细胞的增殖。关键词 胆管上皮癌；PGE2；EP2受体；SnoN；cAMP-PKA-CREBProstaglandin E2 promotes the cell prolifelation ability of CC

5、LP1 through EP2 prostanoid receptor which increased the expression of SnoN by activation of cAMP-PKA-CREB pathway HUANG Wen Yong1, ZHANG Li 1,SHU Wei2,PENG Tao1,ZHANG Hai1, MA Juan 1, BAI Xiao-Ming1, LENG Jing1*（1 Laboratory of Reproductive Medicine, Cancer center, Department of Pathology, Nanjing M

6、edical University,2 Institue OF stomatoloy, NANJING Medical University Department of periodortology,School Of Stomatology, Nanjing Medical University,Nanjing 210029, China)Abstract Objective: To explore the Mechanism of Prostaglandin E2 affects the cell prolifelation ability of human Bile duct carci

7、noma cells CCLP1. Methods: CCLP1 cells were treated with PGE2, EP1-4 receptor agonist , AC agonist Forskolin ,PKA antagonist H89, cAMP analogues dbcAMP. The levels of SnoN mRNA，SnoN protein expression and the cell prolifelation ability were examined by RT-PCR, Western blot and WST in CCLP1 cells. Re

8、sults:The expression of SnoN in CCLP1 cells were increased by 13.4%、24.5%、35.6%、23.5%（P0.05）after treated with 1M、5M、10M、20M PGE2 for 24h respectively, and the expression of SnoN mRNA in CCLP1 cells were increased by 22.5%（P0.01）after treated with PGE2（10mol/L）for 24 h；The expression of SnoN in CCLP

9、1 cells were increased by 64.9%（P0.05）after treated with EP2 receptor agonist (10mol/L) for 24h , and the cell prolifelation ability of CCLP1 were increased by 26.5%， but just increased by 35.6% 、29.6%、24.9%（P0.05）after treated with EP1、EP3、EP4(10mol/L) receptor agonist for 24h， and the cell prolife

10、lation ability of CCLP1 were increased by 12.5%、16.9%、30.2% respectively；The levels of SnoN expression and CREB phosphorylation in CCLP1 cells were increased by 25.1%、71.3%（P0.05）compared with the control group after treated with AC agonist Forskolin(10mol/L) for 24h, and the cell prolifelation abil

11、ity of CCLP1 were increased by 2.7%、3.6%、4.4%（P0.05）after treated with 1M、5M、10M Forskolin respectively；The expression of SnoN in CCLP1 cells were increased by 90.1%（P0.05）when we treated with cAMP analogues dbcAMP (500mol/L) for 24h, but when we treated the cell with PKA antagonist H89 (10mol/L) fo

12、r 24h, the levels of SnoN expression and CREB phosphorylation in CCLP1 cells were decreased by 9.1%、14.1%（P0.05）compared with the Forskolin treated group. and the cell prolifelation ability of CCLP1 were decreased by 2.7%、9.1%、27.1%、45.7%（P0.05）after treated with 1M、5M、10M、20M H89 respectively. Conc

13、lusion: Our findings suggested that PGE2 might up-regulate the expression level of SnoN through EP2 receptor of CCLP1 cells which could be partly related to the cAMP-PKA-CREB Signal Conduction Pathway,and then promotes the cell prolifelation ability of CCLP1.Key words Bile duct carcinoma; PGE2; EP p

14、rostanoid receptor; SnoN; cAMP-PKA-CREB肝癌是我国的高发肿瘤之一，五年生存率低，严重危及人类的健康和生命。研究证实PGE2可以通过促进肿瘤细胞的增殖1、侵袭转移2、肿瘤血管的形成3而促进肿瘤的发生发展。目前认为PGE2是通过细胞膜表面的PGE2受体(EP受体)发挥作用, EP受体为细胞膜G蛋白偶联受体, 有4种亚型, 分别称为EP1、EP2、EP3 和EP4 受体4。SnoN（ski-related novel gene）是Ski原癌基因家族的成员之一，目前研究表明，SnoN蛋白在人类许多肿瘤细胞中高表达5，但在人肝癌组织中关于SnoN蛋白的报道较少，有关

15、SnoN在PGE2对CCLP1细胞增殖能力调控中的作用目前还不清楚。本研究应用PGE2、四种EP受体激动剂、腺苷酸环化酶（AC）激动剂Forskolin、cAMP拟似物dbcAMP及PKA抑制剂H89处理人胆管上皮癌细胞CCLP1，观察其SnoN 表达水平的变化及与CCLP1细胞增殖能力变化的关系，意在阐明SnoN蛋白在PGE2调控CCLP1细胞生长中的作用及其可能的信号转导通路。1 材料和方法1.1 材料人肝癌胆管上皮癌细胞CCLP1细胞株（美国匹兹堡大学医学院 Wu Tong教授赠），DMEM培养基（美国Invitrogen公司），小牛血清（杭州四季青公司），PGE2 (美国Cayman公

16、司)，EP1受体激动剂（17-phenyltrinor Prostaglandin E2）、EP2受体激动剂（Butaprost）（美国Sigma公司）、EP3受体激动剂（Sulprostone）、EP4受体激动剂（Prostaglandin E1 Alcohol）(美国Cayman公司)， SnoN抗体（美国Cell Signaling Techology公司），鼠抗人-actin单克隆抗体（美国Sigma公司），抗鼠、兔二抗（美国Sigma公司），AC激动剂Forskolin（美国Sigma公司），PKA抑制剂H89（美国Sigma公司），cAMP拟似物dbcAMP（美国Sigma公司）.

17、1.2 方法1.2.1 细胞培养胆管上皮癌细胞株CCLP1置于含10%小牛血清的DMEM培养基中，于37、5%CO2孵箱中常规培养，0.125%胰酶+0.020%EDTA消化传代，六孔板每孔接种2105个细胞，96板每孔接种5103个细胞，贴壁24h后用于实验。1.2.2 反转录PCR（RT-PCR）六孔板每孔接种2105 个细胞,以DMSO为对照，10M PGE2处理CCLP1细胞24h后，用TRIzol Reagent方法提取RNA，测浓度后取2g进行反转录（25l体系）,取2l cDNA,10l SYGR GERRN PCR Master Mix,6l ddH2O,上下游引物各1l进行反

18、应，引物序列如下：SnoN6sense：5-TTTCTGCCTCTTCCATCACC-3、anti-sense5-GACTTGGGGCAAACAGAGTC-3，目的片段长度为150bp；GADPH sense:CACCCATGACGAACATGGG,anti-senseTTCCAGGAGCGAGATCCCT ，目的片段长度为175 bp。1.2.3 WST试验96孔板每孔种细胞100ul(细胞浓度为510 /ml）, 待细胞贴壁后 , 以DMSO为对照，加相关试剂处理24小时，弃培养上清液后，加入100l无血清DMEM+10l Cell Counting Kit-8，450nm检测细胞增殖能力

19、。1.2.4 细胞中SnoN的检测六孔板每孔接种2105个细胞，贴壁24h，以DMSO为对照，不同浓度PGE2处理细胞24h,10M EP1-4受体激动剂处理24h，10M PKA抑制剂H89预处理细胞30min后加10M PGE2处理24h后，PBS终止反应，用细胞刮匙收集细胞，加入适量细胞裂解液冰上作用30min，冰浴下超声粉碎，15000g，离心30min。取上清，用BSA法定量蛋白浓度。取60-100g上述蛋白在10%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，电转至硝酸纤维素膜，封闭1h，一抗4孵育过夜，PBS-T洗涤后加二抗孵育2h，ECL显色系统检测SnoN的表达，以-actin为内参照。X线胶片

20、上的信号用Image-J软件进行统计分析。1.2.5 统计学方法采用 SPSS 10. 0 统计软件, 以P 0.05 为显著性检验。2 结果2.1 PGE2促进CCLP1细胞SnoN蛋白的表达.以DMSO为对照，实验组用1M，5M，10M，20M PGE2分别处理CCLP1细胞24h后，Western blot实验观察实验结果，用Image-J软件分析发现，细胞中SnoN蛋白的表达水平分别上升了13.4%，24.5%，35.6%，23.5%（P0.05）,差异具有统计学意义(图1)。以DMSO为对照，用10M PGE2处理CCLP1细胞24小时，Western blot实验观察到实验组细胞中

21、SnoN的含量是对照组的1.17倍，差异具有统计学意义（图2）。 对照组相比，P 0.05 图1. PGE2对CCLP1细胞SnoN表达水平的影响 Fig 1. The effect of PGE2 on SnoN expression in CCLP1cells 对照组相比，P 0.05 图2. 10M PGE2对CCLP1细胞SnoN表达水平的影响 Fig 2. The effect of 10M PGE2 on SnoN expression in CCLP1 cells 2.2 PGE2促进CCLP1细胞SnoN mRNA的表达。以DMSO为对照，实验组用10M PGE2处理24小时后

22、，RT-PCR实验观察到实验组SnoN mRNA含量是对照组的1.22倍，差异具统计学意义(图3)。对照组相比， P 0.01图3. PGE2对CCLP1细胞SnoN mRNA表达的影响Fig 3. The effect of PGE2 on mRNA of SnoN in CCLP1 cells2.3 四种EP受体激动剂对CCLP1细胞SnoN蛋白表达量及CCLP1细胞增殖能力的影响。以DMSO为对照，实验组用10M EP1-4四种受体激动剂(EP1:Prostaglandin E1 Alcohol，EP2:Butaprost，EP3:Sulprostone，EP4:17-phenyltri

23、nor Prostaglandin E2)处理CCLP1细胞24h后，Western blot实验观察实验结果，用Image-J软件分析发现，EP2受体激动剂组细胞中SnoN蛋白的表达水平与对照组相比上升了64.9%，而EP1，EP3，EP4受体激动剂处理组细胞中SnoN蛋白表达量与对照组相比只分别上升了35.6% ，29.6%， 24.9%（图4）， 差异均具有统计学意义。用10M EP1-4四种受体激动剂处理CCLP1细胞24h后，WST实验观察CCLP1细胞增殖能力，结果显示：细胞增殖能力分别上升了12.5%，26.5%，16.9%，30.2%，差异具有统计学意义（图5）。1M，5M，1

24、0M，20M EP2受体激动剂处理CCLP1细胞24h后，细胞增殖能力分别上升了13.3%，15.4%，16.1%,18.2%,差异具有统计学意义（图6）。 对照组相比， P 0.05图4. 四种EP受体激动剂对CCLP1细胞SnoN表达的影响 Fig 4. The effect of EP1-4 receptor agonist on SnoN in CCLP1 cells 对照组相比， P 0.05图5.四种EP受体激动剂对CCLP1细胞增殖能力的影响Fig 5. The effect of EP1-4 receptor agonist on the cell prolifelation

25、ability of CCLP1. 对照组相比， P 0.05图6. EP2受体激动剂对CCLP1细胞增殖能力的影响Fig 6. The effect of EP2 receptor agonist on the cell prolifelation ability of CCLP12.4 腺苷酸环化酶(AC)激动剂Forskolin、cAMP拟似物dbcAMP及PKA抑制剂H89对CCLP1细胞SnoN蛋白表达量及细胞增殖能力的影响。为探讨PGE2对CCLP1细胞中SnoN蛋白的调节作用是否与cAMP-PKA-CREB信号通道相关，以DMSO为对照，实验组分别用 10M Forskolin、

26、10M H89预处理1h后再加入10M Forskolin处理24小时，Western blot实验观察实验结果，用Image-J软件分析发现Forskolin组细胞中SnoN蛋白的表达水平较对照组上升了25.1%，而H89+Forskolin组较Forskolin组细胞中SnoN蛋白的表达水平下降了9.1%，差异均具有统计学意义（图7）；用1M, 5M，10M Forskolin 处理CCLP1细胞24小时后，WST实验检测细胞增殖能力，结果显示细胞增殖能力分别上升了2.7%，3.6%，4.4%（图8），而用1M，5M，10M，20M H89处理CCLP1细胞后，细胞增殖能力较对照组分别下降

27、了2.7%，9.1%，27.1%，45.7%，差异均有统计学意义（图9）。以ddH20为对照，实验组用500M dbcAMP处理CCLP1细胞24h后，SnoN蛋白的表达水平较对照组水平上升了90.1%，差异具有统计学意义（图10）。 对照组相比， P0.05 图7. Forskolin、H89抑制Forskolin对CCLP1细胞SnoN表达的影响Fig7. Forskolin and Forskolin-induced SnoN expression was blocked by H89 in CCLP1 cells. 对照组相比， P 0.05图8. Forskolin对CCLP1细胞增

28、殖能力的影响Fig 8. The effect of Forskolin on the cell prolifelation ability of CCLP1 对照组相比， P 0.05图9. H89对CCLP1细胞增殖能力的影响 Fig 9. The effect of H89 on the cell prolifelation ability of CCLP1 对照组相比， P 0.05图10. dbcAMP对CCLP1细胞增殖能力的影响Fig 10. The effect of H89 on SnoN expression in CCLP1cells2.5 腺苷酸环化酶（AC）激动剂Fo

29、rskolin及PKA抑制剂H89对CCLP1细胞CREB蛋白磷酸化水平的影响 为进一步探讨PGE2对CCLP1细胞中SnoN蛋白的调节作用是否与cAMP-PKA-CREB信号通道相关，以DMSO为对照，实验组分别用10M AC激动剂Forskolin、10M H89预处理1h后再加入10M Forskolin处理24小时，Western blot实验观察实验结果，用Image-J软件分析发现Forskolin组细胞中CREB蛋白的磷酸化水平较对照组上升了71.3%，而H89+Forskolin组较Forskolin组细胞中CREB蛋白的磷酸化水平下降了14.1%，差异均具有统计学意义（图11

30、）. 对照组相比， P0.05 图11. Forskolin、H89抑制Forskolin对CCLP1细胞CREB磷酸化水平的影响Fig11. Forskolin and Forskolin-induced CREB phosphorylation was blocked by H89 in CCLP1 cells3 讨论PGE2是由活化的环氧合酶-2（COX-2）催化花生四烯酸而形成的，PGE2被人们广泛认为是一种介导炎症反应的物质，但除此之外它可能还具有其它一些更为复杂的作用。PGE2通过与细胞膜表面的四种EP受体相偶联，而发挥调控细胞内cAMP水平、钙离子浓度及磷脂酰肌醇激活等的作用7

31、。通过大鼠和人胚肾细胞EP受体转染实验8 ,人们推测4种EP受体可能各自通过以下信号转导途径发挥作用: EP1受体与G蛋白的Gq部分偶联, 通过提高细胞内Ca2+和激活蛋白激酶C( PKC) 而发挥作用; EP3受体与G蛋白的Gi部分偶联, 通过抑制腺苷酸环化酶（AC）的活性而发挥作用; EP2和EP4受体都与G蛋白的Gs部分偶联, 通过激活腺苷酸环化酶/促进cAMP生成/激活蛋白激酶A( PKA) /使糖原合成激酶-3(GSK-3) 磷酸化失活而发挥作用.根据上述推测，EP2受体通过激活腺苷酸环化酶而促进cAMP生成，cAMP作为第二信使，进一步激活蛋白激酶A(PKA)，活化的PKA可催化c

32、AMP应答元件结合蛋白（CREB）中的Ser133磷酸化，从而使CREB蛋白磷酸化9。但是磷酸化的CREB蛋白能否调节人肝癌细胞特别是CCLPI细胞中SnoN蛋白的水平目前还不十分清楚。早期人们对SnoN蛋白的认识是从Ski蛋白开始的，那时人们发现一种蛋白的基因序列中有很多序列和Ski蛋白同源，将之命名为SnoN蛋白。SnoN比Ski的发现稍晚。很久以来，人们知道Ski/ SnoN 是癌基因，但究竟两者如何引起细胞转化一直不清楚。直到1999年底，才发现他们是通过与smads蛋白作用，进而调节TGF-smads信号通路。后来的研究表明：在SnoN蛋白中存在着两个重要的结合的区域：一个是与TGF-信号通路中smads蛋白结合的区域，并测得该区域SnoN蛋白结构域是684aa10。另一个区域是与CREB蛋白结合的区域，该区域位于SnoN蛋白