T载体与目的基因连接.docx

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T载体与目的基因连接

T载体与目的基因连接

一.重组质粒的构建T质粒载体

　　重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

　　DNA连接酶有两种：

T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。

两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。

但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：

首先，T4DNA连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

连接反应通常将两个不同大小的片断相连。

　　很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。

pUCm-T载体是一种已经线性化的

编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS）,它并不影响lacZ的表达。

另外，常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段），的编码序列。

在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。

只有当携带α肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物IPTG的诱导下，载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶N端（α肽段），这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段）互补，形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。

　　而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后，会造成lacZ基因不能表达，从而不能合成β—半乳糖核苷酶；而对于空载体，lacZ基因正常表达，通过α互补合成β—半乳糖核苷酶，分解培养基里的色素底物X-gal，最终形成蓝色的化合物，出现蓝色菌斑。

实验准备：

清洗，5个100ml锥形瓶（外加1个小的），6副培养皿，3个小试剂瓶，接种环，涂布棒。

准备100ml超纯水。

溶液:

LB300ml（液体50ml+50ml，固体100ml），0.1mol/LCaCl210ml，100mg/mlAmp1ml，20mg/mlX-gal1ml，200mg/mlIPTG1ml。

大肠杆菌菌液1ml。

感受态细胞

连接产物

4管

4x5=20ul做4份

目的基因

T载体

T4连接酶

10x冲液

4x4uL

4x1uL

4x0.5uL

4x1uL

　　灭菌：

5个100ml锥形瓶（外加1个小的），6副培养皿，3个小试剂瓶，接种环，涂布棒，10ml超纯水，LB培养基，1.5mlEP管，大小枪头，过滤用具2副，，0.1mol/LCaCl2

实际配置　20mg/mlX-galX-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。

用二基甲酰胺（DMF）溶解X-gal配制成的20mg/ml（取0.02gX-gal，用DMF定容为1ml）的贮存液。

保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20℃。

X-gal溶液无须过滤除菌。

（DMF二甲基甲酰胺;Dimethylformamide;N,N-Dimethylformamide;DMF;CAS：

68-12-2　理化性质:

无色、淡的胺味的液体。

分子式C3-H7-N-O。

分子量73.10。

相对密度0.9445（25℃）。

熔点-61℃。

沸点152.8℃。

）溶于DMSO，溶解度可达20mg/ml。

也溶于DMF溶于DMSO，溶解度可达20mg/ml。

也溶于DMF

　　200mg/mlIPTG在0.8ml蒸馏水中溶解0.2gIPTG后，用蒸馏水定容至1ml，用0.22μm滤器过滤除菌，贮存于-20℃。

　　LB培养基：

　　配制每升培养基,应该在950ml去离子水中加入:

胰化蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.3.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.（100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉为固体培养基）

　　0.1mol/LCaCl2：

取0.11098g氯化钙固体定容至10ml

　　Amp（100mg/ml）：

溶解0.1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至1ml，用0.22μm滤膜过滤除菌.

实验过程

（一）.目的基因片段与载体连接

　　器材

　　旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。

　　试剂

　　T载体，T4DNA连接酶，连接酶缓冲液，无菌ddWater。

　　操作步骤

　　PCR产物与T载体直接连接：

（1）事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14~16°C。

（2）取4个灭菌的200ul微量离心管，加入：

（需要调整）4ml目的基因；1mlT载体；0.5mlT4DNA连接酶（TAKARA,350U/ul）；1ml连接酶缓冲液10xbuffer；3.5mlddWater，总量10ml体系。

　　（3）述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14°C干式恒温仪（或14°C水中）中保温过夜（12-16h）。

　　（4）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。

（二）.大肠杆菌感受态细胞的制备细菌转化

　　仪器：

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml微量离心管，1.5ml微量离心管，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱，滤膜和过滤器

　　试剂：

E.coli菌种，LB培养基，0.1mol/LCaCl2溶液，无菌ddWater，LB培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddwater，IPTG，X-gal。

步骤

（1）在超净工作台中，将1ml大肠杆菌菌液加入100mlLB液态培养基（不含抗菌素），37℃摇床培养过夜。

（2）取0.5ml上述菌液转接到含有50mLLB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/min摇床培养2~3h，测定OD590为0.35~0.4左右（<0.4~0.6，细胞数<108/mL，此为关键参数！

）。

（注意：

此步摇菌的时候，要有一管不加菌的LB培养液同时摇菌）

　　（3）将1ml菌液加入到4支1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm离心5min。

　　（4）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。

　　（5）4℃，5000rpm离心5min，弃上清液后，用100μL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂悬，插入冰中放置2h，可以直接用作转化实验，或立即放入-4摄氏度冰柜中保藏。

　　（6）事先将恒温水浴的温度调到42℃。

　　（7）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μL）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。

　　（8）加入5μL连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。

　　（9）轻轻摇匀后插入42℃水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3min。

　　（10）在超净工作台中向上述各管中分别加入300μLLB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h。

　　（11）在超净工作台中取上述转化混合液200μL，分别滴到含合适抗菌素（Amp100ug/L）的固体LB平板培养皿中，再在平板上滴加40μL20mg/mlX-gal，7μL200mg/mlIPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：

一个不含抗生素作为对照组，玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂，菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。

）。

　　（12）在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。

　　（13）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。

　　（14）观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。

注意白色菌斑。

（三）.转化克隆的筛选和鉴定

　　器材旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。

　　试剂LB培养基（加抗菌素），PCR用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液，65%甘油（65%甘油，0.1mol/LMgSO4，0.025mol/LTrisClpH8.0）。

操作步骤方法一：

快速PCR筛选法

（1）在转化的平板培养基上随机选取4个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。

（2）在0.2mlPCR微量离心管中配制25μl反应体系。

　　ddwater16μl

　　10×PCRbuffer（不含MgCl2）2.5μl

　　25mMMgCl21.5μl

　　2.5mmol/LdNTP2μl（每种dNTP终浓度0.2mM）

　　10μmol/LPrimer11μl（12.5—25pmoles）

　　10μmol/Lprimer21μl（12.5—25pmoles）

　　模板质粒用小tip头轻轻粘一下选中的白色菌落，再伸入PCR混合液中洗一洗

　　Taq酶0.5μl（1.5u）

　　总体积25μl

（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序（本实验室已经设置为WZ）：

①94℃5min②94℃1min③60℃1min④72℃1min50s⑤goto②29times⑥72℃10min

（2）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳（与原始插入片断同时比对）。

观察胶上是否有预计的主要产物带。

　　（3）按照编号找到培养皿中的原菌斑。

根据需要进行放大培养提取其质粒

　　（4）提取到的质粒与原先的空载体（或已知分子量的质粒）再对比电泳，以进一步确认。

　　方法二：

提质粒再PCR或酶切鉴定

（1）在超净工作台中取3支无菌摇菌管，各加入3mLLB（含50mg/mL氨苄青霉素），用记号笔写好编号。

（2）在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。

用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有3mLLB（含50mg/mL氨苄青霉素）的摇菌管中。

用此法随机取3个白色菌落，分别装入3个摇菌管中。

　　（3）37℃摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。

摇菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。

　　（4）提取到的3管质粒样品可用PCR法扩增，或用酶切电泳法来鉴定其上是否含有外源插入片断（方法见有关实验）。

　　（5）将经过鉴定判断为正确的质粒保存。

按照编号找到冰箱中原菌液。

根据需要进行放大培养提取其质粒或进行诱导表达，或取500mL菌液与500mL65%甘油混