第一讲 基因工程.docx
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第一讲基因工程
第一讲 基因工程（教材专题1）
一、基因工程的概念
基因工程的别名
基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境
生物体外
操作对象
基因
操作水平
DNA分子水平
基本过程
剪切——拼接——导入——表达
结果
人类需要的基因产物
二、DNA重组技术的基本工具
1．“分子手术刀”又叫基因剪刀——限制性核酸内切酶
（1）来源：
主要从原核生物中分离。
（2）作用特点：
特异性，即识别特定的核苷酸序列，切割特定的切点（切割磷酸二酯键）。
（3）结果：
产生黏性末端或平末端。
2．“分子缝合针”又叫基因针线——DNA连接酶
（1）种类和本质：
E·coliDNA连接酶与T4DNA连接酶，均为蛋白质。
（2）功能上的相同点：
均可催化形成磷酸二酯键。
（3）功能不同点：
T4DNA连接酶可“缝合”黏性末端和平末端，E·coli_DNA连接酶则只能缝合“黏性末端”，不能缝合平末端。
3．“分子运输车”又叫基因的运输工具——基因进入受体细胞的载体
（1）作用：
将外源基因送入受体细胞。
（2）具备的条件：
能在宿主细胞内复制并稳定地保存；具有多个限制酶切点；具有某些标记基因。
（3）种类：
质粒、噬菌体和动植物病毒。
（4）质粒的特点：
①质粒是基因工程中最常用的运载体。
②最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。
③化学本质是小型环状DNA分子。
三、基因工程的基本操作程序
1．目的基因的获取
（1）目的基因：
主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
（2）获取方法：
①从基因文库中获取；
②利用PCR技术扩增目的基因；
③通过DNA合成仪用化学方法直接合成。
2．基因表达载体的构建
（1）基因表达载体的构建是基因工程的第二步，也是基因工程的核心。
（2）基因表达载体的组成：
除目的基因外，还必须有启动子、终止子和标记基因等。
①启动子：
是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。
②标记基因的作用：
鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含目的基因的细胞筛选出来。
3．将目的基因导入受体细胞
（1）转化：
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
（2）常用方法：
①植物最常用：
农杆菌转化法，其次为基因枪法、花粉管通道法。
②动物：
最常用显微注射法，其受体细胞通常为受精卵。
③微生物：
感受态细胞法，需用Ca2＋处理细胞。
4．目的基因的检测和鉴定
（1）首先要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因。
（2）其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA。
（3）最后检测目的基因是否翻译出了蛋白质。
（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。
四、基因工程的应用与蛋白质工程
1．基因工程的应用
技术名称
应用
动物基因工程
提高动物生长速度来提高产品产量；改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体
植物基因工程
培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质
基因治疗
把正常基因导入病人体内，使其表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，分为体内基因治疗和体外基因治疗
2.蛋白质工程
（1）根据蛋白质工程的概念，关注两方面的内容：
①蛋白质工程的基础：
基因工程。
②蛋白质工程的目标是：
根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。
（2）蛋白质工程的手段：
对蛋白质的结构进行设计改造，最终必须通过基因来完成。
（3）蛋白质工程的基本途径：
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到或合成相应的脱氧核苷酸序列（基因）。
考点一
DNA重组技术的基本工具（Ⅱ）
考情解读
三种基本工具的作用涉及基因工程操作程序的关键步骤，近几年高考考查的频率较高，考查内容包括工具酶类型、实质及作用，运载体作用及特点等，预计今后高考仍可能对各类型操作工具的作用及特点结合图形予以考查。
[做一题]
[例1] （2012·新课标全国卷）根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
（1）限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。
（2）质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：
AATTC……G
G……CTTAA
为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是________________________________________
___________________________________________________________________________。
（3）按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。
（4）反转录作用的模板是________，产物是________。
若要在体外获得大量反转录产物，常采用________技术。
（5）基因工程中除质粒外，________________和________________也可作为运载体。
（6）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是________________________。
[解析]
（1）DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种——黏性末端和平末端。
（2）为了保证目的基因与运载体相连，用另一种限制酶切割后形成的黏性末端必须与EcoRⅠ切割形成的黏性末端相同。
（3）DNA连接酶有大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶两类。
（4）反转录的模板是mRNA，产物是DNA。
大量扩增反转录产物常采用PCR技术。
（5）在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。
（6）经Ca2＋处理后处于感受态的大肠杆菌才易吸收周围环境中的DNA分子。
[答案]
（1）黏性末端 平末端
（2）切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同（其他合理答案也可） （3）大肠杆菌 T4 （4）mRNA（或RNA） cDNA（或DNA） PCR （5）噬菌体 动植物病毒（其他合理答案也可） （6）未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱（其他合理答案也可）
[链一串]
1．正确界定几种关键酶
种类
项目
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
解旋酶
作用
底物
DNA分子
DNA分子片段
脱氧核苷酸
DNA分子
作用
部位
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对间的氢键
作用
特点
切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并在特定位点进行切割
将双链DNA分子片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上
将DNA分子两条链之间的氢键打开
作用
结果
形成黏性末端或平末端
形成重组
DNA分子
形成新的
DNA分子
形成单链
DNA分子
2．限制酶两种作用结果比较
DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端（如下图所示）。
当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。
3．基因工程中“分子运输车”——载体的必备条件
（1）对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动；
（2）具标记基因，能对重组DNA是否进入受体细胞进行鉴定；
（3）能自我复制，通过复制进行基因扩增；
（4）具有多个酶切位点，供外源基因插入其中，而且每种酶切位点最好只有一个，避免酶切后环状DNA打开，丢失某些片段。
[关键一点]
（1）限制酶与DNA连接酶可存在如下关系：
（2）限制酶不切割自身DNA，原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
（3）DNA连接酶起作用时不需要模板，DNA聚合酶起作用时则需模板。
（4）为使目的基因与载体形成相同的DNA片段末端以便连接，通常使用同一种限制酶将二者切割，但如果不同限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系时，则两末端也可连接。
[通一类]
1．科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆菌的质粒DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功表达。
图示a处为胰岛素基因与大肠杆菌质粒DNA结合的位置，它们彼此能结合的依据是（ ）
A．基因自由组合定律
B．半保留复制原则
C．基因分离定律
D．碱基互补配对原则
解析：
选D 胰岛素基因与大肠杆菌质粒DNA的黏性末端的碱基必须互补配对才能结合在一起。
2.右图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题。
（1）a代表的物质和质粒的化学本质都是________，二者还具有其他共同点，如①____________，②____________（写出两条即可）。
（2）若质粒DNA分子的切割末端为
，则与之连接的目的基因切割末端应为__________；可使用________把质粒和目的基因连接在一起。
（3）氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为________，其作用是____________________________________________________________。
（4）下列常在基因工程中用作载体的是（ ）
A．苏云金芽孢杆菌抗虫基因
B．土壤农杆菌中的RNA分子
C．大肠杆菌的质粒
D．动物细胞的染色体
答案：
（1）DNA 能够自我复制 具有遗传效应
（2）
DNA连接酶
（3）标记基因 供重组DNA的鉴定和选择
（4）C
考点二
基因工程的基本操作程序
考情解读
基因工程的基本操作程序是近几年高考的高频考点，分值比重较大，一般和其他工程结合考查，考查形式既有简答题又有选择题。
预计今后高考通过与其他工程技术综合考查学生解决实际问题的能力题目仍会出现。
[做一题]
[例2] 某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶（Amy）基因a，通过基因工程将a转移到马铃薯植物中。
经检测，Amy在成熟块茎细胞的细胞间隙中发现。
请回答：
（1）在基因工程中，a叫____________，提取它的一个必要步骤是_____________________。
它与基因运载工具________结合前还必须经过的处理步骤是__________________________。
（2）Amy在成熟块茎细胞间隙中的发现，说明细菌的基因a已整合到上图中的[ ]________或[ ]________结构中。
（3）合成Amy的过程分为转录和翻译两大步骤，Amy合成并分泌到细胞外，定位在细胞间隙中，参与该过程的细胞器有[ ]________________________________________。
（4）Amy的基本组成单位是__________，各组成单位间靠________相连。
（5）以本图比作马铃薯块茎的成熟细胞时该图多画了[ ]__________________________。
[解析] 本题主要是把基因工程与细胞的一些基础知识相结合在一起了，巩固了目的基因的提取，基因运载工具，转录与翻译，细胞的结构与功能等基础知识。
（1）耐高温淀粉酶（Amy）基因a为目的基因，提取目的基因时要用限制酶切割，并用同种限制酶切割运载体。
（2）细菌的基因能整合到此图的细胞核DNA上和线粒体的DNA上。
（3）耐高温淀粉酶（Amy）为分泌蛋白，其形成过程依次经过了核糖体，内质网，高尔基体，此过程需要线粒体提供能量。
（4）此酶的本质是蛋白质，基本组成单位是氨基酸，氨基酸脱水缩合形成肽键。
（5）马铃薯块茎不能进行光合作用，所以不存在叶绿体。
[答案]
（1）目的基因 用限制酶切出黏性末端 运载体 用限制酶使质粒露出黏性末端
（2）⑤ 细胞核 ⑧ 线粒体
（3）⑦⑥④⑧ 核糖体、内质网、高尔基体、线粒体
（4）氨基酸 肽键
（5）③ 叶绿体
[链一串]
1．目的基因的获取
（1）直接分离：
从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取。
（2）人工合成目的基因的常用方法：
①已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。
②以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成。
（3）利用PCR技术扩增目的基因：
①原理：
DNA双链复制。
②条件：
模板、四种游离的脱氧核苷酸；热稳定的DNA聚合酶、引物等。
③过程：
加热至90～95℃，DNA解链→冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链→加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。
2．基因表达载体的构建
（1）目的：
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，并使目的基因能够表达和发挥作用。
（2）
（3）构建步骤：
3．将目的基因导入受体细胞
生物种类
植物
动物
微生物
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
感受态细胞法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入到Ti质粒的T DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合吸收DNA感受态细胞分子
4.目的基因的检测和鉴定
类型
步骤
检测内容
方法
结果
分
子
检
测
第
一
步
目的基因是否进入受体细胞
DNA分子杂交技术（DNA和DNA之间）
是否成功显示出杂交带
第
二
步
目的基因是否转录出信使RNA
分子杂交技术（DNA和RNA之间）
第
三
步
目的基因是否翻译出蛋白质
抗原－抗体杂交方法
个体水平检测
包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等
[通一类]
3．下列有关基因工程操作的叙述正确的是（ ）
A．用同种限制性核酸内切酶切割运载体与目的基因可获得相同的黏性末端（平末端）
B．以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同
C．检测到受体细胞含有目的基因就标志着基因工程操作的成功
D．用含抗生素抗性基因的质粒作为运载体是因为其抗性基因便于与外源基因连接
解析：
选A 一种氨基酸可对应多个密码子，以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列可能不同。
只有目的基因在受体细胞中成功表达才标志着基因工程操作的成功。
用含抗生素抗性基因的质粒作为运载体，是因为抗性基因作为标记基因可检测载体是否导入到受体细胞中。
4．（2012·海南高考）已知甲种农作物因受到乙种昆虫危害而减产，乙种昆虫食用某种原核生物分泌的丙种蛋白质后死亡。
因此，可将丙种蛋白质基因转入到甲种农作物体内，使甲种农作物获得抗乙种昆虫危害的能力。
回答下列问题：
（1）为了获得丙种蛋白质的基因，在已知丙种蛋白质氨基酸序列的基础上，推测出丙种蛋白质的________序列，据此可利用________方法合成目的基因。
获得丙中蛋白质的基因还可用________、________方法。
（2）在利用上述丙种蛋白质基因和质粒载体构建重组质粒的过程中，常需使用________酶和________酶。
（3）将含有重组质粒的农杆菌与甲种农作物的愈伤组织共培养，筛选出含有丙种蛋白质的愈伤组织，由该愈伤组织培养成的再生植株可抵抗________的危害。
（4）若用含有重组质粒的农杆菌直接感染甲种农作物植株叶片伤口，则该植株的种子________（填“含有”或“不含”）丙种蛋白质基因。
解析：
（1）在已知蛋白质的氨基酸序列的情况下，可根据氨基酸和碱基的对应关系，推出合成该蛋白质的基因序列，然后用DNA合成仪通过化学方法来合成目的基因。
此外也可以从基因文库和通过PCR方法获取目的基因。
（2）构建重组质粒时，需要用限制酶将运载体切开，并用DNA连接酶将目的基因连接到运载体上，从而构建基因表达载体。
（3）愈伤组织中含有丙蛋白，说明丙蛋白的基因得到了表达，在培养成的植株体内也含有丙蛋白，乙昆虫食用丙蛋白后会死亡，则该植株可抵抗乙昆虫的危害。
（4）用含有重组质粒的农杆菌直接感染甲种农作物植株叶片伤口，仅仅在该叶片内部分细胞中能合成丙蛋白，而该植株的种子和其他的营养器官均不含有重组质粒，也就不含有丙种蛋白质的基因。
答案：
（1）基因 化学 基因文库 PCR（其他合理答案也可）
（2）限制 DNA连接 （3）乙种昆虫 （4）不含
考点三
基因工程的原理（Ⅱ）、基因工程的应用、蛋白质工程的原理及应用（Ⅰ）
考情解读
近几年高考以基因工程和蛋白质工程的成果作为背景，以大量的基因工程或蛋白质工程案例作为载体，考查基因工程和蛋白质工程的基本原理和应用。
考查形式以简答题为主，预计今后高考中可结合当今社会热点（如转基因食品，基因治疗等）或科技前沿等载体命制基因工程或蛋白质工程的应用类题目。
[做一题]
[例3] （2013·福建高考）克隆猪成功率较低，与早期胚胎细胞的异常凋亡有关。
Bcl 2基因是细胞凋亡抑制基因，用PCR技术可以检测该基因转录水平，进而了解该基因与不同胚胎时期细胞凋亡的关系。
克隆猪的培育及该基因转录水平检测流程如图。
请回答：
（1）图中重组细胞的细胞核来自________细胞，早期胚胎移入受体子宫后继续发育，经桑椹胚、囊胚和______胚最终发育为克隆猪。
（2）在PCR过程中可检测出cDNA中Bcl 2cDNA的分子数，进而计算总mRNA中Bcl 2mRNA的分子数，从而反映出Bcl 2基因的转录水平。
①图中X表示________过程。
②从基因组数据库中查询Bcl 2mRNA的核苷酸序列，以便根据这一序列设计合成________用于PCR扩增，PCR过程第一轮循环的模板是________。
[解析] 本题考查基因工程、细胞工程和胚胎工程的相关知识，意在考查理解能力和分析能力。
（1）核移植技术是将供体细胞的细胞核移植到去核的卵母细胞中，形成重组细胞的过程。
结合图形可知，图中重组细胞的细胞核来自良种猪的体细胞；早期胚胎经桑椹胚、囊胚和原肠胚，最终发育为个体。
（2）①图中X过程是mRNA反转录形成cDNA的过程。
②利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，用于PCR扩增，PCR过程第一轮循环的模板是目的基因，即Bcl 2cDNA。
[答案]
（1）体 原肠
（2）①反转录 ②引物 Bcl 2cDNA
[链一串]
（1）乳腺生物反应器：
是指将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。
受生物性别的限制，若从动物尿液中提取目的基因产物则不受性别限制。
（2）基因治疗：
是把正常的基因导入受体细胞中，以表达正常产物，从而治疗疾病，对原有细胞中存在缺陷的基因没有清除或改变，是治疗人类遗传病的根本方法，但由于尚未全面了解基因调控机制和疾病产生的分子机理，基因治疗目前只是处于初期的临床试验阶段。
（3）基因工程的目的不同，可选用的受体细胞不同。
若生产基因工程药品，受体细胞一般选用微生物，利用微生物繁殖速度快的特点，可在短期内获得大量产品。
（4）蛋白质工程与基因工程的比较：
项目
区别与联系
蛋白质工程
基因工程
原理
中心法则的逆推
人工DNA（基因）重组
区别
过程
预期的蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）
获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造、生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果
可生产自然界没有的蛋白质
只能生产自然界已有的蛋白质
联系
蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程；蛋白质工程离不开基因工程，而基因工程中所利用的某些酶也需要通过蛋白质工程进行修饰或改造，以提高其功能，因此两者是相互促进的
[通一类]
5．培育作为“生物反应器”的动物可以生产许多珍贵的医用蛋白，该动物的培育过程涉及的现代生物技术有（ ）
①基因工程 ②体外受精 ③胚胎移植 ④动物细胞培养
A．①②③ B．②③④
C．①③④D．①②③④
解析：
选D 生物反应器是指利用转基因活体动物的某种能够高效表达外源蛋白的器官或组织来进行工业化生产活性功能蛋白的技术，用于表达的生物反应器包括动物血液、乳腺等。
作为生物反应器的动物的培育过程是将目的基因导入受精卵中，将其培育到桑椹胚或囊胚阶段，再将其移入代孕动物的子宫中，使其生长发育成转基因动物，这样就能够实现动物蛋白的工业化生产。
6．下图为蛋白质工程操作的基本思路，请据图回答下列问题：
（1）代表蛋白质工程操作思路的过程是________；代表中心法则内容的是________。
（填写数字）
（2）写出图中各数字代表的生物学过程的名称或内容：
①__________；②__________；③__________；④__________；⑤__________。
（3）蛋白质工程的目的是__________，通过__________来实现。
（4）从图中可以看出蛋白质工程的基本途径与中心法则是________的。
解析：
蛋白质工程是从预期蛋白质功能开始，中心法则是从基因转录、翻译开始；蛋白质工程的目的是对蛋白质的结构进行分子设计，它是通过基因合成或基因修饰实现的，蛋白质工程的基本途径与中心法则相反。
答案：
（1）④⑤ ①②③
（2）转录 翻译 折叠 分子设计 合成DNA （3）对蛋白质的结构进行分子设计 基因合成或基因修饰 （4）相反
一、选择题
1．（2013·江苏高考）小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因（目的基因）后再重组表达。
下列相关叙述正确的是（多选）（ ）
A．设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列
B．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列
C．PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶
D．一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞
解析：
选BD 设计引物时应当考虑由此扩增的目的基因与载体两端的序列进行互补配对；PCR体系中应用耐高温的DNA聚合酶，而不是从受体细胞中提取的普通DNA聚合酶。
2．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。
下图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。
适于作为图示目的基因运载体的质粒是（ ）
解析：
选A 由图可知，质粒B上无标记基因，不适合作为运载体；质粒C和D的标记基因上都有限制性内切酶的识别位点。
质粒A有标记基因且MunⅠ的切点不在标记基因上。
3．下列关于cDNA文库和基因组文库的说法中，不正确的是（ ）
A．cDNA文库中只含有某种生物的部分基因，基因组文库中含有某种生物的全部基因
B．如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同
C．cDNA文库中的基因都没
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