蛋白质分子处于兼性离子状态时的溶液pH值称为该蛋白质的等电点（pI）。
不同的蛋白质分子有不同的等电点。
在PI时，蛋白质分子所带正、负电荷相等，净电荷为零，其溶解度低，最易沉淀析出。
偏离其pI时，蛋白质分子带有同种电荷，互相排斥，不易发生沉淀。
在一定pH值范围内，偏离其pI越远，蛋白质分子带同种电荷数越多，越不易发生沉淀。
因此，可根据蛋白质分子在溶液中的沉淀析出情况，来测定蛋白质的等电点。
【器材】
试管、试管架、刻度吸管（0.5mL、lmL、5mL）、吸耳球、记号笔。
【试剂】
1.0.01mol／L乙酸
2.0.1mol／L乙酸
3.1.0mol／L乙酸
4.5g/L酪蛋白乙酸钠溶液称取纯酪蛋白0.25g，加入蒸馏水20ml及1.0mol/LNaOH5ml，混合，至酪蛋白完全溶解。
然后加入1.0mol/L乙酸5ml，移入50ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。
【操作】
取干净试管5支，编号后，按下表操作。
试剂
1
2
3
4
5
蒸馏水（ml）
0.01mol/L乙酸（ml）
0.1mol/L乙酸（ml）
1.0mol/L乙酸（ml）
5g/L酪蛋白乙酸钠溶液（ml）
溶液PH值
沉淀结果
1.6
—
—
2.4
1.0
3.2
—
—
4.0
—
1.0
4.1
3.0
—
1.0
—
1.0
4.7
1.5
2.5
—
—
1.0
5.3
3.38
0.62
—
—
1.0
5.9
立即混匀各管，静置10分钟，观察各管沉淀情况，结果用“－，+，++，+++”表示，并记录于表中。
【思考题】
酪蛋白的等电点是多少？
实验二血清蛋白质的醋酸纤维素薄膜
电泳
【目的要求】
掌握区带电泳法的原理及应用。
【原理】
胶体颗粒在外加电场的作用下，朝着与其所荷电荷符号相反的电极移动，这种现象称为电泳。
血清中各种蛋白质各有其特定的等点电。
将这些蛋白质置于pH高于其等点电的溶液中，则它们将携带负电荷，在外加电场下，向正极移动。
由于血清中各种蛋白质的等电点不同，分子的大小不同，所以在同一电场中的泳动速度也不同。
蛋白质分子小、携带电荷多者移动速度快；分子大、携带电荷少者移动速度慢。
因此可以利用电泳方法将血清中的各种蛋白质分开。
醋酸纤维素薄膜作为支持介质，具有电渗小、分离速度快、区带清晰、操作简单等优点。
酸酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白分为：
清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白等5条区带。
固定染色之后，可看到清晰的色带，还可用光密度计扫描进行定量测定，计算出各种蛋白的构成百分比。
【操作】
1.准备与点样
（1）将缓冲液加入电泳槽的两槽内，并使两槽的液面等高。
（2）将薄膜切成2×8厘米的小条。
在薄膜无光泽面距一端1.5厘米处用铅笔划一横线，表示点样位置。
然后将薄膜在巴比妥缓冲液中浸泡。
（3）将充分浸透缓冲液的薄膜条取出，夹于洁净的滤纸中间吸去缓冲液，将薄膜条展平。
用盖玻片边缘蘸取少量血清样品，平直的印于点样线上，稍停3—5秒，使血清渗入薄膜，点样力求均匀，但不要靠近薄膜边缘。
2.电泳
将点样后的薄膜条置于电泳槽架上，放置时，无光泽面（即点样面）向下，点样端置于阴极。
薄膜在槽架上绷紧，用三四层滤纸压在膜条上，使之与缓冲液连通。
滤纸与薄膜应充分贴紧。
平衡5—10分钟后通电。
应用电压在90—150V之间，电势梯度约10V/cm；电流约0.1—0.5mA/cm（此点需灵活掌握）时间约需1小时左右。
3.染色
通电完毕后，用镊子将薄膜取出，直接浸于氨基黑10B染色液中，染5分钟取出，立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止。
用滤纸吸干薄膜，此时可见五条色带。
4.定量
在用光密度计扫描前，必须先将醋酸纤维薄膜透明。
透明的方法很多，这里介绍一种最常用的方法。
电泳后，染色并漂洗干净之后。
待薄膜完全干燥，浸入透明液中约3—5分钟，取出，平贴于玻璃板上。
玻璃板必须干净，贴时应排出空气，待完全干燥后即可轻轻揭下。
还有一种透明方法；不必将薄膜浸入透明液，将薄膜展开于玻璃板上，用吸管吸取透明液，逐滴加于膜上，待完全加匀后，轻压薄膜排除空气，将玻板竖起放置，使多余的透明液流去，待干燥后轻轻揭下即可。
此膜可用于光密度计扫描，亦可永久保存，扫描仪多种多样，但原理基本相同。
可按各该仪器说明进行。
如作定量分析，则将薄膜水分吸干燥后，按次序剪下各条色带区及一空白带，分别浸入盛有0.4NNaOH的试管中（清蛋白管加4毫升，其余各管加2毫升）。
放入37℃水浴中15分钟，振摇数次，使色带全部洗脱下来，然后用580nm或绿色滤光板比色，读取吸光度A值。
根据测得读数，按下法计算：
各部分蛋白质的百分比（％）
α2、β、γ的计算依次类推：
T=清A×2＋α1A＋α2A＋βA＋γA
【临床意义】
正常值：
清蛋白57—72％，α1球蛋白2—5％，α2球蛋白4—9％，β球蛋白6.5—12％，γ—球蛋白12—20％。
1.肾病综合症、慢性肾小球肾炎时，清蛋白降低，α2球蛋白及β—球蛋白升高。
2.肝硬变时，清蛋白显著下降，γ—球蛋白升高。
3.胶原性疾病时，清蛋白降低，γ—球蛋白显著增高。
【注意事项】
1.电泳完毕后正负两极缓冲液的pH发生变化，再次电泳时，应改变电场方向，即将原正极改为负极；或将正负两极电极槽内的缓冲液混合之后，再分别倒入电泳槽中。
2.两侧电泳槽液面应保持在同一水平面。
否则，液体通过薄膜有虹吸现象，会影响蛋白质的泳动速度。
3.电泳失败的原因：
（1）电泳图谱不整齐，可能的原因有：
点样不均匀；薄膜未完全浸透；或温度过高使膜面局部干燥或水分蒸发；缓冲液变质；电泳时薄膜未放正，电流方向与膜方向不平行。
（2）各组分分离不佳，可能的原因是：
点样过多；电流过小；薄膜结构过分细密，透水性差，导电性差。
（3）染色后，清蛋白中部着色浅：
可能由于染色时间不足；染色液陈旧；或蛋白含量过高。
（4）透明膜上有气泡：
玻片上有油脂；贴膜时，有气泡。
【试剂】
1.巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.06）：
称取巴比妥1.84克、巴比妥钠10.3克于500毫升蒸馏水中加热溶解，冷至室温后再用蒸馏水稀释至1000毫升。
2.氨基黑10B染色液：
称取氨基黑10B0.1克溶于无水乙醇20毫升中，加冰醋酸5毫升，甘油0.5毫升，使溶解，然后将磺基水杨酸2.5克溶于少量蒸馏水中，加到前液中，以蒸馏水补充至100毫升。
3.漂洗液：
甲醇45毫升、冰醋酸5毫升和蒸馏水50毫升混匀。
4.透明液：
冰醋酸25毫升，无水乙醇75毫升，混匀。
实验三血清淀粉酶活性测定—稀释法
【目的】
了解本实验的原理及方法，能正确地进行各项操作；了解血清淀粉酶活性测定的临床意义。
【原理】
淀粉在淀粉酶催化下，首先生成糊精，其最终产物是麦芽糖和葡萄糖。
向反应体系中加入碘液可检查淀粉的水解程度，淀粉与碘呈蓝色，麦芽糖遇碘不显色。
将标本（血清）做一系列的稀释，使之催化淀粉水解，加入碘液后，以不显蓝紫色之标本最高稀释倍数乘以2，作为血清淀粉酶活性单位。
【试剂】
1.1%NaCL
2.淀粉溶液（1mg/mL）
3.革兰氏碘液：
取碘化钾2g溶解于少量蒸馏水中，再加碘1g，溶解后以水稀释至300Ml,密闭保存。
【实验操作】
1.取10支试管，分别加入1%NaCl溶液1.0ml；
2.向第1支试管内加入血清1.0ml，混匀后吸取1.0ml加入第2支试管，混匀后吸取1.0ml加入第3支试管，再混匀后吸取1.0ml加入第4支试管，依此类推，直至第9支试管，混匀后吸取1.0ml弃去，第10支试管不加血清；
3.向每支试管各加2ml淀粉溶液，混匀后置于370C水裕箱中保温30分钟；
4.取出试管，向每支试管各加1滴碘液，摇匀，立即观察结果。
以不显蓝紫色之标本最高稀释倍数乘以2，作为血清淀粉酶活性单位。
【正常值】
本法以每毫升标本在37℃作用30分钟能水解1mg淀粉的酶活力作为1单位（温氏）。
血清（浆）正常参考值8-64单位（温氏）。
【临床意义】
淀粉酶主要由唾液腺和胰腺分泌，当唾液腺堵塞特别是急性胰腺炎是时，血和尿中的淀粉酶可显著增高，一般认为，在急性胰腺炎发病的8-12小时开始升高。
其它如胰腺癌、胰腺外伤、胆石症、胆囊炎，总胆管阻塞以及溃疡病穿孔等均可增高。
正常人血清淀粉酶主要由肝产生，故减低见于某些肝硬化，肝炎等肝病。
实验四酵母核酸的提取与鉴定
【目的要求】
了解核酸的提取方法及其理化性质。
【原理】
核酸可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到核酸制品。
RNA与DNA均可被硫酸水解，产生磷酸、含氮碱（嘌岭和嘧啶）和戊糖（核糖和脱氧核糖）。
RNA中含核糖，DNA中含脱氧核糖。
以上三类物质可用下述方法进行鉴定：
（1）磷酸可与钼酸铵作用生成磷钼酸，后者在还原剂氨基萘酚磷酸（或维生素C）作用下生成钼兰（蓝色）。
（2）嘌呤碱可与硝酸银作用产生灰褐色絮状的嘌呤银化含物。
（3）核糖与浓盐酸或浓硫酸作用可生成糠醛。
后者能和3，5-二羟基甲苯缩合而显绿色。
脱氧核糖与浓酸反应生成ω—羟基Y-酮基戊醛，它和二苯胺作用生成蓝色化合物。
管号
水解液
5％硫酸
浓氨水
5％硝酸银
测定管
20滴
——
数滴使呈碱性
10滴
对照管
——
10滴
数滴使呈碱性
10滴
1.核酸的提取：
置1克干酵母于50毫升锥形瓶中，加2克/升NaOH溶液10毫升，沸水浴中加热30分钟，并经常搅拌。
待冷却后，加醋酸数滴，使提取液呈酸性（石蕊试纸），离心10-15分钟（4000rpm）。
将上清液倒入锥形瓶中，加95％乙醇5毫升，边加边搅。
加毕，静置。
待完全沉淀，离心10分钟，即可得到核酸钠的白色沉淀。
2.核酸的水解：
在含有核酸钠的离心管中加入5％H2SO44毫升，用玻棒搅匀，在沸水浴中加热15分钟即可。
3.取水解液进行RNA与DNA成分的鉴定。
嘌呤碱的鉴定：
取试管两支，分别标明测定管和对照管，依次加入下列各试剂；
加入硝酸银后，观察变化。
静置15分钟后，再比较两管中的沉淀。
磷酸的鉴定：
取试管两支，分别标明测定管和对照管，然后依次加入下列各试剂：
管号
水解液
5％硫酸
钼酸铵试剂
氨基萘酚磺酸
测定管
10滴
——
5滴
20滴
对照管
——
10滴
5滴
20滴
核糖的鉴定：
取试管两支分别标明测定管和对照管，然后依次加入下
列各试剂：
管号
水解液
5％硫酸
3，5-二羟基甲苯试剂
测定管
4滴
——
6滴
对照管
——
4滴
6滴
将两管放入沸水浴中，加热10分钟，比较两管之颜色。
脱氧核糖的鉴定：
取试管两支分别标明测定管和对照管，然后依次加入下列各试剂：
管号
水解液
5％硫酸
二苯胺试剂
测定管
20滴
——
30滴
对照管
——
20滴
30滴
【试剂】
1.钼酸铵试剂：
20毫升水中溶解2.5克钼酸铵，加5摩尔/升（10N）硫酸30毫升用水稀释至100毫升，此试剂在冷处可保存1个月不变。
2.氨基萘酚磺酸：
商品氨基萘酚磺酸（1，2，4-Aminonaphthol-sulfonicacid）为暗红色。
可纯化如下：
在100毫升热水（90℃）中溶解15克NaHSO3及1克Na2SO3，加1.5克商品氨基萘酚磺酸，搅匀，使大部分溶解，（仅少部分杂质不溶）乘热过滤，迅速使滤液冷却。
加1毫升浓盐酸（12N），则有白色氨基萘酚磺酸沉淀析出。
过滤，并用水洗涤沉淀数次。
再用乙醇洗涤至纯白色为止。
最后用乙醚洗涤，并将固体放置暗处，使乙醚挥发。
将此纯化的氨基萘酚磺酸保存于棕色瓶中。
取195毫升15％NaHSO3溶液（溶液必须透明），加入0.5克纯化的氨基萘酚磺酸及20％Na2SO3溶液5毫升。
并在热水手中搅拌使固体溶解（如不溶解，可再加20％Na2SO3溶液，每次加入量以1毫升为限，不溶可再加，不可过量。
），此为浓溶液，置冷处可保存2～3周。
如颜色变黄须重新配制。
临用时，将上述浓溶液以蒸馏水稀释10倍。
3.二苯胺试剂：
取1克纯二苯胺溶于100毫升重蒸的冰醋酸中；加入2.75毫升浓硫酸，放在棕色瓶中。
此试剂需临时配制。
4.3，5-二羟基甲苯试剂：
取比重1.19盐酸100毫升，加入FeCl3·6H2O100毫克及3，5-二羟基甲苯100毫克，混匀溶解后，置棕色瓶中，此试剂必须在临用前配制。
市售的二羟基甲苯不可直接用，必须用苯重结晶1～2次，并用活性炭脱色，方可使用。
5.5％硫酸。
6.浓氨水。
7.5%AgNO3：
取5gAgNO3加蒸馏水并稀释至100mL，于棕色瓶避光保存。
实验五影响酶活性的因素
【目的要求】
通过实验，了解温度、pH、激动剂和抑制剂等因素对酶活性的影响。
一、温度对酶活性的影响
【原理】
温度对酶的活性有显著影响。
温度降低，酶促反应速度减慢或停止。
温度升高，反应速度加快，当上升至某一温度时，酶促反应速度达最大值，此温度称为酶的最适温度。
温度继续升高，反应速度迅速下降。
人体内大多数酶的最适温度为37℃左右。
体外实验，酶的最适温度随反应时间而异，温度愈高，酶蛋白变性愈重，至80℃时，酶活性几乎完全丧失。
本实验以唾液淀粉酶为例。
唾液淀粉酶催化淀粉水解生成各种糊精和麦芽糖。
（C6H10O5）n→（C6H10O5）m→qC12H22O11（n>m）
淀粉糊精麦芽糖
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