创面修复肉芽组织血管生成中周细胞的观测.docx

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创面修复肉芽组织血管生成中周细胞的观测

周细胞在创面修复早期血管生成中的分布与意义

孙慧勤,冯一梅2章容1王明科2郭徳玉1阎国和2邹仲敏2

（第三军医大学：

1西南医院病理学研究所,2军事预防医学院复合伤研究所,重庆400038）

摘要：

目的：

观测及研究周细胞在创面修复肉芽组织血管生成过程中出现、分布规律与意义。

方法：

采用常规免疫组化、双重免疫组化染色，电镜技术及形态定量分析方法观测研究小鼠皮肤全层切割伤模型（1～9d），特别是早期1、3、5、7d创面修复肉芽组织内血管生成过程中，周细胞的出现、分布规律。

离体采用TGFβ1诱导分化的周细胞前体细胞10T1/2模型，观察其在细胞外基质胶立体培养的变化。

结果周细胞见于肉芽组织血管生成早期（1～7d），且周细胞阳性染色的细胞数较内皮细胞多。

肉芽组织内毛细血管和周细胞的数量在伤后持续增加，直到伤后5d达峰值。

周细胞在肉芽组织中还可形成细胞条索状、腔样结构；离体培养的周细胞在细胞外基质胶内能够形成管腔样结构。

结论周细胞参与了肉芽组织早期血管生成过程并可形成腔样结构，可能在血管生成中具有主导或引导作用。

关键词：

肉芽组织血管生成周细胞

Theroleofpericytesintheearlyangiogenesisofwoundhealing

SUNHui-qin1,FENGYi-mei2,ZHANGRong1,WANGMing-ke2,GUODe-yu1,YANGuo-he2ZOUZhong-min2（1InstituteofPathology,SouthwestHospital,2InstituteofCombinedInjury,StateKeyLaboratoryofTrauma,BurnsandCombinedInjury,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China）

AbstractObjectiveTostudythepatternofpericytepresenceanddistributioningranulationtissueofwoundrepairanditssignificance.MethodsGranulationtissuesampleswerecollectedfrommicesufferedfromfull-thicknessskinexcisionon1,3,5,7,9dayafterinjury.Singleanddoubleimmunohistochemicalstaining,electronmicroscopy,quantitativeanalysisofmorphologywereappliedtostudythepericytepresenceanddistributionduringangiogenesisofgranulationtissue.Meanwhile,invitroTGFβ1-induceddifferentiationof10T1/2cell,aprogenitorofpericyte,wasassessedin3-dimensionalECMgel.ResultsPericytesappearedintheearlystageofwoundrepair,thenumberofpericytespositivestainingwashigherthanofendothelialcellsatthenewmicrovessels.Thenumberofcapillariesandpericytesingranulationkeptincreasingtill5dayaftertheinjury.ThepericytesstimulatedwithTGFβ1wereabletoformcellcordsandclumpsinvivoandcellcord-orlumina-likestructureinECMgelinvitro.ConclusionPericytesparticipatetheearlyangiogenesisinthewoundhealingandtheformedcellcordorluminastructuremayplayacrucialorguideroleinangiogenesis.

Keywords:

granulationtissue;angiogenesis,pericyte

血管生成（angiogenesis）是指新生血管从周围已经存在的血管芽生出新的微血管过程，其见于许多的生理及病理过程如创面愈合、肿瘤生长等，并在其中发挥了重要作用[1]。

微血管主要由内衬的内皮细胞和外围的周细胞组成，血管生成涉及这两种细胞的分化、增殖、迁移和共同作用等重要过程，长期以来研究的焦点主要在于内皮细胞，对微血管壁另一细胞组分的周细胞则并未加重视。

近年来随着更多周细胞标记物的发现与应用，周细胞在血管发育、稳定、成熟和塑型等方面的研究得以深入，其作用和意义也逐步引起关注，特别是在血管生成中的作用越来越受到重视（2-4），一些研究发现周细胞见于新生血管芽，提示周细胞在血管生成早期就发挥重要乃至主导作用（5,6）。

本文拟通过小鼠创面修复模型血管生成过程中周细胞出现及分布规律的观测，结合离体培养的周细胞模型的观测，探讨周细胞在血管生成中的作用。

1材料和方法

1.1小鼠皮肤切割伤修复模型复制,参照本校复合伤研究所的常规方法进行：

雄性健康昆明种小鼠（4周龄，购自本校动物中心），体质量（20±2.5）g。

小鼠以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（30mg/kg体质量），背部剃毛，酒精消毒，于背部沿身体长轴作一长约1.5cm的皮肤全层切口，压迫止血、对合创口。

术后置于干净笼內正常喂饲，注意观察记录创面出血和全身状况。

于伤后1、3、5、7、9d时相点取材，每时相点5只小鼠。

取材时沿离创缘2mm处环形切取组织，并分别于10%福尔马林，4％多聚甲醛及戊二醛液中固定。

1.2常规组织学

组织经10%福尔马林固定，进行常规石蜡包埋,行4～5μm切片，HE染色。

1.3免疫组化

采用石蜡包埋标本进行连续5μm切片，脱蜡至水,按本室常规免疫组化方法进行。

部分标本采用4％多聚甲醛固定4h,20%蔗糖过夜，OCT包埋,-20°C保存。

连续切片5μm,空气中干燥，－80°C保存。

染色前，冰丙酮固定15min。

1.3.1CD34、CD31及SMA免疫组化染色

每个标本各选取上述3张5μm的连续切片，采用即用型EnVision二步法,二氨基联苯胺（DAB）显色,苏木精对比染色行免疫组织化学染色。

选用抗体:

CD31（即用型，上海长岛公司）、CD34（即用型，迈新公司）、SMA（1:

100，基因公司）。

阳性结果判定:

抗体阳性反应呈棕黄色,CD31、CD34为细胞膜阳性、SMA为细胞浆阳性。

1.3.2CD34及SMA免疫双标染色

采用DouSPTM免疫组化双染试剂盒（福州迈新公司产品），按说明书进行CD34和SMA染色。

第一抗体分别为小鼠抗CD34单克隆抗体（即用型，福建迈新生物科技公司），兔抗SMA多克隆抗体（1:

100基因公司）。

阳性结果判定:

第一个一抗（CD34）阳性反应呈蓝黑色,细胞膜着色；第二个一抗（SMA）阳性反应呈红色，细胞浆着色。

1.3.3新生微血管密度、周细胞分布及数目的测定

微血管计数：

首先在100×视野下选择计数部位，然后在×400视野下计数CD34或CD31阳性血管数，单个内皮细胞作为一个计数单位，不以是否形成管腔或管腔内有无红细胞作为计数标准；然后计数SMA染色表达阳性周细胞数．残存血管及管腔直径>8个红细胞者不计数，每例选择4个不重复视野计数，然后计算单位视野（×400）的平均血管数．即间质微血管密度（MicrovasscularDensity，MVD）及平均周细胞数（PericyteNumber，PN），结果用均数±标准差（Mean±SD）表示。

1.4电镜

组织以3%戊二醛磷酸缓冲液固定，经0.2mol/L蔗糖磷酸缓冲液漂洗，1%锇酸后固定，梯度丙酮脱水，环氧树脂618包埋，半薄切片定位，超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双重电子染色，在JEM-2000EX型透射电镜下观察、照像。

1.5细胞培养

周细胞激活、分化的离体模型：

采用已认可的周细胞的前体细胞10T1/2由TGF-β1激活分化为周细胞的模型[7,8]。

10T1/2（mousemesenchymalcells，AmericanTypeCultureCollection,No.CCL226,由第三军医大学复合伤研究所保存），在含TGF-β1（达科为公司,5ng/ml）的10%FBSDMEM液作用3d后进行SMA（Santacruz1:

50）、NG2（Santacruz1:

50）的免疫荧光染色以及成型实验。

成型实验：

ECM胶（Sigma公司产品）的制备（参照说明进行），

参照本室建立方法[9]进行：

按105个/ml的量传入分化的10T1/2细胞于铺有ECM胶的12孔培养板（0.5ml/孔），补加含TGF-β1（5ng/ml）的10%FBSDMEM液至2ml/孔，逐日观察记录细胞管腔样结构形成情况。

管腔样结构数目测定：

随机计数2d时每一视野（×100）内的管腔结构，每孔计数10个视野，每组3孔。

1.6数据统计分析

数据结果用均数±标准差（Mean±SD）表示，用t检验比较组间差异。

2　结果

2.1一般组织学观察

损伤后1d创面主要为渗出和出血，局部组织变性坏死、大量中性白细胞为主的炎细胞浸润。

3、5d时有大量肉芽组织生长，血管生成活跃，其中以5d时血管生成最明显，在新生的血管间可见较多的梭形细胞，散在分布，有的则形成条索状、簇状结构，这些结构中部分甚至可见腔隙。

7d肉芽组织内新生血管已较5d时减少，可见胶原增生，9d时血管减少及胶原增生较前更加明显。

2.2免疫组化染色

用免疫组化和免疫双标的方法对损伤修复模型血管生成的微血管构成进行观测，发现在新生血管中SMA阳性表达细胞多且强于内皮细胞，同时可见条索状、簇状分布的SMA阳性细胞。

2.21CD34、CD31及SMA免疫组化染色

用CD31或CD34染色标记血管内皮细胞、SMA染色标记周细胞，显示新生微血管构成、PC在新生血管中的位置、分布并测定微血管密度。

在血管生成明显的3～7d组发现，新生微血管中SMA阳性细胞显示多于CD31或CD34阳性细胞（图1）；SMA阳性细胞多位于微血管外周，符合周细胞的组织学分布特点。

SMA阳性细胞可见于新生肉芽组织中的一些点、簇状，管状和条索状结构，特别是可见与微血管相连的SMA阳性的条索状血管芽（图2），提示存在着周细胞的芽生及由周细胞单一构成的新生微血管，而单个阳性的细胞可能为早期的周细胞或肌纤维母细胞。

A：

伤后5d新生微血管周细胞SMA；B：

内皮细胞标记CD34（B）（S-P×400）

图1

↑：

图2伤后5d新生肉芽组织的SMA免疫组染色结果（S-P×200）

新生微血管周细胞SMA阳性细胞数多，间质中有呈点簇、管状和条索状结构分布的细胞