当分析者接受一项色谱分析时如何开展.docx
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当分析者接受一项色谱分析时如何开展
当分析者接受一项色谱分析时，往往会被告知具体的操作方法或条件。
如果没有现成的条件，还需要自己亲自通过实验建立方法。
一项具体的方法包括：
样品准备（溶剂、浓度），色谱柱类型，色谱柱规格，流动相组成，流速，检测器及检测条件，柱温，进样体积等等。
当某一方法被证实具有良好表现时，那么这个方法肯定是在正确的理论指导下建立的，我们完全可以根据正确的化学知识和分离知识在其他分析中建立出良好的方法。
事例一：
苯甲酸分析
色谱柱：
C18色谱柱，150*4.6mm，5微米；
流动相：
0.2%磷酸水溶液+甲醇=40+60；
流速：
1ml/min；
检测波长：
230nm；
柱温：
30摄氏度
进样体积：
10微升；
样品溶液：
以水作溶剂或流动相作溶剂。
为何选择C18？
答：
苯甲酸含有苯环，化合物具有一定程度的疏水性，十八烷基固定相对该化合物具有一定程度的保留或选择性，进而使该化合物与样品溶液中的其他化合物分离；
为何以“0.2%磷酸水溶液+甲醇”作为流动相？
答：
分离中，为保证化合物具有良好峰形，应务必保证化合物以单一形式存在，苯甲酸上的羧基具有解离性，在水溶液中会部分解离出质子，而以阴离子和分子形式存在。
只有当某一形式占总量的99%以上时，苯甲酸的峰形才能比较完美。
根据化合物的解离平衡，只有当流动相的pH值大于化合物的pKa+2或小于pKa-2时，才能满足上述条件。
苯甲酸的pKa约为4.20，所以流动相的pH应大于6.2或小于2.2，大于6.2时，苯甲酸以阴离子形式存在，小于2.2时以分子形式存在。
事例中的0.2%磷酸水溶液+甲醇则保证了苯甲酸不解离，该方法为离子抑制法。
当然若选择pH=7的中性缓冲液+甲醇，苯甲酸以阴离子形式存在，也能实现较好峰形。
正所谓“条条大道通罗马”，只要选对路就行了。
为什么选择水或流动相做样品溶剂？
答：
流动相是最好的样品溶剂，这很容易理解，只要有允许，就应用流动相溶解样品；对于反相色谱，水溶液进样也是合适的，但进样体积不应过大；务必了解，样品溶剂的洗脱强度不应明显高于流动相洗脱强度，比如流动相为10%甲醇水，样品溶剂为醇甲醇，这会造成色谱峰分叉。
检测器和检测条件选择
答：
根据化合物的吸收特性和分析要求选择，紫外-可见是最常用的检测器，当化合物具有紫外-可见吸收时应尽量选择该检测器，检测波长应通过紫外-可见扫描获得。
若紫外-可见吸收较弱，可选择其他检测器，比如示差、蒸发光闪射、质谱等等。
答：
进样后，样品溶液与流动相接触，如果二者的溶剂不一致，会出现下列两种情况：
其一，样品溶剂与流动相间存在浓度差，这个浓度差指的是溶剂浓度差（比如流动相中有机相浓度较低，样品溶剂有机相较高），此时样品溶剂扩散速度快，造成样品峰展宽；不论进样体积大还是小，只要流动相溶剂与样品溶剂不一致，基本都会发生这种不必要的展宽，但不一定会分叉；
其二，样品溶液溶剂与流动相组成差别较大时，样品溶液与流动相的混合不能瞬间完成，就会导致“球状”样品溶液由核心到边缘存在浓度差，核心有机相浓度高，向边缘逐渐降低。
进入色谱柱后，边缘部分样品分子随流动相正常移动，而核心分子因溶剂氛围有机相较高，在色谱柱中移动较快，反映在色谱图上就是前延，甚至前分叉。
减小进样体积，柱前可以充分混合，可以消除分叉。
样品及流动相过滤滤器及滤膜选择指南
一.过滤的重要性
由于色谱系统的精密性和对结果分析的准确性要求，对样品的过滤显得尤为重要。
过滤可以保护色谱系统和色谱柱，延长柱子的使用寿命，改善数据的精确度。
过滤可以消除由于摩擦产生颗粒而引起的压力波动和无规律的杂质引起的基线波动。
可以消除由于存在气泡对检测系统的干扰。
因此通常采用微孔滤膜（Membrane）来过滤流动相，使用针头滤器（Filter）来过滤样品。
二.滤膜的相关参数及常识
1.绝对孔径：
绝对孔径等级是指通过在十分严格的测试条件下100%截留下某种特定尺寸的挑战菌来区分孔径。
必须指明的条件里有：
测试有机体（或分子）尺寸及浓度，测试压力和检测法。
2.空气通量:
为测量空气通过滤器之一种方法。
即在不同的压力、不同的孔率和不同滤器面积情况下，空气所流过的流量。
3.气泡点:
在微孔滤膜行业中，使用特定液体浸湿滤膜，并在特定温度下，所须排挤出滤膜孔中液体的最小压力之称。
4.过滤器功效:
过滤器在其特定压力下，以其过滤总量和阻碍微粒大小定义其过滤功效。
一般来说，阻碍程度及压力越低时，过滤器的功效越大。
5.滤材寿命:
在特定操作条件下，过滤器的最长使用时间。
它取决于许多因素，例如过滤液的性质，操作温度，过滤材质的选择等。
6.亲水性:
Hydrophilicity的定义为亲水性，亲水性的滤膜通常有一层特殊化学层使得滤膜可以被水浸润;Hydrophobiity是对水的斥力的一个参考。
疏水性滤膜很少完全不吸水。
在观察上可目视小水液滴停留在滤膜的表面而不会被表面吸附而扩散成水面。
疏水性的大小取决于滤材的孔径和滤膜原料的特性。
7.流率和流量:
流率是在特定温度及压力下单位时间内过滤液通过滤膜的总量。
流率与滤膜表面性质有密切关系。
流率和通量是滤材和设计性能的二个重要参数。
这种性能取决于以下几个方面：
1）粘性:
粘度决定了液体流动的难易。
液体的粘度越高（在一定的温度和压力条件下）流率越低。
而要达到相同流率时所需的压力越高。
2）压力差:
过滤中进口与出口的压力差，当滤器的满负荷时，过滤压力差增大。
3）孔率:
是指滤膜上所有孔的体积占全部滤膜体积的比例。
通常滤膜有50-90%孔面积，流率与膜的孔率有直接的关系。
三.选择滤膜滤头要考虑的因素
微孔滤膜的主要功能是从气相或者液相中截留微粒，细菌及其他杂质，以达到分离，净化，提纯的目的。
因此选择滤膜要考虑以下几个因素：
1.滤膜的材质（化学兼容性）：
选择滤膜时，首先要考虑化学相容性。
滤器是否耐酸、碱、有机溶剂等。
具体参见滤膜化学相容性表。
2.滤膜的孔径：
对于使用3um或更大粒径填料的色谱柱系统，可采用0.45um的针头滤器或滤膜；对于使小于3um填料的色谱系统，或涉及微生物生长的色谱系统，推荐使用0.2um的滤膜。
对于难处理的混浊溶液，可以使用1-5um的滤膜进行预过滤，然后再用相应的滤膜进行续滤。
3.样品的特性：
1）亲水性样品：
选用亲水膜片。
对水有亲和力，适合过滤水为基质的溶液。
可用的滤膜有：
混合纤维素酯，聚醚砜（PEs）,Nylon等。
2）强腐蚀性有机溶剂：
一般采用疏水性膜。
如PTFE，聚丙烯（PP）等材质的滤膜
3）蛋白溶液：
选择低蛋白吸附的滤膜，如PVDF滤膜。
4）离子色谱：
通常认为PEs滤膜比较适合低无机离子的溶液的过滤。
4.选择针头滤器时，除了考虑上述因素外，还要考虑赝品的体积（即选择什么规格的针头式滤器）：
通常样品量小于2ml时，选用4mm直径的微型虑头。
样品量在2-10ml之间，选用13mm直径的虑头，当样品量大于10ml时，选用25mm直径的虑头。
四.几种常用滤膜的特性：
1.尼龙膜（Nylon）
特点：
耐温性能良好，可耐121℃饱和蒸汽热压消毒30min，最高工作温度60℃，化学稳定良好，能耐受稀酸、稀碱、醇类、酯类、油类、碳氢化合物、卤代烃及有机氧化物等多种有机和无机化合物。
用途：
电子、微电子、半导体工业水过滤、组织培养基过滤。
药液过滤、饮料过滤、高纯化学制品过滤。
水溶液和有机流动相的过滤的过滤。
2.聚偏氟乙烯膜（PVDF）
特点：
膜机械强度高、抗张强度高，具有良好的耐热性和化学稳定性，蛋白吸附率低；具有较强的负静电性及疏水性；具有疏水和亲水两种形式。
但不能耐受丙酮，DMSO，THF，DMF，二氯甲烷，氯仿等。
用途：
疏水性聚偏氟乙烯膜主要应用于气体及蒸汽过滤、高温液体的过滤;
亲水性聚偏氟乙烯膜主要应用于组织培养基、添加剂等除菌过滤溶剂和化学原料的净化过滤，试剂的无菌处理，高温液体的过滤等。
3.混合纤维素酯
特点：
孔径比较均匀，孔隙率高，无介质脱落，质地薄，阻力小，滤速快，吸附极小，使用价格成本低，但不耐有机溶液和强酸、强碱溶液。
用途：
医药工业需热压灭菌的水针剂，大输液滤除微粒。
对热敏性药物（胰岛素ATP、辅酶A等生化制剂）的除菌，用0.45微米的滤膜（或0.2）
溶液中微粒及油类不溶物的分析测定，及水质污染指数测定。
应用于体细胞杂交和线粒互补预测杂种优势研究等科研部门。
4.聚丙烯
特点：
无任何粘接剂，化学性能稳定，柔韧，不易破损，耐高温，能经受高压灭菌。
无毒无味，耐酸碱。
用途：
适用于制作各种粗、精滤器，折叠式滤芯。
适用于饮料、医药等行业的板框压滤机滤膜。
适用于反渗透膜，超滤膜的支撑及预处理。
聚丙烯膜无毒性，可在医药、化工、食品、饮料等领域广泛应用；具疏水性，对气体过滤尤佳。
5.聚醚砜（PES）
特点：
醚砜材质的微孔滤膜，属于亲水性滤膜，具有高流率、低溶出物、良好的强度的特点，不吸附蛋白和提取物，对样品五污染。
用途：
低蛋白质吸附及高药物相容性，专为生化、检验、制药以及除菌过滤装置而设计。
6.聚四氟乙烯（PTFE）
特点：
最广泛的化学兼容性，能耐受DMSO，THF，DMF，二氯甲烷，氯仿等强溶剂。
应用：
所有有机溶液的过滤，特别是其它滤膜不能耐受的强溶剂的过滤。
五.各种滤膜溶剂兼容性表
在液相色谱分析过程中，我们经常遇到的问题主要有二种，一种与液相色谱仪器本身因素有关，如液相色谱的阀门、混合器、检测器的光源以及其它的一些硬件设备。
出现这类问题后，如果能找出问题根源，解决起来一般很简单，而且这类问题可以通过对仪器的精心维护来避免；而另一类问题则是分析方法本身造成的问题，如出现色谱峰形状不好、峰与峰之间不能分开、基线飘移等等。
不幸的是，如果出现这类问题，看起来似乎很明显，但是要找出原因并解决这类问题却非常困难。
为了减少出现这一类型的问题，就必须在分析之前，仔细研究并选择一个好的分析方法，有了一个好的分析方法，就很容易获得理想的分离效果，而且在出现问题是也很便于找出原因。
要选择一个好的分析方法，就必须对液相色谱分析的一些基本原则要有一个很深的了解。
下面是我们实验室对色谱分析人员进行技能培训的一些基本知识。
一：
分析方法选择的基本原则
假如你想做一顿丰盛的晚餐，首先必须看一下食谱，然后检查一下你所需的东西是否齐全，如果少了配料还必须去商店购买，这样你才可能做出一顿可口的晚餐。
同样进行液相色谱分析时，也必须按照一定的程序进行，首先你必须要有专门的仪器和试剂，然后有目的地选择分析方法，这样你才可能得到好的分析结果，避免走一些弯路。
二：
柱子的选择
在液相色谱分析方法中最重要的就是色谱柱的选择，色谱分析人员面对几百种色谱柱，你从何入手呢？
我采取的方法就是订阅LCGC亚太版中RonMajors的“色谱柱观察”这一专栏，自１９８４年第一期以来，RonMajors在这一专栏中介绍许多新柱子、色谱柱新技术、色谱柱使用方法等方面的信息。
现在大部分液相色谱分析都是使用反相色谱柱，其中以C18和C８柱最为流行。
然而色谱分析并不是流行歌曲，这两种色谱柱之所以运用广泛是因为在大多数情况下，使用这两种柱子都能获得理想的分离效果。
尽管一些样品的分离并不是这两种柱子（如表一所示），但C18和C８经常是最好的固定相，C18和C８柱两者之间并无明显的差别，但在我们实验室中经常使用的是C８柱。
色谱分析人员遇到的多数样品需要利用反相色谱柱进行分析，但一些样品可能需要其它的分析技术才能成功地分离，这些样品及分离方法在表一中作了简要的叙述，在以后的章节中将进一步阐述。
表一：
样品及分析方法
样品的特性 分析方法及色谱柱
大分子量 专用色谱柱、离子交换柱、size-excusion色谱柱
手性异构体 手性色谱柱
其它异构体（位置、立方体） 正相色谱柱、没有改性的二氧化硅柱
无机盐混合物 离子色谱分析
碳水化合物（糖类） 反相氨基柱、离子交换法
在过去的１５年中，高纯度、低金属杂质含量的硅胶基质色谱柱是最为实用的色谱柱之一。
但传统色谱分析用的硅胶颗粒具有差异性及酸性表面，固定在柱子表面后，导致出现拖尾峰，而且柱与柱之间的重现性较差。
最近硅胶基质中出现一种新的产品，这种硅胶具有Ｍetal-free特性，因此柱子性能更稳定，重现性也更好，分离后峰的形状也很不错。
这种改性后的硅胶称为Ｂ型硅胶。
由于具有上述优点，大多数色谱制造商都用不同的名称来表明它们与传统的产品之间的不同，如Intertsil（日本）、BDS（USA）、YMC--Base（USA）等等。
大多数色谱柱制造商都生产以Ｂ型硅胶为基质的色谱柱，因此你可以选择你所喜欢的供应商提供的产品。
由于这种产品具有上述特性，建议使用Ａ型硅胶柱的改为使用Ｂ硅胶柱。
三：
柱子尺寸规格的选择
液相色谱分析时柱子选择的另一个因素就是柱子大小、及填充颗粒的直径（dp）的选择。
最常用颗粒直径为５μm，但颗粒的直径（dp）为3.0及3.5μm的也适合分析使用，但大多数色谱工作者都喜欢使用颗粒直径为５μm的色谱柱，因为这种色谱柱具有很长的使用历吏。
颗粒的dp小意味着可以获得较高的理论塔板数，但所需的柱压增大，而且dp为3.0μm的色谱柱易堵塞，所以一些色谱制造商又生产出dp为3.5μm的色谱柱。
在我们实验室中经常使用的是150mm×4.6mm，dp为５μm的色谱柱。
另一种可以选择的色谱柱为75mm×4.6mm，dp为3.5μm的柱子，这种柱子的分离效果与前一种色谱柱分离效果相似，但使用时间减小一半。
这两种柱子还有一个优点就是在合理的压力下（＜2000psi），流速可以设定在1.5--2.0ml/min之间，而流速高意味着可以缩短分析时间。
有些分析者建议使用30或50mm长的柱子作为前处理柱，但这种柱子不能提供足够的塔板数。
另一种意见是使用窄径柱（内径2mm）或微径柱（内径≤1mm），这两种柱子所需的溶剂少，但是这两种柱子所需的某些仪器与正常使用的色谱仪有些不同，而且正处在一个研究阶段，建议等这两种色谱柱研究成熟之后再使用。
150mm×4.6mm，dp为５μm的色谱柱最为常用，75mm×4.6mm，dp为3.5μm的色谱柱也中较常见，在一般情况下流速可设定为1.5ml/min。
四:
有机相的选择
获得成功分离的另一个重要因素就是流动相有机溶剂的选择，如果使用反相色谱柱可以有三种有机溶剂可以选择，甲醇、乙腈和四氢呋喃。
每一种溶剂都有其独特的优点，但色谱分析人员很少能预见哪一种溶剂更合适，所以具体选择哪一种溶剂你必须充分考虑同行的意见。
在我的实验室中多数工作分析药物中的成份，其中有些样品的紫外吸收很弱，所以分析时紫外检测器的波长为２２０nm甚至更低，但是四氢呋喃的紫外吸收比较强，所以在波长低于２４０nm时，就不能选择这种溶剂。
尽管低浓度的甲醇在较低的波长下也可使用，但是在低于２２０nm时，甲醇的浓度不易控制。
选择何种溶剂还必须考虑其与样品及空气之间不发生作用，而四氢呋喃易分解，形成过氧化物，所以使用这种溶剂时须格外小心。
一些研究人员发现，在四氢呋喃中加入水可以解决这个问题，但它与色谱柱平衡所需的时间比甲醇、乙腈长，而且其不愉快的气味也是一个不利因素。
与四氢呋喃相比，甲醇和乙腈的最大优点是在柱压较低的条件下，流速可控制在１－２ml/min之间。
考虑到理想溶剂的特点，如粘度低、紫外吸收弱、与样品不相互作用，而且使用方便，所以首选的有机溶剂应是乙腈，当然利用甲醇作为有机溶剂的也较为常见。
五：
水相的选择
假如样品为一般化合物，可以用水作为水相，然而离子化合物在药物分析时普遍存在，而这类化合物需要控制ＰＨ值才能得到很好的分离。
如流动相的ＰＨ值必须高于或低于样品的ＰＫＡ１.５个单位。
在分析有机酸时，当ＰＨ值低于３时，色谱柱一般还比较稳定，然而当ＰＨ值高于８时，就需要缓冲液，因为此ＰＨ值已经超出了二氧化硅的有效使用范围。
宽ＰＨ值的二氧化硅柱也比较常见，但是对高ＰＨ值物质的分离，很少有这方面的报道。
所以建议使用缓冲液来减少二氧化硅的流失。
考虑到样品的特性及柱子的稳定，建议在分析ＰＨ值较高的物质时应使用缓冲液，２.５mM的磷酸盐缓冲液（ＰＨ=２.５）是非常合适的水相。
如果在分析方法中使用了分光仪，那么就必须选择易挥发的缓冲液，尽管不如真正的缓冲液有用，但０.１% Trifluoroacetic酸和乙酸能够满足ＰＨ值的控制要求。
六：
其它的因素
在你选择液相色谱的分析方法时，必须考虑到其它的一些因素，比如温度。
因为温度变化１度，保留时间将变化１－３％，所以温度控制十分重要，温度的变化还影响色谱柱的选择性，这会使你更积极地投入到温度选择中去。
在分析时柱温一般比室温高一点（如３５℃），因为此温易控制，而且在低压下有利于降低溶剂的粘度，从而降低柱压。
有时你需要利用其它的一些方法，如在流动相中加入部分特殊的物质，不过我建议最好在你实在必须时才用这种方法，记住ＫＩＳＳ原则（Keepitsimple，stupid），不要使你的流动相过分复杂！
七：
总结
在液相色谱分析时条件的选择非常重要，而且流动相是你常年与之打交道的，所以你必须慎重选择。
一些较为常见的分析条件见如表二所示。
表二
分 析 条 件 内容
色谱柱大小 150mm×4.6mm，
颗粒 dp为５μm
固定相 C18或C８
流动相 溶剂Ａ、Ｂ水、乙腈Ｂ％可变
缓冲液 ２.５mM的磷酸盐缓冲液
流 速 １--２ml/min
温 度 35℃
梯度洗脱gradientelution
1简介
通常情况下，液相色谱操作中的流动相组成和比例是恒定的，这种洗脱化合物的方式被称为等度洗脱；但是为了改善分析结果，某些操作需要连续改变流动相中各溶剂组分的比例以连续改变流动相的极性，使每个分析组分都有合适的容量因子k，并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离，这种洗脱方式称为梯度洗脱。
2梯度洗脱的应用
梯度洗脱可在下列情形中发挥重要作用：
A在等度下具有较宽k值的多种样品分析。
B大分子样品分析。
C样品含有强保留的干扰物，在目标化合物出峰后设置梯度洗脱，将干扰物洗脱出来，以免其影响下一次分析。
D单组份化合物方法建立时，不知道其洗脱情况，使用梯度洗脱，找出其较优的洗脱条件。
（1）多组分分析时，这些组分往往具有很宽的k值范围。
假如使用等度洗脱，这些化合物的k值无法同时落在1~10之间，结果就是，无法同时得到较好的分离度、较短的分离时间、较高的响应值。
图T1、T2、T3是笔者不同条件下分析邻苯二甲酸酯类化合物得到的色谱图。
图T1 （等度，流动相：
80%乙腈水溶液）
图T2（等度，流动相：
100%乙腈）
图T3（梯度，0-5min，乙腈由70%上升到90%，5-10min乙腈由90%上升到100%，10-18min，乙腈100%）
其他色谱条件：
色谱柱：
DiamonsilC18
（2），250*4.6mm，5μm
流速：
1.0ml/min
检测器：
UV254nm
1邻苯二甲酸二甲酯（DMP）
2邻苯二甲酸二乙酯（DEP）
3邻苯二甲酸二正丙酯（DPrP）
4邻苯二甲酸丁基苄基酯（BBP）
5邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）
6邻苯二甲酸二戊酯（DPP）
7邻苯二甲酸二环己酯（DCHP）
8邻苯二甲酸二己酯（DHP）
9邻苯二甲酸（2-乙基己基）酯（DEHP）
三种洗脱方式对比
条件
最小分离度
分析时间
灵敏度
等度1（T1）
＞4
＞100min
1-9，灵敏度逐渐降低，8和9难以检出
等度2（T2）
＝0.8
11min
1-9，灵敏度逐渐降低，均较高
梯度（T3）
＞3
25min
1-9，灵敏度相差不大，均较高
由该分析案例可知，在多组分分析时，只要能够选出合适的梯度条件，就能够实现“较好的分离度、较短的分离时间、较高的响应值”。
（2）样品溶液中同时含有目标化合物和强保留化合物，目标化合物流出后使用梯度洗脱将强保留化合物洗下来，以避免强保留化合物污染色谱柱或在后续的分析中流出干扰分析。
T4某分析项目末端梯度洗脱以洗掉过剩的衍生试剂（末端梯度：
39-40min，有机相含量由38%升高到80%，保持10min）
由T4可以看出，40min左右，最晚出峰的组分已经被洗下来，然而却把有机相在1min内由38%升高到80%，目的就是为了洗脱衍生反应剩余的衍生试剂（50min处的色谱峰）。
前面的杂质峰为样品基质中的强保留干扰物，末端的梯度洗脱同样也将其洗了下来，这就避免了这些化合物在随后的分析中缓慢流出造成的基线起伏。
（3）当遇到新的化合物需要分析，我们没有文献可以参考，只能初步圈定分析模式（反相、正相等等），此时确定不了等度洗脱的流动相组成和比例，只好借助梯度洗脱。
3梯度洗脱的原理（以反相色谱为例）
梯度洗脱的实质就是，样品随梯度起点的流动相进入色谱柱入口，由于起点流动相中强洗脱溶剂B含量较低，化合物C1（保留性适中）和化合物C2（保留较强）因k值较高而滞留于色谱柱入口附近（几乎未移动）。
一段时间后，B增加到一定数值，C1的k值达到足够小（比如小于10），其在柱中的移动速率明显增大，并且随着B的增加，其移动速率愈加快速，直到tC1时流出色谱柱，被检测器检测到并被记录成色谱峰C1，tC1虽然比等度时的保留时间长很多，但C1的的平均k值却很小，因而色谱峰并未展宽，灵敏度仍处于较高水平。
B持续增加，在随后的某个时间点，C2的k值也降到10以下，C2的移动速率也开始变快，以与C1类似的方式于tC2被洗脱出色谱柱，其平均k值同样很小，色谱峰亦未展宽，灵敏度处于较高水平。
T5梯度洗脱过程中的峰迁移
黑色虚线代表B比例的变化（对应左侧上方纵轴）
红色曲线代表化合物k值随流动相改变而发生的变化（对应右侧纵轴）
绿色曲线代表化合物化合物在柱中的位置变化（对应左侧下方纵轴）
紫色曲线为色谱图
4梯度分离的建立
梯度洗脱可以按下列步骤建立;
A选择初始条件：
色谱柱（类型和规格）、流动相组成、流速、柱温等等
B根据A的分析结果升高起始流动相中的B%并降低结束流动相中的B%，以去除色谱图中第一个峰出现前的和最后一个峰出现后的无意义时间
C当峰分离较差或运行时间过长的时候，应通过调整强洗脱溶剂B、B升高速率或使用分段梯度等方式予以解决
D考察不同仪器对梯度分离的影响。
（1）选择梯
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